白藜芦醇干预对慢性心房纤颤猪心房组织中去乙酰化酶1表达的影响

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1、白藜芦醇干预对慢性心房纤颤猪心房组织中去乙酰化酶1表达的影响 作者：周晓峰，王志荣，张卓琦，张超群，徐晤【摘要】 目的 探讨白藜芦醇(resveratrol，RES)干预对快速右房起搏诱发的慢性心房纤颤(atrial fibrillation，AF)猪心房组织中去乙酰化酶(SIRT)1表达的影响。方法 18头小家猪(雌雄不拘)随机分为3组(n=6)：起搏组(ATP组)、假手术组(sham组)和白藜芦醇干预组(RES组)。采用Seldinger血管穿刺技术穿刺右或左侧颈内静脉送入双极电极至右心房并连接至实验用起搏器(AOO)，快速起搏心房(500次/min)2周(假手术组猪不起搏)制备慢性AF实

2、验模型。RES组猪于起搏前1周开始服用RES(2.5 mgkg-1d-1)。RT-PCR分析SIRT1 mRNA 表达情况，Western blot法检测SIRT1蛋白表达水平的变化。结果 RES组SIRT1 mRNA和蛋白的表达较ATP组和sham组均明显增加(P<0.05)，ATP组稍高于sham组但差异无统计学意义(P>0.05)。结论 RES干预可以明显增强快速起搏右房诱发的慢性AF猪心房组织中SIRT1的表达。 【关键词】 抗氧化剂;心房纤颤;猪Abstract: Objective To investigate the effect of resveratrol int

3、ervention on the expression of SIRT1 in the atrial tissues in pigs with atrial fibrillation (AF) induced by right tachypacing. Methods 18 pigs of both genders were randomized into 3 groups: atrial tachypacing (ATP) group (n=6), resveratrol-intervened (RES) group (n=6) and sham group (n=6). A bipolar

4、 electrode was inserted through the left or right internal jugular vein into the right atrial (RA) appendage using Seldinger technique, and was connected to experimental pacemakers (AOO) in subcutaneous pockets in the neck. The pigs in ATP group and RES group were paced at 500 beats per minute for 2

5、 weeks to establish AF models. Resveratrol (2.5 mgkg-1d-1) was given orally in 3 divided doses, 7 days prior to ATP onset and continued till the morning of the final open-chest experiment. The expression of SIRT1 mRNA was detected by RT-RCR and the variations in the level of SIRT1 protein expression

6、 was determined by Western blot. Results The expression of SIRT1 mRNA and protein in the RES group was markedly higher than that in ATP group and the sham group (P<0.05); and the expression of SIRT1 mRNA and protein in the ATP group was slightly higher than that in the sham group, but the differe

7、nce had no statistical significance (P>0.05). Conclusion Resveratrol intervention can significantly enhance the expression of SIRT1 in the atrial tissues in pigs with chronic AF induced by right rapid pacing.Key words: antioxidants; atrial fibrillation; pigs心房纤颤(atrial fibrillation，AF)是临床常见的心律失常。

8、心房肌的电重构和结构重构是AF发生发展与维持的重要基础，其既是AF发生发展的结果，又是AF发生与维持的原因1。大量研究已经证实AF的电重构和结构重构的发生与机体的氧化、炎症及氧化应激的活化与增强有关2-4。白藜芦醇(resveratrol,RES)是广泛存在于葡萄酒、水果、中药中的一种植物抗毒素和抗氧化剂，大量研究表明RES可以活化各种生物体内的去乙酰化酶(SIRT)1从而使SIRT1发挥保护机体、抵抗各种应激及炎症反应的作用，是目前发现的最好的天然SIRT1激活剂5-6。本课题组前期工作已经证实，快速起搏右心房可以成功制备猪的慢性AF模型;RES干预可以明显抑制快速起搏右心房诱发的慢性AF猪

9、心房结构重构和电重构，减少AF的发生，但作用的分子机制还不清楚，可能与SIRT1有关。本研究利用快速起搏右心房来制备慢性AF模型，观察RES干预对快速起搏右心房诱发的慢性AF猪心房组织中SIRT1表达的影响。1 材料和方法1.1 主要材料与试剂 实验动物由徐州医学院实验动物中心提供。AOO型实验用埋藏式起搏器由南京医科大学提供。主要试剂：Masson三色染色试剂盒购自南京建成生物工程有限公司。白藜芦醇购自湖南华光生物有限责任公司。兔抗鼠SIRT1多克隆抗体购自美国Cell Signaling Technology公司。生物素标记的羊抗兔IgG二抗由徐州医学院神经生物学研究中心提供。总RNA提取

