湿热灭菌工艺的微生物学验证王彦忠可编辑

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1、湿热灭菌工艺的微生物学验证-王彦忠2011 湿热灭菌工艺的微生物学验证 201108 王彦忠 Reported by Wang Yanzhong Global Manufacturing and Supply Page 1 201108 内容介绍 1 法规对无菌制剂湿热灭菌工艺验证的要求 2 微生物灭菌的专业知识 3 湿热灭菌工艺微生物学验证的方法 Reported by Wang Yanzhong Global Manufacturing and Supply Page 2 201108 一法规对无菌制剂湿热灭 菌工艺验证的要求 Reported by Wang Yanzhong Globa

2、l Manufacturing and Supply Page 3 201108 10版GMP 欧盟GMP 第一条 无菌药品是指法定药品标准中列有无菌检查项目 的制剂和原料药包括无菌制剂及无菌原料药 第二章 原则 第三条 无菌药品的生产须满足其质量和预定用途的要求 应当最大限度降低微生物各种微粒和热原的污染生产 人员的技能所接受的培训及其工作态度是达到上述目标 的关键因素无菌药品的生产必须严格按照精心设计并经 验证的方法及规程进行产品的无菌或其它质量特性绝不 能只依赖于任何形式的最终处理或成品检验包括无菌检 查 Reported by Wang Yanzhong Global Manufact

3、uring and Supply Page 4 201108 10版GMP 欧盟GMP 第四条 无菌药品按生产工艺可分为两类采用最终 灭菌工艺的为最终灭菌产品部分或全部工序采用无 菌生产工艺的为非最终灭菌产品 第十二章 灭菌方法 第七十条 热力灭菌通常有湿热灭菌和干热灭菌应当 符合以下要求 一在验证和生产过程中用于监测或记录的温 度探头与用于控制的温度探头应当分别设置设置 的位置应当通过验证确定每次灭菌均应记录灭菌 过程的时间-温度曲线 Reported by Wang Yanzhong Global Manufacturing and Supply Page 5 201108 10版GMP

4、欧盟GMP 采用自控和监测系统的应当经过验证保证符合 关键工艺的要求自控和监测系统应当能够记录系 统以及工艺运行过程中出现的故障并有操作人员 监控应当定期将独立的温度显示器的读数与灭菌 过程中记录获得的图谱进行对照 二可使用化学或生物指示剂监控灭菌工艺但 不得替代物理测试 三应当监测每种装载方式所需升温时间且从 所有被灭菌产品或物品达到设定的灭菌温度后开始 计算灭菌时间 Reported by Wang Yanzhong Global Manufacturing and Supply Page 6 201108 10版GMP 欧盟GMP 四应当有措施防止已灭菌产品或物品在冷却过程 中被污染除非

5、能证明生产过程中可剔除任何渗漏的 产品或物品任何与产品或物品相接触的冷却用介质 液体或气体应当经过灭菌或除菌处理 第七十一条 湿热灭菌应当符合以下要求 一湿热灭菌工艺监测的参数应当包括灭菌时间 温度或压力 腔室底部装有排水口的灭菌柜必要时应当测定并 记录该点在灭菌全过程中的温度数据灭菌工艺中 包括抽真空操作的应当定期对腔室作检漏测试 Reported by Wang Yanzhong Global Manufacturing and Supply Page 7 201108 10版GMP 欧盟GMP 二除已密封的产品外被灭菌物品应当用合适的 材料适当包扎所用材料及包扎方式应当有利于空气 排放蒸

6、汽穿透并在灭菌后能防止污染在规定的温 度和时间内被灭菌物品所有部位均应与灭菌介质充 分接触 Reported by Wang Yanzhong Global Manufacturing and Supply Page 8 201108 二微生物灭菌的专业知识 Reported by Wang Yanzhong Global Manufacturing and Supply Page 9 201108 无菌从定义上来说是一个绝对的概念但遗 憾的是在科学和技术高度发展的今天药品的 绝对无菌是做不到的也无法加以证实然而 无菌制剂的安全性要求人们设定无菌的相对标准 FDA欧洲制药工业界曾将百万分之一微

