1038.利用MTT法测定5氟尿嘧啶对Hela细胞增殖的抑制效果

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1、利用MTT法测定5-氟尿嘧啶对Hela细胞增殖的抑制效果摘要：目的：研究5-氟尿嘧啶对Hela细胞增殖的抑制效果。方法：应用MTT法分析不同浓度的5-氟尿嘧啶（5-Fu）对Hela细胞增殖的抑制效果。结果：随着5-氟尿嘧啶浓度的逐渐增加，OD值逐渐减小；由细胞增殖抑制率计算公式可以得出不同浓度的5-氟尿嘧啶对Hala细胞的增殖抑制率分别为：-63.09、-70.74、-74.50、-76.78。结论： OD值的变化间接的表明5-氟尿嘧啶对Hala细胞增殖确实有抑制作用，抑制的效果为：50 ug/ml100ug/ml200 ug/ml400ug/ml；随着5-氟尿嘧啶浓度的增大，细胞增殖抑制率随

2、之增高。关键词：MTT法 5-氟尿嘧啶 Hela细胞 增殖抑制 使用任何抗肿瘤药物都有的潜在风险,理想的抗肿瘤药物应是确保对正常组织起选择性保护作用,又能最大限度的杀死癌细胞，目前研究表明，5-氟尿嘧啶对正常组织的保护作用是肯定的,但是对于肿瘤细胞的抑制作用尚不能完全确定。为此进行本次实验以检测不同浓度5-氟尿嘧啶对癌细胞的抑制效果。1.实验原理1.1 MTT法作用原理MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，汉语化学名为 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝

3、。是一种黄颜色的染料。MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色（或蓝色）结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中；在通常情况下，甲臜生成量与活细胞数成正比。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，因此用酶联免疫检测仪在490nm或570nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。由于死细胞中不含琥珀酸脱氢酶，因此加入MTT 不会有反应。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。 MTT法只能用来检测细胞相对数和相对

4、活力，但不能测定细胞绝对数。在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。同时，利用已知浓度细胞培养后的吸光度可以生成细胞生长趋势曲线，通过该曲线可推测出某一未知浓度细胞的原始接种浓度。1.2 5-氟尿嘧啶抑制癌细胞生长原理恶性肿瘤患者由于肿瘤细胞无止境地分裂、增殖而不断地消耗宿主的营养物质，以及宿主因荷瘤状态所存在的代谢紊乱，机体常存在不同程度的营养不良，严重者导致恶液质，体质下降。5-氟尿嘧啶能够抑制癌移植瘤的生长并诱导瘤细胞的凋亡。5-氟尿嘧啶能选择性地攻击DNA碱基的氮原子，特别是鸟嘌呤的第7位氮原子，和胞嘧啶的第3位氮原子结合。由于和DNA

5、呈交叉联接，对DNA的构型有明显影响，使双螺旋解旋使分子变短；可与DNA形成链内交联，也可形成链间交联或DNA-蛋白质间的交叉联结，由于其可使DNA的模板作用失活，从而抑制DNA合成而抑制肿瘤的生长。2.实验材料和方法2.1 实验材料海拉细胞系（HeLa cell line）是生物学与医学研究中使用的源自一位名叫Henrietta Lacks美国妇女的子宫颈癌细胞的细胞系。这名美国妇女在1951年死于该癌症。为了让Lacks保持匿名，此细胞株原宣称是依“Helen Lane”命名。海拉细胞系被视为“不死的”（即不同于其它一般的人类细胞，此细胞株不会衰老致死，并可以无限分裂下去），至今都被不间断

6、的培养。此细胞系跟其它癌细胞相比，增殖异常迅速。海拉细胞系是被人类乳突状瘤病毒第18型（Human Papillomavirus 18）转化的，和正常子宫颈细胞有许多不同。是一种典型的抗肿瘤药物研究材料。2.2接种收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，使细胞浓度为23104/ml，每孔加入细胞悬液200l，使每孔内的细胞数为4000- 6000个。2.3 培养与药物处理培养箱内培养2436h，吸出培养液加入不同浓度梯度（50ug/ml、100ug/ml、200ug/ml、400ug/ml）的5-氟尿嘧啶各200 l，每个浓度接种4孔作为重复实验，以提高实验数据的准确性。同时，设置一个调零孔（培养基

