系统发育学论文恩蚜小蜂属部分种类SrDNA及CO基因序列的分子进化和系统学研究

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1、恩蚜小蜂属部分种类28S rDNA及CO1基因序列的分子进化和系统学研究 专业：生物化学与分子生物学姓名：邢建晓 学号：20141155 摘要本文通过对恩蚜小蜂属部分种类28S rDNA及CO1序列进行分析，重建恩蚜小蜂属的部分种类系统发育关系。使用ClustalX1.81对来源于Genbank上的27种恩蚜小蜂属28S rDNA及CO1序列片段进行了同源性比较，并利用MEGA 5.0软件计算碱基含量、颠换值、转换值、颠换比和遗传距离，采取相邻连接法、最小进化法、最大似然法构建了恩蚜小蜂属的系统发育树。结果显示，恩蚜小蜂属28SrDNA序列的保守位点为3,占总位点数的0.55%;序列变异位点为

2、538,简约信息位点为536,占序列总位点的99.1%，转换数为113,颠换数为237,碱基的转换主要发生在TC间,转换的频率是颠换频率的0.48倍,由此可以认为恩蚜小蜂属的28SrDNA的保守性较强。恩蚜小蜂属C0I序列的保守位点为1,占总位点数的0.15%;序列变异位点为680,占总变异位点的99.7%;简约信息位点为678。其中转换数为99,颠换数为284,可见恩蚜小蜂属的C0I序列的变异率较高。关键词：恩蚜小蜂属 28SrDNA 系统发育 Abstract This article analysis 28S rDNA and CO1 sequence of Encarsia,and r

3、econstruct the genus part of phylogenetic relationships of Encarsia. Using ClustalX1.81 from of 27 Encarsia in Genbank compared 28 s rDNA and CO1 sequence fragments.The homology and MEGA 5.0 software is used to calculate base content,transversion value, transformation, transversion ratio and genetic

4、 distance.Taking the adjacent connection method,minimum evolution method, maximum likelihood method to construct the phylogenetic trees of the Encarsia.According to the results of Encarsia ,conservative sites of 28s sequences is 3,accounting for 0.55% of the total numbers;Sequence mutation loci is 5

5、38, contracted and information site is 536, accounting for 99.1% of the sequence of total, convert the number is 113, Britain is 237, the bases of the transformation occur between mainly in TC, the frequency of transformation is a transversion of 0.48 times, which can be thought of Encarsia of the 2

6、8s conservative is stronger. The Encarsia of C0I sequence of conservative sites is 1, accounting for 0.15% of the total numbers ;Sequence mutation sites is 680, accounting for 99.7% of the total variation sites.A simple information site is 678 which convert the number to 99. Britain is 284, Encarsia

7、 genus C0I sequence variation rate is higher.Keywords: Encarsia 28SrDNA system development目 录 1 前言- 1 -1.1恩蚜小蜂属分类地位- 1 -1.2序列比对- 2 -1.3系统发育树的构建方法- 2 -1.4 本论文研究目的与意义- 3 -2 步骤与方法- 3 -2.1序列比对- 3 -2.2 计算遗传距离- 4 -2.3 序列特征分析- 4 -2.4 系统发育树的构建- 4 -3 结果与分析- 5 -3.1 28SrDNA序列的分析- 5 -3.1.1 28SrDNA序列核苷酸的组成- 5 -3

8、.1.2 28SrDNA序列的碱基替换情况分析- 6 -3.2 COI序列的分析- 7 -3.2.1 COI序列核苦酸的组成- 7 -3.2.2 COI序列的碱基替换情况分析- 7 -3.3 恩蚜小蜂属的系统发育分析- 8 -3.3.1 用最大似然法(ML)建树- 8 -3.3.2 用相邻连接方法(NJ)建树- 10 -3.3.3 用最小进化法(ME)建树- 12 -4 小结与讨论- 13 -5 参考文献- 14 -1 前言1.1恩蚜小蜂属分类地位 恩蚜小蜂属(Encarsia Forster)隶属于膜翅目(Hymenoptera)、小蜂总科(Chalcidoidea)、财小蜂科(Apheli

