医学免疫学：第四章 Ig的基因结构与Ab多样性的产生

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1、 根据抗原抗体反应的特异性，针对于某一种特定根据抗原抗体反应的特异性，针对于某一种特定抗原，就会有特异的抗体与之相对应。也就是说，抗原，就会有特异的抗体与之相对应。也就是说，外界存在有多少种抗原，在体内就会产生相应的外界存在有多少种抗原，在体内就会产生相应的抗体。据估计，在人体内具有产生超过抗体。据估计，在人体内具有产生超过1亿种抗体亿种抗体的潜在能力。的潜在能力。 如此多的抗体类型是如何产生的呢？如此多的抗体类型是如何产生的呢？一、抗体学说的发展一、抗体学说的发展 侧链学说侧链学说 抗原诱导学说抗原诱导学说n直接模板学说直接模板学说n折叠学说折叠学说 n间接模板学说间接模板学说 选择学说选择

2、学说n自然选择学说自然选择学说n克隆选择学说克隆选择学说侧链学说侧链学说（ 1897年，年， Ehrlich ） 细胞具有细胞具有多种多种膜侧链，毒膜侧链，毒素可以特异与相应侧链结素可以特异与相应侧链结合合 细胞可产生多量而过剩的细胞可产生多量而过剩的侧链，并将其释放的血液侧链，并将其释放的血液中，即成为抗体，这种游中，即成为抗体，这种游离的抗体，在血液中与毒离的抗体，在血液中与毒素结合，便可将其中和，素结合，便可将其中和，从而达到免疫效果。从而达到免疫效果。 一个细胞克隆一个细胞克隆具备针对具备针对多多种抗原种抗原的的多种多种膜侧链膜侧链直接模板学说：抗原为模板合成抗体直接模板学说：抗原为模

3、板合成抗体（1930年，Breinl和Haurowits）折叠学说：抗原诱导抗体折叠折叠学说：抗原诱导抗体折叠（1940年，Pauling ）间接模板学说：抗原对基因发生影响间接模板学说：抗原对基因发生影响（1949年，年，Burnet和和Fenner）自然选择学说自然选择学说（1955年，年，Jerne）机体对任何抗原早已准备下了相似的抗体（自然抗体），外来的抗原如与某种自然抗体相对应时，便可与之结合。抗原抗体复合物被巨噬细胞吞噬后，抗原被酶溶解，剩下的抗体便可在巨噬细胞内诱导产生与其具有同样特异性的抗体。在抗体的形成上，起主要作用的是体内早已存在的抗体。这种抗体在特异性抗原的选择作用下，才

4、能诱导吞噬细胞产生抗体。克隆选择学说（克隆选择学说（Clone selective theory）n 受到Jerne的自然选择学说的影响，澳大利亚免疫学家Burnet毅然放弃其间接模板学说，并且引进了他在间接模板学说所主张的基因致使细胞特异性的概念n 1957年发表了以“A modification of Jerne theory of antibody production using the concept of clone selection”为题的论文。n 1959年出版了题为The clonal selection theory of aquired immunity的专著，创立了举

5、世闻名的克隆选择学说。克隆选择学说（克隆选择学说（Clone selective theory）l动物体内存在大量的淋巴细胞克隆，每一克隆表面都带有特异性的SIg。l抗原选择的不是游离的抗体，而是事先存在于淋巴细胞膜表面的抗原受体，即表面免疫球蛋白（SIg）。l抗原能够选择性的激活带有相应受体的淋巴细胞克隆，使其分化增殖，产生相应抗体。l决定抗体结构的是淋巴细胞的基因，抗原不能改变修饰产生抗体的基因。克隆选择学说（克隆选择学说（Clone selective theory）l动物出生后，体内约有107个免疫细胞克隆，能产生各种抗体，足够抗原选择。l抗原与特异淋巴细胞的抗原受体结合，相应的克隆即

6、被选择，进而增殖分化，产生抗体。l抗原的作用只是启动，与枪机的扳机相似。相应的克隆一旦被选出，即便没有抗原的存在，也能继续产生抗体。l决定抗体特异性的是DNA，抗原对其无影响克隆选择学说（克隆选择学说（Clone selective theory）l细胞克隆在分化过程中，一部分淋巴细胞停留在中间阶段，与再次同相应的抗体接触时，立刻发育成熟而产生抗体，呈现免疫记忆现象。l在胚胎后期，自身抗原已经齐备，于是凡能与自身抗原特异性结合的相应克隆，便可受到阻抑，最后被清除，构成自身免疫耐受。 取被卵白蛋白、牛血清蛋白免疫的A兔的淋巴细胞（能产生抗卵白蛋白、牛血清蛋白的抗体） 玻璃珠（附有牛血清蛋白）亲和