7、生物污 染率作为灭菌产品无菌的相对标准它和蒸 汽灭菌后产品中微生物存活的概率为10-6 即产品 的无菌保证值为6 系同一标准的不同表示法 这一标准于1980起收录于USP 中如今已为世界 各国普遍接受和采用 Reported by Wang Yanzhong Global Manufacturing and Supply Page 10 201108 无菌检查 基本定义检查要求无菌的药品医疗器具原料 辅料以及要求无菌的其他物品是否染有活菌的一 种方法 符合无菌检查法的规定仅表明了供试品在该检验条 件下未发现细菌和真菌污染 无菌检查法是建立在批产品受微生物污染是均匀的 假设上即使该批产品的污染非

8、常均匀检出低污 染的概率也是极低的因此无菌检查存在风险和 局限性应尽量抽取批产品生产开始结束或生产 过程出现异常情况下的产品进行检查 Reported by Wang Yanzhong Global Manufacturing and Supply Page 11 201108 药品生产中的污染来源 人员 在100级洁净区或万级背景下的局部100级洁净区人是 无菌药品生产中的主要污染源即使在管理比较到位 生产设备自动化程度较好操作人员素质较高的企业 人员操作所致的污染率也超过70 水源性微生物 绝大多数为革兰氏阴性菌不会形成芽孢不耐热其 代谢产物及细胞的尸体及碎片均属细胞内毒素的污染源 空气中

9、的微生物基本为革兰氏阳性菌有可能会形成芽 孢使其耐热性增大 Reported by Wang Yanzhong Global Manufacturing and Supply Page 12 201108 无菌检查的局限性 无菌的定义 理论上无菌没有任何活的微生物 实际上我们无法证明产品中没有活微生物存在 无法对整批产品进行100检验 无菌检验的结果只是一个基于可能性的判断 无菌检验用培养基有其局限性 对实验结果的判定是基于是否在培养基中生长 培养条件如温度和时间是有限的 我们的工作环境及操作是在相对无菌的状态 Reported by Wang Yanzhong Global Manufact

10、uring and Supply Page 13 201108 无菌保证工艺 无菌保证工艺即使产品达到规定的无菌保证水平的 工艺过程无菌保证工艺可分为两大类最终灭菌工 艺terminal sterilization process 和非最终菌生产工 艺 aseptic processing 最终灭菌工艺系指将完成最终密封的产品进行灭菌 以杀灭产品中的微生物的工艺由此生产的无菌制剂 称为最终灭菌无菌药品我国和国际主要药典规定通 过最终灭菌使这类药品中污染的微生物残存概率下降 致不高于10-6 的水平以SAL10-6表示应通过灭菌 工艺验证确认已灭菌产品的无菌保证水平 Reported by Wa

11、ng Yanzhong Global Manufacturing and Supply Page 14 201108 无菌保证工艺续 非最终灭菌工艺系指在无菌环境条件下通过无菌操 作生产无菌产品的方法具体就是将组成药品的原 料和包装材料分别灭菌或经除菌处理在无菌条件 下将其组装成成品的工艺经该工艺生产的无菌制 剂称为非最终灭菌的无菌药品世界卫生组织欧 盟以及美国FDA等对非最终灭菌的无菌药品的无菌 保证水平分别作出了规定目前WHO 欧盟和我国 送审稿GMP执行的标准是95可信限下微生物残存 概率不超过01大致相当于3000瓶产品中不得有 1瓶染菌的水平美国FDA的标准要求更为严格通 俗的表达为

12、5000瓶产品中不得有瓶染菌必须通 过培养基灌装模拟试验来验证生产工艺能达到上述 标准 Reported by Wang Yanzhong Global Manufacturing and Supply Page 15 201108 灭菌的基本原理 1微生物死亡动力学 将微生物杀灭的灭菌法的基本原理都是使细胞内的蛋白质 或核酸发生不可逆的凝固或破坏使微生物死亡因此 各种灭菌方法使微生物死亡的速度都符合一级动力学方程 以湿热灭菌为例在特定灭菌温度下某种微生物孢子的 死亡速度仅与这个时刻孢子的浓度有关用数学模型可表 示为lgN lgN -kt 0 N 产品内微生物的残存数 N0 灭菌开始时产品内微