9、nidae),分布于世界各地。雌成虫外部形态特征是恩赐小蜂分类的主要依据。恩蚜小蜂体浅色至深褐色或有斑纹。触角膝状,8节,索节3-4节,棒节2-3节,索节与棒节上有条形感觉器。前胸背板窄小,中胸背板发达,三角片前突,小盾片宽大于长,通常具2对刚毛和1对板状感觉器。中胸盾中叶一般具6-12根毛,呈对称排列。每盾侧叶2-3根毛,每三角片1根毛,两三角片间的距离大于一个三角片长度。后胸背板窄。并胸腹节横向,中间窄,两端各有一个气门。前后翅各一对,前翅亚缘脉较缘脉短,通常2根毛。翅基室具4-10根毛。后翅窄小。足跗节5节,少数种类中足跗节为4节。产卵器稍微突出腹部末端。 恩蚜小蜂属建立于1878年,目

10、前全世界已知种类413种,是蚜小蜂科中最大的一个属。恩蚜小蜂属是介壳虫和粉風的主要寄生蜂,少数寄生厨虫,某些种类的雄性也可寄生鳞翅目的卵,或者为重寄生。在属阶元分类上,恩蚜小蜂属是小蜂科中异名较多、分类较难的1个属。迄今为止,恩蚜小蜂属已有413个种被描述,但据估计还有较多的种类未被描述。种团分类系统是恩蚜小蜂属的种分类鉴定的重要基础,目前,被描述的恩蚜小蜂属种类主要被分为26个种团,其中大多数种类包含在 aurantii, inaron, lahorensis, luteala, opulenta, parvella strenua 种团中,但仍有78个种未能归到相应的种团。1.2序列比对

11、序列比对需要确定基因位点的同源关系,并分析序列中位点插入、缺失的过程,是序列分析的基础。多序列比对结果不会绝对的正确,只是反映了在多大程度上序列之间的相似性关系。采用不同的比对方法和结果,所得到的系统发育树可能不同。目前,序列比对方法主要为手工比对和自动比对。但是,如果序列间的相似性低于50%,我们无法进行手工比对。CLUSTAL X是目前最流行的自动比对程序。自动比对过程中可以进行手人工调整。1.3系统发育树的构建方法系统发育树是用来概括各种生物之间亲缘关系的树状分支图形。进化树的拓扑结构依靠的算法有独立元素法和距离依靠法两类。独立元素法指进化树的拓扑形状是由序列上的碱基的状态决定的,如ML

12、、ME。距离依靠法指两两序列的进化距离决定树的拓扑形状,树枝的长度表示进化距离,如:NJ、UPGMA。目前最常用的系统发育树方法主要有:邻接法、最小进化法、最大似然法。由于多种因素会影响系统发育树的构建,因此具体分析时应使用多种方法来构建可靠性更高的系统发育树。 邻接法(NJ法)在距离建树中常用到,是建树最快的算法。这种方法在个人计算机上可以一次性处理大量的序列信息,并且可以方便地进行自展检验。其建树的步骤是连续不断地在最孤立的两序列中插入树枝,并且保留树的终端。因此,巩固了最接近的一对序列,这个过程不断地被重复。NJ法是一个完全基于算法的建树方法,并且只得到一个进化树。NJ法可以满足于仅为了

13、简单聚类的分子鉴定,而不适用于研究物种的进化地位。 最小进化方法(ME法)是通过把所有距离相对于进化树的路径长度的偏差极小化,将进化树中双重距离的合适度极大化,根据进化路径长度的差异优化出最短、最优的进化树。目前ME法在构建系统发育树的研究中越来越流行。 最大似然方法(ML法)是比对给定序列的每个碱基位点,计算其碱基频率,从而得出似然值。通过位点的似然值计算得到整个树的似然值,因此似然值越高,进化树越好。ML法会花费大量的计算时间,但其建树效果比NJ法、ME法要好。1.4 本论文研究目的与意义恩蚜小蜂属大部分种类是粉虱和介壳虫的重要天敌,对粉虱和介壳虫具有很好的控制作用。本文对恩蚜小蜂属的27