7、淋巴细胞，收集非结合淋巴细胞。（玻璃珠附有牛血清白蛋白，同产生抗牛血清白蛋白的B细胞克隆发生结合而清除；抗卵白蛋白的淋巴细胞未被清除） 用X射线处理B兔子，破坏骨髓，杀死原有的淋巴细胞；注入经玻璃珠处理的A兔淋巴细胞 卵白蛋白、牛血清蛋白免疫B兔，只产生抗卵白蛋白的抗体克隆选择学说（克隆选择学说（Clone selective theory）实验证据实验证据1： Wigzell实验实验 A抗原偶联放射性元素，免疫动物，清除能与A抗原结合的淋巴细胞，不能分泌抗A抗体 识别其他抗原的细胞则不受影响，能产生抗体。克隆选择学说（克隆选择学说（Clone selective theory）实验证据实验证

8、据2：Humphrey放射自杀放射自杀实验实验A抗原抗原A抗原抗原BB+1.H基因库基因库（重链基因连锁群）第（重链基因连锁群）第14号染色体号染色体2.基因库基因库（链基因连锁群）第链基因连锁群）第2号染色体号染色体3.基因库基因库（链基因连锁群）第链基因连锁群）第22号染色体号染色体 V区：区： V、D、J基因编码基因编码 V基因：基因：CDR1、CDR2 D基因及基因及V-D：大部分：大部分CDR3 D-J基因：基因：CDR3其余部分及其余部分及骨架区骨架区 C区：区： 基因编码基因编码了解了解 H链胚系基因结构链胚系基因结构C区基因（区基因（CH）:9个个V区基因区基因V基因片段（基因

9、片段（VH）:65个个D基因片段（基因片段（DH）:27个个J基因片段（基因片段（JH）:6个个了解了解编码一条Ig重链、轻链的基因是由胚系中多个分开的DNA片段经剪切重排而成的。Ig基因表达的特点基因表达的特点（一）（一）Ig基因重排基因重排（二）等位排斥与同种型排斥（二）等位排斥与同种型排斥（三）（三）Ig的类别转换的类别转换（四）分泌型和膜型（四）分泌型和膜型Ig（五）（五）mIgM与与mIgD的共表达的共表达n Ig基因重排基因重排：Ig胚系基因中，胚系基因中，V、（、（D）、）、J基因基因片段之间由内含子隔开，通过基因片段的随机重片段之间由内含子隔开，通过基因片段的随机重排，形成排，

10、形成V（D）J连接，再与基因片段连接，连接，再与基因片段连接，才能编码完整的才能编码完整的Ig多肽链。多肽链。Ig基因重排主要通过基因重排主要通过重组酶（重组酶（recombinase）的作用实现。）的作用实现。n Ig胚系基因重排程序胚系基因重排程序l首先是重链发生基因重排，随后是轻链重排。首先是重链发生基因重排，随后是轻链重排。l重链：胚系基因重链：胚系基因 D-J连接连接 V-DJ连接连接（一）（一）Ig基因重排基因重排重点重点 等位排斥（等位排斥（allelic exclusion）：一条染色体上一条染色体上Ig重重链基因的有效重排，抑制另一条同源染色体重链基链基因的有效重排，抑制另一

11、条同源染色体重链基因重排。因重排。 B细胞中位于一对染色体上的轻链或重链细胞中位于一对染色体上的轻链或重链基因，其中只有一条染色体上的基因得到表达基因，其中只有一条染色体上的基因得到表达。保保证了一个证了一个B细胞只表达一种轻链和一种重链，也即细胞只表达一种轻链和一种重链，也即只表达一种特异抗原受体。只表达一种特异抗原受体。 同种型排斥（同种型排斥（isotype exclusion）：是指两种轻链之间的排斥，轻链有链和链，但一个Ig分子只能表达其中的一种，或是链，或是链。(注意：二者在非同源的染色体)（二）等位排斥与同种型排斥（二）等位排斥与同种型排斥 类别转换（类别转换（class swi