13、生物数 t 累计灭菌时间 k 常数与微生物耐热性灭菌温度相关 Reported by Wang Yanzhong Global Manufacturing and Supply Page 16 201108 灭菌的基本原理续 2 微生物的耐热参数 微生物的耐热参数简称D值是指在特定灭菌条件下 使微生物数量下降一个对数单位或杀灭90 所需的时间 分钟对湿热灭菌工艺而言特定灭菌条件即指灭菌 温度对于某些孢子如嗜热脂肪芽孢杆菌在生理盐水 中121的湿热灭菌条件下D值超过1分钟微生物孢 子的D值与孢子存在的环境密切相关由于微生物变异 的概率较高同一种孢子的不同来源菌株和制备批次其 D值有可能不同 Re

14、ported by Wang Yanzhong Global Manufacturing and Supply Page 17 201108 灭菌的基本原理续 Reported by Wang Yanzhong Global Manufacturing and Supply Page 18 201108 灭菌的基本原理续 3 灭菌率 灭菌率L是表示不同灭菌温度所对应的灭菌效果的重要 函数灭菌温度为T时的灭菌效果与121下同样灭 菌时间的灭菌效果可通过以下公式进行换算 灭菌率L 10 T-121 Z 下表给出了湿热灭菌中以121为标准灭菌时间Z 10时不同温度下的灭菌率 Reported by

15、Wang Yanzhong Global Manufacturing and Supply Page 19 201108 灭菌的基本原理续 如表所示以121为标准灭菌率定为100时110 下的灭菌率为008即110下同样灭菌时间的灭菌效 果仅为121时的8 相应的121灭菌1分钟对微 生物的杀灭效果相当于在110下灭菌125分钟的杀 灭效果当以流通蒸汽100灭菌时若要达到同 样杀灭效果则需要灭菌125分钟 Reported by Wang Yanzhong Global Manufacturing and Supply Page 20 201108 灭菌的基本原理续 4 标准灭菌时间 标准灭菌

16、时间即F 值是指在121下的灭菌时间它 0 的意义在于将不同灭菌温度下的灭菌工艺按照灭菌 效果等效的原则换算为121下灭菌所需要的时间 F0 L t F0 标准灭菌时间 L 特定灭菌温度下的灭菌率 t 灭菌时间 Reported by Wang Yanzhong Global Manufacturing and Supply Page 21 201108 灭菌的基本原理续 如110下灭菌30分钟的F 值计算110的灭菌率 0 为008F 008 30 24分钟即110下灭菌 0 30分钟相当于121下灭菌24分钟 F 值是衡量区分无菌保证工艺属于最终灭菌工艺 0 还是非最终灭菌工艺的重要指标美

17、国FDA和欧盟 习惯上都将灭菌F 值是否8分钟视为区别最终灭 菌工艺和非最终灭菌生产工艺的标志 更准确地区分最终灭菌无菌药品和非最终灭菌无菌 药品的标准是看该产品的无菌保证水平是否达到 10-6 Reported by Wang Yanzhong Global Manufacturing and Supply Page 22 201108 灭菌的基本原理续 5 无菌保证水平 了解了微生物死亡动力学和灭菌工艺的基本概念后就可 以通过计算得到某批产品的无菌保证水平 lgSAL lgN - F D 0 0 我国和国际主要药典规定最终灭菌工艺生产的药品的 SAL10-6 残存微生物的概率越低无菌保证的

18、风险越 低 无菌保证水平与标准灭菌时间F 灭菌开始时产品中 0 的污染微生物总数N 和污染微生物的耐热参数D 0 密切相关该公式是确定灭菌工艺的最重要的理论基础 Reported by Wang Yanzhong Global Manufacturing and Supply Page 23 201108 灭菌的基本原理续 假定灭菌开始时产品中的污染微生物总数N 为 0 100cfu瓶污染微生物的耐热参数D为1分钟要 达到无菌保证值不小于6的标准灭菌F 值至少应达到 0 F lgN -lgSALD lg10061 8分钟也 0 0 说是需在121下灭菌8分钟 同样的产品如果要在110下灭菌则相