14、种序列进行比对和研究。研究结果将为恩蚜小蜂属的种类在害虫生物防治中的应用提供参考依据。本文以28SrDNA和COI的基因序列,利用生物信息学分析方法,探讨了恩蚜小蜂属的不同基因的组成特点,构建了该属部分种类的分子系统发育关系,旨在解决一些分类地位上有争议的种类,并希望为今后恩蚜小蜂属的分类研究提供分子生物学方面的依据。2 步骤与方法2.1序列比对 本次研究所用数据均来源于GenBank。从GenBank下载了恩蚜小蜂属的28S及COI基因的序列，同时下载两种同源序列作为外群，序列信息见表2.1表2.1恩蚜小蜂属的序列分析种名28S序列号COI序列号Encarsia haitiensisAY36

15、0217.1AY264343.1Encarsia nigricephalaAF254246.1AY264340.1Encarsia perplexaAF254245,1AF223371.1Encarsia qvercicolaAF254242.1KC870914.1Encarsia luteaAF254241.1KC870907.1Encarsia smithiAF254234.1KF017886.1Encarsia inaronAF254231.1GQ423484.1Encarsia adusta AF254230,1AB715248.1Encarsia accentsAF254228.1A

16、B715246.1Encarsia cibcensisAF254227.1AB715244.1Encarsia mineoiAF254226.1AB715240.1Encarsia pergandiellaAF254223.1JX531620.1Encarsia bimaculata AF254221.1noEncarsia meritoriaAF223367.1noEncarsia strenuaAY518548.1FJ483848.1Encarsia asterobemisiaeDQ830995.1noEncarsia scapeataDQ830992.1AF254237.1Encarsi

17、a californicaAJ547625.1noEncarsia arabicaAJ536052.1noEncarsia tricolorAJ305302.1noEncarsia dicbroaAJ305301.1noEncarsia estrellaeAJ305330.1noEncarsia heratyiHQ731041.1noEncarsia irisJF750724.1JF750719.1Aphytis melinusAF379902.1JQ083673.1Aphytis hispanicusAY635324.1JQ268913.1 将原序列进行BLAST同源性搜索,且所有序列的同源

18、性大于85%,可以确定所获得的序列均为恩蚜小蜂的目的基因序列。序列用CLUSTALX软件直接比对,调整序列同源区,使各序列长度相近。将结果保存为FASTA格式文件,以备系统发育树的构建。2.2 计算遗传距离依据K2P双参数模型计算遗传距离,并由同一物种的各个个体的序列计算出种内平均遗传距离。2.3 序列特征分析用MEGA5.0软件对恩蚜小蜂属28S、COI两种基因的比对结果进行分析。计算四种碱基A、T、C、G的组成比例、变异位点、保守位、碱基频率、简约信息位点。2.4 系统发育树的构建本试验采用最大似然法(ML)、最大简约法(ME)和邻接法(NJ) 3种建树方法,并使用MEGA5.0软件对不同

19、种类的恩讶小蜂的28S、COI构建系统发育树。(1)ML法建树如果进化模型选择合理,ML系统发育树是与真实进化树最接近。具体步骤为:在MEGA中打开待分析的后缀为.meg的文件,在Phylogeny的选项中选择构建ML系统发育树。(2)ME法建树在用MEGA5.0软件构建ME树时,采用wME法对三个数据组进行建树。先指定特定的外群,对28SrDNA数据组设置权重值为:转换/颠换=1:2;对COI数据集设置权重值为:转换/颠换=1:2,密码子三位点的权重值为:lst/2nd/3rd =1:1:1。采用Bootstrap (Bootstrap=1000)检验。具体步骤为:在MEGA中打开待分析的后