10、试剂盒及RT-PCR一步法试剂盒购自Promega公司。聚合酶链反应(PCR)引物由上海生工生物工程技术有限公司合成，引物序列：GAPDH正向5-ATTCCACGGCACAGTCAA-3，反向5-CATCACGCCACAGTTTCC-3;SIRT1正向 5-TGTCAGAATTACCACCCA -3，反向 5-TTACCATCAAGCCGTTTA-3。1.2 方法1.2.1 模型的制备 18头健康小家猪体重为(37.42.5)kg，年龄23个月，随机分为3组(n=6)：起搏组(ATP组)、假手术组(sham组)和白藜芦醇干预组(RES组)。采用3%戊巴比妥1 ml/kg肌内注射麻醉，固定四肢，

11、置于导管床上，四肢连接心电图机。采用Seldinger血管穿刺技术穿刺右侧颈内静脉，经鞘管送入四极标测电极导管至右心房，测定心房有效不应期后，采用Burst刺激诱发房颤，记录AF持续时间。切开右侧颈部皮肤，分离皮下组织做囊袋，换用8F可撕开鞘管，X线透射下送入“J”形心房电极导管，电极头端固定在右心耳，测量起搏参数满意后，连接实验用埋藏式体外磁铁控制的高频心脏起搏器，并埋于颈部皮下。术中及术后4天每日给予头孢唑啉钠3.0 g肌内注射，起搏器的起搏方式为AOO型，起搏频率为500次/min，持续起搏2周，每周记录一次标准肢体导联心电图以检查起搏状态及心电图改变。假手术组只进行电生理检查，不予起搏

12、。RES组术前1周给予RES(2.5 mgkg-1d-1)喂养，直到起搏2周后，起搏器的安置同起搏组。1.2.2 Western-blot检测各组心房组织中SIRT1表达的变化 起搏2周后，3%戊巴比妥1 ml/kg肌内注射麻醉，关闭起搏器，待恢复窦律后重复电生理检查，然后处死动物，取出心脏，快速取左右心房组织放入-80冰箱冻存。机械匀浆，4 1 000 g15 min离心(提取核蛋白时,弃上清,加buffer A于沉淀中混匀, 4 10 000 g15 min离心，弃上清, 加buffer B于沉淀中4摇床30 min，4 12 000 g15 min离心)，取上清液置于-80保存备用。留取

13、10 l 上清液用酚试剂法测蛋白浓度。按常规方法进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，200 mA转膜(NC膜)，取出NC膜，加入5%脱脂奶粉封闭液中置摇床轻轻摇动封闭2 h，置于兔抗鼠一抗(用封闭液11000 稀释)中，4冰箱中过夜，Washing buffer清洗5 min3遍，加入稀释好的二抗，置摇床上摇2 h，用Washing buffer清洗5 min3遍，双蒸水洗5 min。10 ml AP底物缓冲液中先后加入66 ml NBT和33 ml BCIP(现配现用)，将清洗好的NC膜放入AP显色液中，摇床上边摇边观察显色情况，可见棕黑色的条带。取出NC膜，避光晾干

14、，将条带扫描入电脑，用Image J软件分析灰度值。1.2.3 RT-PCR法检测各组心房组织中SIRT1 mRNA 表达的变化 总RNA 提取、cDNA 合成及PCR 反应体系按照试剂盒操作步骤操作。PCR 反应条件：94 预变性3 min，然后按94 变性30 s、58 退火30 s、72 延伸1 min循环35 次，最后72 延伸6 min。扩增完成后取5 l PCR产物加1 l 6DNA loading buffer，60 V电泳。于UVP图像处理仪中进行摄片。用Image J软件分析条带。1.3 统计学处理 计量资料以s表示，组间比较采用单因素方差分析(ANONA)，q检验(SNK)

15、法进行组间均数的两两比较， P<0.05表示差异有统计学意义。2 结 果2.1 RES干预对SIRT1蛋白表达的影响 采用Western blot法检测各组左右心房组织中SIRT1蛋白表达的变化，其中RES组SIRT1蛋白表达最高。RES组与ATP组和sham组比较，SIRT1蛋白表达明显增强(P<0.05);ATP组SIRT1蛋白表达稍高于sham组，但差异无统计学意义(P>0.05)(图1)。各组左心房组织的SIRT1蛋白表达略高于右心房组织，但差异无统计学意义(P>0.05)。2.2 RES干预对SIRT1 mRNA表达的影响 采用RT-PCR一步法检测各组左右心

