酪氨酸酶的提取及其酶促反应动力学研究

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1、酪氨酸酶的提取及其酶促反应动力学研究 一、 实验目的 1.认识生物体中酶的存在和催化作用，了解生物体系中在酶促反应的特点，认识一些生物化学过程的特殊性。 2.掌握生物活性物质的提取和保存方法，了解研究催化反应特别是生物化学体系中催化过程的基本思想和方法。 二、 实验原理 酶（enzyme）是由生物细胞合成的、对特定底物（substrate）起高效催化作用的蛋白质，是生物催化剂。生物体内所有的化学反应几乎都是在酶的催化作用下进行的。只要有生命活动的地方就有酶的作用，生命不能离开酶的存在。在酶的催化下，机体内物质的新陈代谢有条不紊地进行着；同时又在许多因素的影响下，酶对代谢发挥着巧妙的调节作用。生

2、物体的许多疾病与酶的异常密切相关；许多药物也可通过对酶的作用来达到治疗的目的。随着酶学研究的深入，必将对人类社会产生深远影响和作出巨大贡献。 酶的化学本质是蛋白质。结构上，同样具有一、二、三级结构，有些酶还具有四级结构。分子的化学组成上，有单纯酶和结合酶之分。单纯酶分子是仅由蛋白质构成的酶，不含其他物质，如脲酶、活化蛋白酶、淀粉酶、核糖核酸酶等等。结合酶分子是由蛋白质分子和非蛋白质部分组成，前者称为酶蛋白（apoenzyme），后者称辅助因子（cofactor）。辅助因子是金属离子或有机小分子。酶蛋白与辅助因子结合形成的复合物称全酶（holoenzyme），酶蛋白和辅助因子各自独立存在时，均无

3、催化活性，只有全酶才有催化活性。在酶促反应中酶蛋白决定着反应的专一性和效率，而辅助因子则决定着反应的种类和性质。 辅助因子按其与酶蛋白结合的紧密程度和作用特点，一般分为辅酶（coenzyme）和辅基（prosthetic group）。辅酶是指辅助因子与酶蛋白结合松弛，没有固定的组成比，往往可用透析或超滤法除去，在反应中作为底物接受质子或基团后离开酶蛋白，参加另一酶促反应并将所携带的质子或基团转移出去，或者相反。而辅基是指与酶蛋白结合比较紧密，与酶蛋白有一定的组成比，不能通过透析或超滤法除去，在反应中辅基不能离开酶蛋白。 辅助因子中大部分是金属离子，约占2/3。小部分是稳定的有机小分子。常见的

4、金属离子有K+、Na+、Mg2+、Ca2+、Cu2+(Cu+)、Zn2+、Fe2+(Fe)3+等。金属离子以辅基出现的称金属酶，以辅酶出现的称金属激活酶。金属辅助因子的作用是多方面的，或者作为酶活性中心的催化基团参与催化反应，传递电子；或者作为连接酶与底物的桥梁，便于酶对底物起作用；或者是稳定酶的构象所必需的；或者中和阴离子，降低反应中的静电作用等。 有机小分子的辅助因子，主要是参与酶的催化过程，在反应中传递电子、质子或一些基团。 酶分子中能与底物作用或结合形成酶 - 底物中间配合物的区域称酶的活性中心。对于结合酶而言，辅酶（辅基）分子或分子中的某一部分结构往往就是活性中心的组成部分。 酶既具

5、备一般非生物催化剂的加快反应速度的功能，又具有一般催化剂所不具备的生物大分子的特征。 酶与一般非生物催化剂相比，具有以下几个特点： 1.酶的主要成分是蛋白质。它具有表现活性和专一性所必需的空间结构，以提供反应中心。由于蛋白质遇高温、强酸、强碱、重金属盐或紫外线等容易变性而失活，所以酶促反应都是在比较温和的条件下进行的，如人体中的各种酶促反应，一般都在体温（37）和pH约为7的条件下进行。 2.酶促反应所需的活化能较低。如使1 mol蔗糖水解所需活化能高达32万卡，用H+ 离子作催化剂时活化能降至2.1万卡，若用蔗糖酶催化时只需0.94万卡。 3.酶的催化效率非常高。酶的催化效率通常比非催化反应

6、高108 -1020 倍，比一般非生物催化剂高107 -1013 倍。如存在于血液中能催化H2CO3 分子分解的碳酸酐酶，它的催化效率非常高，每一分子每分钟可以催化1.9107个H2CO3 分子分解。正是因为血液中有这样高效率的酶，才能及时完成排放CO2 的任务，维持血液的正常生理pH值。 4.酶具有高度的专一性。酶对所作用的底物有严格的选择性，每一种酶只能对某一类物质甚至只对某一种物质起催化作用，这是一般非生物催化剂所无法比拟的。 酶的以上特性已引起化学工作者的极大兴趣，如酶正被作为分析试剂、探针得到应用；生物酶的化学模拟已广泛开展，将为研制高性能的工业催化剂奠定基础。酶的电化学研究的开展还

7、开辟了生物电化学的新领域。酶化学是一门交叉学科，对其研究具有广阔的前景。 酶促反应动力学是酶化学的主要内容之一，这方面的研究具有重要的理论和实践意义。 本实验拟通过从土豆等物中提取酪氨酸酶并就其酶促反应的动力学研究其活性，使同学们对酶有个初步的认识。当土豆、苹果、香蕉或蘑菇受损伤时，在空气作用下，很快变为棕色，这是因为它们的组织中都含有酪氨酸和酪氨酸酶，酶存在于物质内部，当内部物质暴露于空气中，在氧的参与下将发生如下反应，生成黑色素。 影响酶作用的因素有酶的浓度、底物浓度、pH、温度和抑制剂等。在酶浓度恒定的情况下，增加底物的浓度，可以提高酶促反应的初速度。当底物浓度增至某一限度后，反应初速度