12、tching）：指指B细胞在细胞在受抗原刺受抗原刺激后激后，首先合成，首先合成IgM，然后转为合成，然后转为合成IgG、IgA和和IgE等的现象。等的现象。由于由于Ig的类型由重链决定，所以在重链重的类型由重链决定，所以在重链重排时，在排时，在V区基因不变的情况下，区基因不变的情况下，C基因发生重排基因发生重排，使得最，使得最终的基因产物的终的基因产物的V区相同，而区相同，而C区不同；也就是说抗体识别区不同；也就是说抗体识别的特异性相同，但的特异性相同，但Ig分子的类型却发生了改变。分子的类型却发生了改变。（三）（三）Ig的类别转换的类别转换重点重点 IL-5IgAIgMB cell抗原抗原举

13、例举例（三）（三）Ig的类别转换的类别转换（图解）（图解）cmcdcg3VJCg3DVJDV-D-JcmV-D-JCg3CmCdIgMIgGcmcdcg3VJDVJCg3DIg的类别转换V区基因重排类别转换性质DNA初次重排DNA二次重排发生位点骨髓外周淋巴组织发生时间B细胞骨髓发育成熟抗原刺激作用抗原特异性的B细胞发育产生功能性抗体（四）分泌型和膜型（四）分泌型和膜型Ig IgM 膜型膜型(mIgM)：作：作为为B细胞受体接受细胞受体接受抗原信息，活化抗原信息，活化B细胞细胞 分泌型分泌型(SIgM) ：结合抗原，发挥免结合抗原，发挥免疫防御作用疫防御作用了解了解 幼稚B细胞的分化过程中，首

14、先表达mIgM，后表达mIgD；mIgD是B细胞的重要表面标志。 B细胞若仅表达mIgM，在接受抗原刺激后易形成耐受性，若同时表达mIgM和mIgD，则受抗原刺激后可被激活。故mIgD可作为B细胞分化发育成熟的标志，活化的B细胞或记忆B细胞的mIgD逐渐消失。（五）（五）mIgM与与mIgD的共表达的共表达了解了解V-D-Jd dV-D-Jm md dPloy APloy AV-D-Jm mIgD mRNAIgM mRNAPrimary RNA transcript了解了解 1965年年Bennet首先提出首先提出“两个基两个基因编码一条多肽链因编码一条多肽链”假说，认假说，认为为Ig的的V区

15、和区和C区是由分隔存在区是由分隔存在的基因所编码，在淋巴细胞发的基因所编码，在淋巴细胞发育过程中这两个基因发生易位育过程中这两个基因发生易位而重排在一起。而重排在一起。 1976年利根川进应用年利根川进应用DNA重组重组技术证实了这一假说技术证实了这一假说。发现：。发现：编码一条编码一条Ig多肽链的基因是由多肽链的基因是由各个分隔开的各个分隔开的DNA片段经剪接片段经剪接重排而形成。重排而形成。利根川进利根川进 实验证据实验证据（原始因素）（原始因素）（主要因素）（主要因素）VH: 40(V)25(D) 6(J)=6000VL(k): 40(V)5(J)=200VL(l): 30(V)4(J)

16、= 1201.9 106：B细胞在受到细胞在受到抗原剌激后抗原剌激后，已重排，已重排好的好的V区基因区基因(尤尤CDR3)突变频率增高，称体细胞高频突突变频率增高，称体细胞高频突变。经过抗原的选择，使变。经过抗原的选择，使V区区CDR(互补决定区互补决定区)与抗原与抗原的亲和力得到优化，即为的亲和力得到优化，即为抗体的亲和力成熟抗体的亲和力成熟。+ N-核苷酸核苷酸 +TdT重链基因的重排、重链基因的重排、RNA处理和蛋白处理和蛋白质表达的过程质表达的过程Ig(BCR) 多样性可达多样性可达1014，TCR多样性可达多样性可达1016Question：为什么有的人打乙肝疫苗却没：为什么有的人打