20、缀为.meg的文件,在Phylogeny的选项中选择构建ME系统发育树。(3)NJ法建树基于K2P双参数模型的NJ树计算速度最快,并可以在个人计算机上处理大量的序列,也比较容易进行自展检验。NG树非常适合不需要弄清物种进化地位,只需要简单聚类的分子鉴定。具体步骤为:在MEGA中打开待分析的后缀为.meg的文件,在Phylogeny旳选项中选择构建NJ系统发育树。3 结果与分析3.1 28SrDNA序列的分析3.1.1 28SrDNA序列核苷酸的组成用MEGA5.0软件对恩蚜小蜂28SrDNA序列进行核苦酸组成的分析。结果显示:序列全长为921个碱基，序列保守位点为3,占总位点数的0.55%;序

21、列变异位点为538,占总变异位点的99. 4%;简约信息位点为536,占序列总位点的99.1%。碱基A+T含量为43.5%,C+G为56.5%。平均长度CVPiSTCAG5443538536224.826.218.730.3 表3.1 28SrDNA序列的碱基情况 注:C:保守位点;V:变异位点;Pi:简约信息位点;S:自裔位点3.1.2 28SrDNA序列的碱基替换情况分析DNA序列的碱基替换包括转换(si)和颠换(sv)两种形式,是衡量碱基进化的重要依据。由碱基替换情况分析可知,在恩讶小蜂28SrDNA序列中,碱基替换率较大,其中转换数为113,颠换数为237,转换的频率是颠换频率的0.4

22、8倍。碱基的转换主要发生在TC间,由此可以认为恩蚜小蜂的28SrDNA的保守性较强。恩蚜小蜂属28SrDNA的种间遗传距离为1.039-4.172,平均种间遗传距离为2.807;其种内遗传距离为0-0.412,平均种内遗传距离为0.209。个体之间的种间遗传距离明显大于种内遗传距离的10倍,与Hebert的研究结果一致。表3.2恩蚜小蜂属28S基因基于Kimura 2-parameter参数校正距离（下三角）和标准差（上三角）Encarsia_Forster0.020.000.010.020.020.020.020.020.020.020.020.020.020.020.020.020.010

23、.020.020.020.020.020.020.010.020.02Encarsia_haitiensis0.160.020.020.020.020.020.020.020.020.020.020.020.020.010.020.020.020.010.020.020.020.020.020.020.020.02Encarsia_nigricephala0.000.160.010.020.020.020.020.020.020.020.020.020.020.020.020.020.010.020.020.020.020.020.020.010.020.02Encarsia_perplexa

24、0.090.160.090.020.010.020.020.020.020.020.020.020.020.020.020.010.010.020.020.020.020.020.020.010.020.02Encarsia_quercicola0.120.190.120.110.020.020.020.020.020.020.020.020.020.020.020.020.010.020.020.020.020.020.020.010.020.02Encarsia_lutea0.110.160.110.070.120.020.020.020.020.020.020.020.020.020.0

25、20.010.010.020.020.020.020.020.020.010.020.02Encarsia_smithi0.120.170.120.110.130.130.010.020.020.010.020.010.020.020.020.020.010.020.010.020.020.020.010.020.020.02Encarsia_inaron0.140.180.140.130.130.140.100.010.010.020.020.020.020.020.020.020.020.020.010.020.010.010.020.020.020.02Encarsia_adusta0.

26、150.190.150.130.150.160.120.030.010.020.020.020.020.020.020.020.020.020.020.020.010.010.020.020.020.02Encarsia_accenta0.140.190.140.130.140.150.120.020.010.020.020.020.020.020.020.020.020.020.020.020.010.010.020.020.020.02Encarsia_cibcensis0.140.180.140.120.110.130.070.110.110.120.020.010.020.020.02

27、0.020.010.020.010.020.020.020.010.020.020.02Encarsia_mineoi0.140.180.140.130.140.150.160.180.200.190.180.020.020.020.020.020.020.020.020.020.020.020.020.020.020.02Encarsia_pergandiella0.150.180.150.150.130.150.070.110.130.130.080.170.020.020.020.020.020.020.010.020.020.020.010.020.020.02Encarsia_bim