8、就不再随底物的浓度而变化，而是逐渐趋近某一极限值，这个极限值称为最大速度(Vmax)。 大量实验事实表明，在酶催化过程中，酶（E）首先与底物（S）结合成中间络合物（ES），然后再分解成为产物（P）和酶 而产物生成速度取决于ES络合物的分解速度。Michaelis 和Meten应用动力学方法，推导得到一个动力学方程，定量描述了底物浓度与酶促反应速度的关系 该式为米氏方程式。米氏常数Km在大多数情况下是 10-1-10-6 mol/L。当K2 K3 时，Km可看成是 ES 的离解常数，也可以作为衡量酶与其底物结合力的尺度，Km值越大，表示酶与其底物的结合力越小，反之，则越大。对每一个酶 - 底物体

9、系来说，Km是一个特征值，它与酶的浓度无关，但与pH、温度及其它外在因素有关。Km的物理意义是：当酶促反应速率达到最大反应速率一半时的底物浓度，单位是mol/L。不同的酶存在不同的Km。若底物不同Km也不同，所以Km常用于酶的鉴定。 参数Km和Vmax可由选择不同的S测定相应的Vi，然后用双倒数作图法求得。米氏方程式的倒数形式为 以1/Vi对1/S作图，可得Lineweaver-Burk图，由直线的斜率和截距可求Km值。 数据处理中也可以根据最小二乘法对所得实验数据进行拟合，使处理的准确性提高。 以下介绍最小二乘法的方法说明： 设随机变量y随自变量x变化。给定观测数据（xI，yI），I = 0

10、，1，.，n-1，用直线y = ax+b作回归分析。其中a，b为回归系数。 为确定回归系数a和b，通常采用最小二乘法，即要使 达到最小。根据极值原理，a与b应满足下列方程 从而解得 其中 根据上述最小二乘法，可以在实验中编写程序处理成线性关系的物理量值，快速准确地得到各项实验数据。 酶活性测定的目的是为了了解组织提取液、体液或纯化的酶液中酶的存在与多寡。由于含量甚微且酶蛋白大多与其他蛋白相混合，将其提纯是一件耗时耗力的事，很难直接测定其含量。而酶的活性被定义为酶催化化学反应的能力，其衡量的标准是酶促反应速度的大小。酶促反应速度可用在适宜的特定条件下单位时间内底物消耗量或产物生成量来表示。 因为

11、在酪氨酸酶中含有铜，因此铜的络合剂如二乙基二硫代氨基甲酸钠、叠氮化物、氰化物、苯硫脲或半胱氨酸都是酪氨酸酶活性的有效抑制剂，它们的存在能减慢或停止酶促反应的进行。 三、 仪器和试剂 1仪器 分光光度计，离心机，研钵，水浴，秒表。 2试剂 pH = 6.8的磷酸钠缓冲溶液；1-多巴（左旋多巴，二羟基苯丙胺酸）溶液（每升缓冲溶液中含多巴4 mg）；铜试剂（二乙基二硫代氨基甲酸钠），用缓冲液配置成10-3 mol/L；土豆（或苹果）。 四、 实验步骤 1.酶的提取 在预冷的研钵中放入12.5 g经过冰冻的切碎了的土豆（或苹果），加入冰冷的25 mL磷酸钠缓冲溶液，用力研磨挤压（约1 min）。用两层

12、纱布滤出提取液，立即离心分离（约3000 rpm，5 min）。倾出上层清液保存于冰浴或冰箱中。（实验中，酪氨酸酶必须在临使用前制备。） 2.Km和Vmax的测定 在6支干燥试管中，按表4.1中所列的用量（单位：mL）依次加入缓冲液、多巴溶液，摇匀并在30下恒温。然后加入酶提取物，立即计时，反应物经充分混合后立即于475 nm处、在1 cm比色皿中测定1 min时的吸光度，以缓冲液和酶作参比溶液，应用吸光系数log= 3.7，求出Vi（mol/L/min）。 表4.1 Km和Vmax的测定数据记录表（单位：mL） 3.抑制剂的影响 在6支干燥试管中，按表4.2中所列的用量（单位：mL）依次加入

13、缓冲液、多巴溶液和铜试剂溶液后在30下恒温，加入酶后立即计时，于475 nm处测定1 min时的吸光度，作出抑制剂浓度对反应初速度的图。 五、 数据记录与处理 不同酶加入量的动力学曲线：以1/Vi为纵坐标，1/S为横坐标，可得出Lineweaver-Burk图，直线的斜率为Km/Vmax，在纵坐标上的截距为1/Vmax。 实验数据填入表4.2。 该步骤可用最小二乘法拟合得出直线的斜率。 表4.2抑制剂的影响测定数据记录表（单位：mL） 六、 思考题 1.影响酶活性的因素有哪些？ 2.提取物在放置过程中为何会变黑？ 3.热处理后酶的活性为何会显著降低？ 参考文献 1 Frieclman, M.

14、E., Daron, H. H. Tyrosinase. An introductory experiment with enzymes. J. Chem. Edu., 1977,54(4):256-257 2 沈同，王镜岩. 生物化学.上册. 北京：高等教育出版社，1990. 3 Boyer, R. F. A Spectrophotometric Assay of Polyphenoloxidaes Activity. A special project in enzyme characterization. J. Chem. Edu. 1977,54(9):585-586 4 Stryer, L. 唐有祺等译. 生物化学. 北京：北京大学出版社，1990. 5 周爱儒. 生物化学. 北京:人民卫生出版社， 2001.