17、乙肝疫苗却没有诱导出抗乙肝抗体？有诱导出抗乙肝抗体？一、多克隆抗体（一、多克隆抗体（polyclonal antibodypolyclonal antibody），）， 第一代抗体第一代抗体 1.定义定义 指由不同指由不同B细胞克隆产生的针对抗原物质中多种抗原决细胞克隆产生的针对抗原物质中多种抗原决 定簇的多种抗体混合物。定簇的多种抗体混合物。 如如:免疫血清（含多种特异性、免疫血清（含多种特异性、 抗体）。抗体）。2.特点特点 来源广泛，制备容易；特异性不高来源广泛，制备容易；特异性不高3.实际意义实际意义 预防、治疗感染性疾病预防、治疗感染性疾病 如抗蛇毒血清、抗狂犬、破伤风血清等如抗蛇毒

18、血清、抗狂犬、破伤风血清等多数天然抗原具有多种抗原决定簇,注入机体后可刺激多个B细胞克隆发生免疫应答,产生多种相应抗体-这种由多个克隆细胞产生的多种抗体混合物,即为多克隆抗体.B3B3B2B2B1B1B3B3AgAg机体机体B2B2AgAgB1B1合成并分泌抗体合成并分泌抗体多克隆抗体多克隆抗体AgAg合成并分泌抗体合成并分泌抗体AbAb1 1AbAb2 2AbAb3 3AbAb1 1AbAb2 2AbAb3 3单克隆抗体单克隆抗体机体机体 二、单克隆抗体（二、单克隆抗体（monoclonal antibody, McAb），），第二代抗体第二代抗体1.定义定义 由单一克隆由单一克隆B细胞杂交

19、瘤产生的，只识细胞杂交瘤产生的，只识别抗原分子某一特定抗原决定簇的特异性抗体。别抗原分子某一特定抗原决定簇的特异性抗体。2.特点特点 具有高度均一性。具有高度均一性。3.杂交瘤细胞杂交瘤细胞 骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞 无限增殖；无限增殖； 免疫免疫B细胞细胞 合成、分泌特异性抗体。合成、分泌特异性抗体。4.杂交瘤技术杂交瘤技术 HAT培养基：次黄嘌培养基：次黄嘌(H), 氨基蝶呤氨基蝶呤(A)和胸和胸腺嘧啶核苷腺嘧啶核苷(T)。 Cesar MilsteinNobel Prize in 1984 Georges Kohler Nobel Prize in 1984革命性的突破：杂交瘤技术革命性的突

20、破：杂交瘤技术Step1: 进行杂交瘤细胞融合进行杂交瘤细胞融合单克隆抗体的制备原理和单克隆抗体的制备原理和方法：方法： (1) B细胞能产生抗体，细胞能产生抗体，但不易在体外培养但不易在体外培养(2)骨髓瘤细胞能在体内、骨髓瘤细胞能在体内、外无限增殖，但不能分泌外无限增殖，但不能分泌抗体抗体(3) 两者形成的杂交瘤细两者形成的杂交瘤细胞即能大量增殖，又能合胞即能大量增殖，又能合成和分泌特异性抗体。成和分泌特异性抗体。B3B3B2B2B1B1AgAgB2B2B1B1小鼠小鼠骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞细胞融合细胞融合选择培养（选择培养（HATHAT培养基）培养基）B3B3B2B2B1B1B2B2筛选杂

21、交瘤细胞筛选杂交瘤细胞克隆化建株克隆化建株B2B2AbAb1 1AbAb2 2B3B3AbAb3 3 HAT筛选培养基的主要成分为： H：次黄嘌呤，DNA合成底物 A：氨基喋呤，氨基喋呤，正常正常DNA合成合成阻断剂阻断剂 T：胸腺嘧啶，DNA合成底物 由于氨基喋呤的作用，使DNA合成的主要通路(叶酸途径)受阻，迫使细胞启动旁路通路进行DNA的合成。如果细胞的次黄嘌呤鸟嘌呤核苷酸转移酶(HGPRT)或胸腺嘧啶激酶(TK) 缺失，无法启动旁路通路利用次黄嘌呤和胸腺嘧啶合成DNA，细胞死亡。Step2:筛选杂交瘤筛选杂交瘤 结果：结果： HGPRT或或TK缺陷的骨缺陷的骨髓瘤细胞在髓瘤细胞在HAT