28、aculata0.150.200.150.130.150.140.150.170.190.180.160.180.170.020.010.020.020.020.020.020.020.020.020.020.020.02Encarsia_meritoria0.160.070.160.140.170.150.160.170.190.190.170.180.190.210.020.020.020.010.020.020.020.020.020.020.020.02Encarsia_strenua0.160.210.160.160.170.170.190.180.200.200.200.220.2

29、10.080.230.020.020.020.020.020.020.020.020.020.020.02Encarsia_asterobemisiae0.100.150.100.060.110.010.130.140.150.140.130.140.150.140.150.170.010.020.020.020.020.020.020.010.020.02Encarsia_scapeata0.090.160.090.040.080.070.090.110.130.120.100.130.120.110.130.150.060.020.010.020.020.020.020.010.020.0

30、2Encarsia_californica0.160.070.160.130.170.150.160.170.190.190.170.180.180.210.010.230.150.130.020.020.020.020.020.020.020.02Encarsia_arabica0.110.170.110.120.120.120.040.090.110.110.070.170.070.160.160.190.120.090.160.020.020.020.010.020.020.02Encarsia_tricolor0.160.220.160.150.150.150.170.190.200.

31、190.190.120.180.180.210.230.140.140.210.180.020.020.020.020.020.02Encarsia_dichroa0.160.200.160.150.140.160.120.040.060.050.120.200.130.190.180.210.160.130.180.110.210.000.020.020.020.02Encarsia_estrellae0.150.190.150.150.140.160.120.040.060.050.120.200.130.180.180.210.150.130.180.110.210.010.020.02

32、0.020.02Encarsia_heratyi0.140.170.140.140.130.150.080.120.130.130.080.170.040.170.190.200.140.130.190.070.180.130.130.020.020.02Encarsia_iris0.100.160.100.070.110.080.120.130.130.120.120.130.150.150.150.180.080.080.150.120.150.150.150.140.020.02Aphytis_melinus0.250.300.250.230.230.260.240.250.260.26

33、0.260.270.250.270.300.290.250.230.300.260.270.270.260.250.240.02Aphytis_hispanicus0.210.270.210.200.200.220.230.230.240.230.230.220.240.260.250.270.220.200.250.230.240.240.240.240.200.173.2 COI序列的分析3.2.1 COI序列核苦酸的组成 用MEGA5.0软件对试验所得的COI序列进行核苷酸组成的分析。结果显示:序列保守位点为1,占总位点数的0.15%;序列变异位点为680,占总变异位点的99.7%;简约

34、信息位点为678,占序列总位点的99.4%。碱基A + T含量为77. 2%; C + G 为22.7%。3.2.2 COI序列的械基替换情况分析 由碱基替换情况分析可知,在恩蚜小蜂属COI序列中,碱基替换率也较大,其中转换数为99,颠换数为284,转换的频率是颠换频率的0.35倍。碱基的颠换主要发生在AT,由此可以认为恩姆小蜂属COI序列的变异性较强。恩蚜小蜂属COI的种内遗传距离为0.072-0.162,平均为0.117;其种间遗传距离为1.436-40547,平均为2.992。个体之间的种间遗传距离明显大于种内遗传距离的10倍,与Hebert的研究结果一致。表3.3 28SrDNA序列的

35、碱基情况平均长度CVPiSTCAG6821680678235.912.241.310.5 注:C:保守位点;V:变异位点;Pi:简约信息位点 表3.4 恩蚜小蜂属CO1基因基于Kimura 2-parameter参数校正距离（下三角）和标准差（上三角）Encarsia_haitiensis0.010.030.030.030.030.030.030.030.030.030.030.030.030.030.03Encarsia_nigricephala0.040.030.030.030.030.030.030.030.030.030.030.030.030.030.03Encarsia_perpl