16、房组织中SIRT1 mRNA表达的变化，其中RES组中左右心房SIRT1 mRNA表达量最高。RES组与ATP组和sham组比较，SIRT1 mRNA表达显著增高(P<0.05);ATP组SIRT1 mRNA表达略高于sham组，但差异无统计学意义(P>0.05)(图2)。各组左心房组织中SIRT1 mRNA 表达比右心房略高，但差异无统计学意义(P>0.05)。3 讨 论Sir2(silent information regulator 2)是在研究酵母菌转录沉默时发现的一个广泛存在于各种物种的基因，在转录沉默、染色质稳定、双链DNA断裂损伤后生理修复以及延长细胞周期中起重

17、要作用，具有组蛋白去乙酰化酶活性。从古细菌到真核生物，Sir2均具有高度保守性。在哺乳动物共有7个Sir2同源基因，分别命名为SIRT 17，其中SIRT1和酵母Sir2同源性最高，目前也被研究得最多5。而目前大量的研究表明SIRT1对炎症、氧化及应激情况下的心肌细胞活力及寿命具有调节作用并对与炎症、氧化应激有关的心血管疾病也具有重要的保护作用7;因此在与炎症及氧化应激有关的心血管疾病众多保护因子中，SIRT1是极具吸引力的候选因子。白藜芦醇是一种广泛存在于葡萄、花生、中药虎杖等70多种植物和人类食物中的多酚类植物雌激素(或称植物抗毒素)，大量的研究证实，无论在活体内还是活体外，无论是低等动物

18、还是哺乳动物，RES是SIRT1的重要活化物5-6。目前大量的研究证实SIRT1的高表达可以提高抗炎及抗氧化应激反应的能力从而达到心血管保护的作用7。本课题组前期工作已经证实， RES干预可以明显抑制快速起搏右心房诱发的慢性AF猪心房结构重构和电重构，减少AF的发生，但作用的分子机制还不清楚，可能与SIRT1有关系。本课题利用快速起搏右心房来制备慢性AF模型，观察RES干预对快速起搏右心房诱发的慢性AF猪心房组织中SIRT1表达的影响及SIRT1在AF时心房组织中的表达情况。结果发现，RES干预可以明显增强快速起搏右心房诱发的慢性AF猪心房组织中SIRT1的表达，而SIRT1在AF时心房组织中

19、的表达稍高于sham组，但差异无统计学意义，估计AF时氧化应激条件使SIRT1表达上调量不足以发挥心脏保护作用，只有当RES充分激活快速右心房起搏猪的心房组织中SIRT1的表达时才足以抑制心脏重塑引起的心房重构从而减少AF的发生。但SIRT1的高表达对AF作用的具体分子机制还不清楚，本课题组将进一步深入研究。【参考文献】 1 郑良荣,王利宏.房颤的电生理重构M沈法荣.现代心脏起搏治疗学.上海:上海科学技术出版社, 2004:148-153.2 Mihm MJ, Yu F, Carnes CA, et al. Impaired myofibrillar energetics and oxidat

20、ive injury during human atrial fibrillation J. Circulation，2001，104(2):174-180.3 Leftheriotis DI, Fountoulaki KT, Flevari PG, et al. The predictive value of inflammatory and oxidative markers following the successful cardioversion of persistent lone atrial fibrillation J. Int J Cardiol，2009，135(3):3

21、61-369.4 Watanabe T, Takeishi Y, Hirono O, et al. C-reactive protein elevation predicts the occurrence of atrial structural remodeling in patients with paroxysmal atrial fibrillation J.Heart Vessels，2005，20(2):45-49.5 Borra MT, Smith BC, Denu JM. Mechanism of human SIRT1 activation by resveratrol J.

22、J Biol Chem，2005，280(17):17187-17195.6 Howitz KT, Bitterman KJ, Cohen HY, et al. Small molecule activators of sirtuins extend Saccharomyces cerevisiae lifespan J. Nature，2003，425(6954):191-196.7 Yoshida Y, Shioi T, Izumi T. Resveratrol ameliorates experimental autoimmune myocarditis J. Circ J，2007，71(3):397-404.文档可自由编辑打印