实验四酶联免疫吸附试验ELISA

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1、实验四阻断酶联免疫吸附试验（阻断EL ISA）免疫标记技术1 定义:将抗原-抗体反应与标记技术相结合，用放射性同位素、酶或荧光素标记的已知抗体或抗原，通 过检测标记物，间接测定未知的抗原或抗体。2.分类：/放射免疫测定法32p/免疫荧光技术：FITC, PE/免疫酶测定法：HRP, AP免疫酶测定法(Enzyme ImmunoAssay, EIA)用酶标记的抗原或抗体进行的抗原抗体反应O-辣根过氧化物酶(HRP),碱性磷酸酶(AP)特点：/高度特异性：保持抗原抗体反应的特异性/高灵敏度：酶催化底物显色的高效性，pg水平微量检测定性定量检测：反应液颜色深浅或光密度值分类:酶联免疫吸附试验：可溶性

2、抗原或抗体/酶免疫组化法：组织中或细胞表面的抗原。酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA)1 定义2 原理用酶标记抗原或抗体检测液体(血液、细胞液) 中未知抗体或抗原的方法。(1)利用抗原与抗体的特异反应将待测物 与酶连接。(2)通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。-测定的对象可以是抗体也可以是抗原。 直接法(direct EUSA):3常用 种类 将已知抗原直接吸附于载体，加酶标抗体 检测抗体 间接法(IndirectELISA): 将已知抗原吸附于固相载体，加酶标记二抗 检测液相中未知抗体 双抗体夹心法(SandwichELIS

3、A)： 将已知抗体吸附于固相载体，酶标记一抗 检测液相中的可溶性抗原 竞争法(Competitive ELISA)； 将已知抗体或抗原吸附于固相载体，酶标记抗原或抗体 检测液相中的可溶性抗原或抗体 阻断法(BlockELISA)： 将已知抗原吸附于固相载体，酶标记单克隆抗体 检测液相中的可溶性抗体(1)直接法测定抗原A.将抗原吸附在载体表面;B.加酶标抗体，形成抗原一抗体复合物;C. 加底物。底物的降解量=抗原量。底物及分解后的产物图20 I 58联免疫吸附试验直接法(测抗原)示意图注：图201图20-8,图标相同(2)间接法测定抗体A.将抗原吸附于固相载体表面;B.加抗体.形成抗原-抗体复合

4、物;加酶标抗D.加底物。测定底物的降解量=抗体量。washAnUgcin- coated wellActd subslrate(S)i arvd measure colofIndirect ELISAAdSd specific Add enzyme- antibocfy conjugated seridary antibody(3)双抗体夹心法测定抗原 A.B.C.将抗体吸附于固相表面；加待检抗原，形成抗原-抗体复合物;加酶标抗体；加底物。底物的降解量=抗原量。图20 4靜联免疫吸附试验(双抗体夹心法)示意图（4）竞争法测定抗原A.将抗体吸附在固相载体表面;B.同时加入酶标抗原和待测抗原，竞争

5、结合抗体；对照只加入酶标抗原;C. 加底物。对照孔与样品孔底物降解量的差=未知抗原量。图20-6前联免疫吸附试验（竞争法）示意图(5)阻断法测定抗体本法主要用于检测型特异性抗体。该方法现已成为 猪传染性胃肠炎(TGE).猪伪狂犬病(PR)及猪 胸膜肺炎(AP)的主要检测方法。A. 将抗原吸附在固相载体表面;B. 先加待检血清(抗体),形成抗原-抗体复合物;C. 再加酶标单抗;D. 加底物。酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA)-抗原-.(以ELISAS 例):I:FvK洗涤JL JL-2.上 阻断法测定猪伪狂犬病病毒EL I SA抗

6、体一定性检测实验材料猪伪狂犬病毒（PRV）抗原阴性对阳性对照样品一待测猪血清IIIHRP标记猪PRV单抗一一酶标单抗包被缓冲液：0. 025M pH9. 6碳酸盐缓冲液洗涤液：含0. 05% Tween 20的0. 01M pH7. 4 PBS底物缰冲液：PH5.0磷酸盐柠檬酸缓冲液底物溶液：TMB （甲基联苯胺），底物缓冲液，30% H202,新鲜配制酶标板，酶标仪实验方法1.抗原的处理: 2.包被抗原:取酶标板，加入100PL/孔的抗原稀释液4C,湿盒内18h实验方法取出包被好抗原的酶标板（4孔/组），甩干孔内液体以洗涤液（200UL/孔）洗涤3次，3min/次3.加待测血清标记各孔，加入

7、相应液体100UL/孔37C,湿盒内，30min空阴阳待 白性性测甩干孔内液体4.加单抗:以洗涤液（200 P洗涤3次，3min/次各孔加入酶标单抗100P L/7L37C,湿盒内,30min甩干孔内液体5.显色:以洗涤液（200UL/孔）洗涤3次，3min/次加入底物溶液100UL/孔6.观察结果避光显色，10min具体操作步骤2、1、取已包被猪伪狂犬病毒抗原的跡板（根据样品多少，可拆开分次使用），用样品稀释液（PBS）将待 检血清1 ： 1稀释后加入板孔中，每孔加100plo同样1 ： 1稀释阴、阳性对照血清，阴、阳性对照各设1 孔，每孔100plo另设一空白对照孔，空白对照孔加400pl

8、稀释液。轻轻振匀孔中样品（勿溢出），置 37 C温育30分钟。洗板：甩掉板孔中的溶液，每孔加入稀释好的洗涤液200pl,静置3分钟倒掉，再在吸水纸上拍干，重复3次。3、每孔加酶标单抗100pl,置37C温育30分钟。4、洗板：洗涤3次（方法同步骤2） o切记每次在干吸水纸上拍干。5、显色与终止：每孔先加底物A液、再B液各1滴（50），混匀。室温（18-25*0 避光显色10分钟后。6、终止：每孔加终止液1滴（50$） （0.25%氢氟酸），终止反应。7、10分钟内测定结果。采用波长630nm的酶标仪测定OD值。检测样本的ODR35为阳性 8、结果判定：试验成立的条件是：阴性对照孔平均OD630

9、值与阳性对照孔平均OD630值之差M0.4。S=样品孔OD630值，”=阴性对照孔OD63（X如果S/N比值W0.6,样品判定为PRV抗体阳性。如果S/N比值W0.7但0.6,样品重测。常用酶底物加终止液前颜色加终止液后颜色辣根过氧化物酶（HRP）邻苯二胺（OPD）橙黄色棕黄色四甲基联苯胺（TMB）蓝色蓝色碱性磷酸酶（AP）对硝基苯磷酸酯（p- NPP）黄色预期结果常用酶及底物阴性：显色为蓝色阳性：无色阳性阳性阴性阴性注意事项1、ELISA实验前血清样品尽量做到37C灭活30分钟。2、在ELISA的整个操作过程中，洗涤是不可缺少的重要步骤, 每加一层反应结束后均要洗涤固相载体反应板，目的在于防止 重叠引起非特异性吸附。洗涤过程中的助溶剂吐温20具有降低 非特异吸附的作用。洗涤时尽可能除去未结合的抗原及杂质， 用力甩干。3、加入底物液后应该室温避光，结果判断须在10分钟内完成。