7、、MTT、二甲基亚砜），和一个对照孔（细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜），为后面的实验做好准备。2.4 呈色培养箱内继续培养到第3天，于倒置显微镜下观察细胞生长情况后，每孔加5 mg/ml的MTT溶液20 l，继续孵育4 h，终止培养；快速翻转培养板，弃去孔内培养上清液；然后每孔加DMSO 150l，振荡30min，使结晶物充分融解。2.5 比色选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。2.6 计算与分析按照公式计算各种药物处理对细胞增殖率的影响。细胞增殖抑制率（未加药物处理的对照组吸光值药物处理组的吸光值）/未加药物处理的对照组吸光值。若该值为正说明药物对细胞增殖具有

8、抑制作用，若值为零表明药物对细胞增殖无影响；若值为负说明药物对细胞增殖具有促进作用。3.实验结果表1：不同浓度的5-氟尿嘧啶对Hala细胞增殖的抑制作用结果组 别空白组对照组第一组（50ug/ml）第二组（100ug/ml）第三组（200ug/ml）第四组（400ug/ml）OD值 0.7450.2750.2180.190.173细胞增殖抑制率0%-63.09%-70.74%-74.50%-76.78%图1 不同浓度的5-氟尿嘧啶对Hala细胞增殖的抑制作用结果由表1可知5-氟尿嘧啶对Hala细胞增殖确实有抑制作用。由细胞增殖抑制率计算公式（细胞增殖抑制率（未加药物处理的对照组吸光值药物处理组

9、的吸光值）/未加药物处理的对照组吸光值）可以得出不同浓度的5-氟尿嘧啶对Hala细胞的增殖抑制率分别为（图1）：-63.09、-70.74、-74.50、-76.78。随着5-氟尿嘧啶浓度的增加（50 ug/ml100ug/ml200 ug/ml400ug/ml）, OD值不断减小， 癌细胞增殖抑制率不断上升，表明5-氟尿嘧啶对癌细胞的抑制效果不断加强。细胞增殖抑制率也是随着5-氟尿嘧啶浓度的增高而增大。4.讨论4.1本实验表明5-氟尿嘧啶具有明显抑制细胞生长的作用，5-氟尿嘧啶浓度与细胞生长抑制率呈明显正相关，浓度越高，对Hela细胞生长抑制率越明显。4.2 药物处理接种细胞浓度必须适当，一

10、般每孔4000个细胞为宜，既细胞浓度在20000个/ml。若接种细胞太多，培养24小时后培养孔底部已长满细胞，后期培养时细胞生长受到抑制；若接种细胞太少，细胞增殖缓慢影响检测效果。4.3 用96孔板培养细胞做MTT测细胞活力，每孔内的培养液不少于200 l，否则会边缘孔因培养液蒸发影响细胞生长与测量结果；加DMSO之前要尽量去掉培养液，便于DMSO溶解甲臜颗粒进行比色测定。4.4 在接种细胞以及加药、换液的过程中，一定要注意操作的规范性，以免造成试验材料的污染，从而影响试验结果的准确性及科学性。4.5 根据试验的结果显示，当5-氟尿嘧啶的浓度为200ug/ml时，对Hala细胞的增值抑制率最高

11、，为-74.50，比浓度为50ug/ml时的-63.09有了大幅度的提高，但当浓度再提高时，虽然抑制的效果还是有所提升，但提升得不是很高，所以考虑到实际应用中的价格以及利益问题，还是选用浓度为200ug/ml的5-氟尿嘧啶作为抗肿瘤药物的浓度最有效。4.6避免血清干扰：一般选小于10的胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。4.7 MTT加20 l，作用4 h后洗掉上清液，注意不要将甲瓉洗掉，否则影响测量结果。由于边缘空液体的蒸发等，边缘孔测量结果会出现一定的偏差，一般不统计边缘孔的结果，特别是培养板的四角不宜计算。参考文献：1金宜纫,杨一昆,黄天术,等.抗癌新药卡铂的化学特

12、性.中国药学杂志,1994,29 (1):4143.2 王晓慧.P63、P53基因在卵巢癌中的表达及其在卡铂诱导卵巢癌细胞凋亡的变化.博士学位论文，2006，第1-114页. 3邑丝、汤辉焕等 MTT测定恶性肿瘤细胞对化疗药物的敏感性 中国普通外科杂志Chinese Jeurmal 0f General Surgery：1005-6947(2ooo)o6-o552-o34 谢 诚，钱美英缪丽燕.MTT法测定肿瘤细胞药物敏感性与临床用药药学与临床研究 2007年10月5 谢 诚，崔玉伟.5-FU持续化疗致口腔溃疡的观察及护理J.实用护理志,2002,18(2):42.陶红梅,谢蓉芝.芦荟预防5-FU持续化疗所致口腔溃疡的观察J.中华中西医杂志,2004,5(12):28.