19、应的灭菌时 间应为t F0 L110 8 008 100分钟即需在 110下灭菌100分钟才能达到药典规定的SAL10-6 的标 准 Reported by Wang Yanzhong Global Manufacturing and Supply Page 24 201108 灭菌的基本原理续 若某复方氨基酸注射液采用11030分钟的灭菌程序 起始污染微生物仍为100cfu瓶D值为1分钟则 lgSAL lgN - F D lg100- L110 tD 2- 0 0 008 301 -04SAL 10-04 0398即残存微生物的 概率为0398 美国药典根据灭菌工艺提供的F 值最终灭菌工艺进

20、一 0 步分为残存概率灭菌和过度杀灭灭菌工艺 Reported by Wang Yanzhong Global Manufacturing and Supply Page 25 201108 灭菌的基本原理续 残存概率灭菌工艺 美国药典定义的残存概率灭菌工艺指F 值8分钟但 0 12分钟的湿热灭菌程序适用于热稳定性不很好的产 品如复方氨基酸注射液脂肪乳注射液葡萄糖注射 液和含维生素等的小容量注射液对残存概率灭菌工艺 而言产品灭菌前污染微生物量bioburden及污染微 生物的耐热性是确定灭菌工艺是否提供足够无菌保证水 平的关键因素因此生产工艺过程应当将避免产品被 耐热菌污染放在首位而不是仅依赖

21、最终灭菌过程杀死 污染微生物 Reported by Wang Yanzhong Global Manufacturing and Supply Page 26 201108 灭菌的基本原理续 同时残存概率灭菌工艺对 灭菌设备的热分布均匀性要 求较高对灭菌程序工艺参 数控制的准确度也要求较高 需要对灭菌过程作精确的控 制总之残存概率灭菌工 艺应从灭菌前微生物污染控 制和灭菌过程控制两方面入 手使得在灭菌F 值较低的 0 情况下也能确保达到药典规 定的无菌保证水平 Reported by Wang Yanzhong Global Manufacturing and Supply Page 27

22、201108 灭菌的基本原理续 过度杀灭灭菌工艺 过度杀灭工艺是指F 值12分钟的灭菌工艺热稳 0 定性很好的产品如生理盐水以及包装材料和生产设 备等的灭菌通常采用过度杀灭工艺采用过度杀 灭灭菌工艺时即使不考虑产品灭菌前的污染状况 也能保证无菌保证水平10-6 而且灭菌程序参数 的宽容度相对较大对灭菌设备的热分布及灭菌过 程控制精确度相对于残存概率灭菌工艺的要求较低 当然这并不意味着生产过程中对污染可以完全不 加控制从控制细菌内毒素污染的角度也应当遵 循工艺卫生规范控制产品的微生物污染 Reported by Wang Yanzhong Global Manufacturing and Sup

23、ply Page 28 201108 灭菌方法的选择 无菌保证工艺选择的原则是应优先选择无菌保证水平高 的最终灭菌工艺只有在经充分的工艺研究证明产品无法 耐受各种最终灭菌工艺而且临床确实需要该注射剂的前 提下才能选择非最终灭菌工艺欧盟欧洲药品评价局 EMEA 在其规范性文件 选择灭菌方法决策树中将水 溶性药品无菌保证工艺分为 1 灭菌条件为12115分钟的湿热灭菌工艺 2 灭菌F 值 分钟SAL10-6 的湿热灭菌工艺 0 3 采用微生物截留过滤器的除菌过滤工艺 4 需要采用无菌原料和预先灭菌的包装材料进行无菌配制 和灌装的工艺 Reported by Wang Yanzhong Global

24、 Manufacturing and Supply Page 29 201108 灭菌方法的选择 能否采用121 15分钟湿热灭菌 否 是 能否采用F 8的湿热灭菌 12115分 0 -6 以达到SAL10 钟湿热灭菌 否 是 能否对药液 除菌过滤 采用F08 的 湿热灭菌 是 否 以 达 到 -6 SAL10 无菌原料无 菌配制 药液除菌过 无菌灌封 滤及无菌灌 封 Reported by Wang Yanzhong Global Manufacturing and Supply Page 30 201108 三湿热灭菌工艺微生物学验证的 方法 Reported by Wang Yanzho