22、培养基培养基中不能存活；中不能存活； 脾细胞不能在体外长期脾细胞不能在体外长期培养繁殖；培养繁殖； 杂交瘤细胞从脾细胞获杂交瘤细胞从脾细胞获得得HGPRT或或TK，可以，可以存活。存活。 将杂交瘤细胞克隆混合将杂交瘤细胞克隆混合液充分稀释后加入每个液充分稀释后加入每个小孔，最终使每个小孔小孔，最终使每个小孔中最多含有一个杂交瘤中最多含有一个杂交瘤细胞克隆（细胞克隆（单克隆单克隆） 用特异性抗原决定簇对用特异性抗原决定簇对每个孔的杂交瘤细胞克每个孔的杂交瘤细胞克隆进行检测，选出针对隆进行检测，选出针对目标抗原决定簇的抗体目标抗原决定簇的抗体阳性细胞株阳性细胞株Step3:筛选抗体筛选抗体YYYY

23、YY取每孔的上清液与目标取每孔的上清液与目标抗原决定簇进行抗原抗抗原决定簇进行抗原抗体反应，若呈阳性，说体反应，若呈阳性，说明该孔内的杂交瘤细胞明该孔内的杂交瘤细胞克隆为我们所需要的细克隆为我们所需要的细胞株胞株 特异性特异性敏感性敏感性均一性均一性McAbPcAb差差无无高高强强有有1、用于免疫学检测，辅助、用于免疫学检测，辅助临床诊断临床诊断2、McAb用于亲和层析，分用于亲和层析，分离微量可溶性抗原离微量可溶性抗原3、标记的、标记的McAb用于基础研用于基础研究，了解细胞分化等究，了解细胞分化等4、制备生物导弹用于肿瘤、制备生物导弹用于肿瘤、移植、自身免疫疾病等的移植、自身免疫疾病等的临

24、床治疗。临床治疗。（三）基因工程抗体（三）基因工程抗体(Genetic engineering antibody)n (1) 嵌合抗体(chimeric antibody)：从杂交瘤细胞分离出功能性可变区基因，与人Ig恒定区基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人-鼠嵌合抗体。n 特点：减少了鼠源性抗体的免疫原性，同时保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力。1 1、人源化抗体、人源化抗体人人-鼠嵌合抗体鼠嵌合抗体知识拓展知识拓展（2）改型抗体(reshaped antibody)：将小鼠的CDR序列移植到人抗体可变区框架中，产生的抗体称为CDR移植抗体。人人-鼠改形抗体鼠改形抗体知识拓展知

25、识拓展 （3）完全人源化抗体： 将小鼠 Ig 基因敲除，转染人 Ig 基因，在小鼠体内产生人 Ab，再经杂交瘤技术，产生大量完全人源化抗体。知识拓展知识拓展l 用基因工程方法，将抗体一条重链和一条轻链可变区通过一个连接肽连接而成的重组蛋白。它是具有完全抗原结合位点的最小抗体片断。l 特点：能保持与抗原结合的性能，分子量小，穿透性强，体内循环半衰期短，免疫原性低。l 应用：单链抗体与重组毒素、细胞因子或药物等融合表达，用于肿瘤的导向治疗; 肿瘤定位诊断等 2、单链抗体、单链抗体(single chain antibody)知识拓展知识拓展 是一类具有双功能的抗体杂交分是一类具有双功能的抗体杂交分

26、于，两价抗体中的于，两价抗体中的 Fab段具有不同段具有不同特异性，能与不同的表位结合。特异性，能与不同的表位结合。 3、双特异性抗体、双特异性抗体 (bispecific antibody)双特性抗体杀伤肿瘤细胞示意图双特性抗体杀伤肿瘤细胞示意图知识拓展知识拓展抗肿瘤和抗免疫活性细胞CDl6或CD3的双特异性抗体，不仅具有激活NK细胞或T细胞作用，而且可以通过抗肿瘤的Fab段特异性结合肿瘤细胞发挥作用，提高局部NK细胞或T细胞浓度，增强效应分子杀伤肿瘤能力多克隆抗体单克隆抗体来源动物免疫血清、恢复期病人血清或免疫接种人群多为鼠源性特点来源广泛、制备容易纯度高、特异性强、效价高、少或无血清交叉反应、制备成本低组成针对不同抗原表位的抗体的混合物针对单一表位，结构和组成高度均一，抗原特异性及同种型一致应用疾病的被动免疫治疗广泛用于疾病诊断、特异性抗原或蛋白的检测和鉴定、疾病的被动免疫治疗和生物导向药物制备缺点特异性不高、易发生交叉反应，不易大量制备人体应用后可导致人鼠抗体反应多克隆抗体与单克隆抗体的比较多克隆抗体与单克隆抗体的比较