36、exa0.750.750.030.030.000.030.030.030.030.030.030.020.030.030.03Encarsia_qvercicola0.610.590.720.010.030.020.030.030.030.030.030.030.030.020.02Encarsia_lutea0.620.610.720.040.030.020.030.030.030.030.030.030.030.020.02Encarsia_smithi0.750.750.000.720.720.030.030.030.030.030.030.020.030.030.03Encarsia_

37、inaron0.640.620.720.110.130.720.030.030.030.030.030.030.030.020.02Encarsia_adusta0.640.650.610.630.640.610.640.030.030.030.030.030.030.030.03Encarsia_accents0.690.690.670.700.700.670.700.650.030.030.030.030.030.030.03Encarsia_cibcensis0.660.670.650.690.690.650.690.630.720.030.030.030.030.030.03Encar

38、sia_mineoi0.720.700.740.700.710.740.710.700.740.690.030.030.030.030.03Encarsia_pergandiella0.680.670.720.680.680.720.650.670.700.680.740.030.030.030.03Encarsia_scapeata0.730.730.160.700.710.160.720.570.650.640.740.720.030.030.03Encarsia_strenua0.610.610.680.640.630.680.680.640.710.650.670.690.670.03

39、0.03Aphytis_melinus0.630.610.750.080.110.750.100.640.710.690.680.660.710.660.02Aphytis_hispanicus0.610.600.760.110.130.760.140.640.700.700.710.670.750.660.113.3 恩蚜小蜂属的系统发育分析 3.3.1 用最大似然法(ML)建树图3.1 基于Kimura 2-parameter参数建立的恩蚜小蜂属28SrDNA的ML树图3.2 基于Kimura 2-parameter参数建立的恩蚜小蜂属CO1的ML树3.3.2 用相邻连接方法(NJ)建树图

40、3.3 基于p-distance参数建立的28SrDNA的NJ树3.3.3 用最小进化法(ME)建树图3.4 基于Kimura 2-parameter参数建立的28SrDNA的ME树图3.5 基于Kimura 2-parameter参数建立的恩蚜小蜂属CO1的ME树4 小结与讨论以恩蚜小蜂属28S rDNA序列和CO1基因序列对恩蚜小蜂部分种系统发育关系进行综合研究，其研究结果与形态学研究结果可能会有不同，研究中分歧的产生可能与本研究所取的物种数量不足、所选物种差异大、分子序列较短、测得的片段中所含信息量有限等因素有关，仍需今后做更深入全面的研究。本实验旨在熟悉构建系统发育树的方法过程。在该实

41、验中仅选取了恩蚜小蜂属的3个科，共27个种，因此具有一定的局限性。在今后的研究中，应该扩大实验样本的种类和数量，使分类单元更具有全面性、代表性，同时延长目的基因序列的长度，得到全长，尽量利用其全部遗传信息，防止部分序列变异的不均衡性，力求得到符合客观规律的最佳实验结果，使得研究工作更全面、透彻、深入。5参考文献1 任保青,陈之瑞.植物DNA条形码技术J植物学报,2010,45(1):1-12.2 肖金花,肖辉,黄大卫.生物分类学的新动向-DNA条形码J.动物学报,2012: 852-855.3 黄建.中国蚜小蜂科分类M.重庆出版社,1994:193-195.4 Chou L Y,Su Y S,

42、Chou K C9et aL Two new species of Encarsia from Taiwan. Plant Protection Bulletin (Taiwan)J. 2010,38:137-142.5 Herafy J M. Molecular Systematics Chalcidoidea and Biological Control. In: Genetics and Evolution in Biological ControlJ.CAB Internation -al,2004:39-71.6王德明,林扬.线粒体DNA基因序列在昆虫分子系统学研究中的应用J.东农业

43、科学, 2010(06):188-190.7Zhou Y, 1998. Classification and Identification of Chinese Butterflies.Zhengzhou: Henan Scientific and Technological Publishing House.8 Camacho JPM, Cabrero J, Viseras E. C-heterochromatin variation in the genus Eumigus(Orthoptera: Pamphagoidea)J. Genetica-(Dordrecht), 2001, 56(3):185-188.- 13 -