25、ng Global Manufacturing and Supply Page 31 201108 工艺验证的目的 一般理化项目如含量pH相对密度等均可以用 数值表述其变化通常是连续的过程即可以从 少量样品的结果可靠地推测出整体的结果与理 化检验相对应的无菌检查其结果只有阳性或阴 性两种状态因此从少量样品的结果推测整体 的结果存在很大的限制即基于抽样检验的无菌 检查存在明显的局限性 Reported by Wang Yanzhong Global Manufacturing and Supply Page 32 201108 湿热灭菌工艺验证的前提 在进行湿热灭菌工艺验证前必须满足下列条件 1

26、 设备的安装确认运行确认和性能确认已经完成 2 相关的SOP已经生效 3 关键工艺参数关键质量属性和关键工艺步骤已经批 准 4 相关批记录已经生效 5 设备的空载满载热分布已经成功完成冷点已经确 定 Reported by Wang Yanzhong Global Manufacturing and Supply Page 33 201108 湿热灭菌工艺验证的前提续 6 真空泄漏和保压测试已经成功完成 7 湿热灭菌程序和参数已经确定 8 相关仪表的校验已经完成 Reported by Wang Yanzhong Global Manufacturing and Supply Page 34

27、201108 通常验证方案包括以下内容 1最大和最小装载条件下的热穿透试验 应根据满载热分布试验的结果制定热穿透试验方案 热穿透试验的目的是获取不同位置的产品在灭菌过 程中实际达到的温度和F 值从而了解不同位置的 0 产品之间以及与日常生产运行时灭菌设备记录的 温度和F 值之间的差异 0 应至少进行最大和最小装载条件下的热穿透试验 有多种装量规格的产品时应至少分别进行最小和 最大装量规格产品的热穿透试验 Reported by Wang Yanzhong Global Manufacturing and Supply Page 35 201108 通常验证方案包括以下内容续 应科学合理地制定热

28、穿透试验计划以获取足够的数 据判断不同位置的产品的热穿透结果是否存在显著性 差异一个灭菌工艺的热穿透试验应至少连续运行三 次灭菌程序以证明其重现性通常若满载热分布试验 中发现有冷点或热点应重点采集该位置的热穿透数 据 试验方案应详细说明验证使用的温度传感器的数量及 其分布方式装载的形式试验采用真实产品还是模 拟产品各项试验运行灭菌程序的次数如果使用模 拟产品应有数据证明模拟产品和真实产品间没有热 穿透差异 Reported by Wang Yanzhong Global Manufacturing and Supply Page 36 201108 通常验证方案包括以下内容续 热穿透试验F 值

29、的平均值加减3倍F 值的标准偏差 0 0 应在该产品灭菌工艺F 值的允许范围内例如85 0 F0 平均-3STD F0 平均3STD165分钟 使用同型号的多台灭菌设备时如果安装确认运 行确认空载热分布的试验和满载热分布试验表明 多台灭菌设备间没有显著性差异则可以合理减少 每台灭菌设备的试验次数应通过风险分析说明减 少试验次数的合理性 Reported by Wang Yanzhong Global Manufacturing and Supply Page 37 201108 通常验证方案包括以下内容续 2 微生物挑战试验 通过微生物挑战试验应能证明拟定的灭菌工艺参数 允许的最差灭菌条件下通过该灭菌工艺能将符合 预定的灭菌前污染微生物数量和耐热性限度的产品 中的微生物杀灭至存活概率不超过百万分之一 对于最低灭菌F 值不小于12分钟的灭菌工艺即过 0 度杀灭灭菌工艺且已通过热穿透试验证明其最 低F 值可不进行微生物挑战试验 0 对于最低灭菌F 值小于12分钟的灭菌工艺即残存 0 概率灭菌工艺应进行微生物挑战试验 Reported by Wang Yanzhong Global Manufacturing and Supply Page 38 201108 通常验证方案包括以下内容续 生物指示剂 可通过采购或自行制备适宜的生物指示剂详见