分子流行病学课件

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1、分子流行病学分子流行病学Molecular Epidemiology Contents1.Introduction2.Research methods3.Brief introduction to common laboratory techniques4.Utilization of molecular epidemiology5.Example for molecular epidemiological researches6.Prospect (look into the future) Section one Introduciton 一、分子流行病学的概念及其发展一、分子流行病学的概

2、念及其发展 Definition and progresses of molecular epidemiology （一）分子流行病学的概念（一）分子流行病学的概念 Definition of molecular epidemiology 分子流行病学分子流行病学(molecular epidemiology)是应用是应用分子生物学的基本理论和技术，研究疾病或健康的分子生物学的基本理论和技术，研究疾病或健康的人群现象。它从分子水平揭示影响疾病或健康分布人群现象。它从分子水平揭示影响疾病或健康分布的因素，为更有效地控制疾病和促进健康提供基因的因素，为更有效地控制疾病和促进健康提供基因或分子水平的

3、研究方法和防治手段。或分子水平的研究方法和防治手段。 概念的演变：概念的演变： 近近20年来分子生物学被引入流行病学研究领域。年来分子生物学被引入流行病学研究领域。 使流行病学研究中的组间比较更为准确；使流行病学研究中的组间比较更为准确； 对发病机制的认识更为明确；对发病机制的认识更为明确； 对暴露与疾病发生过程的研究更为精确。对暴露与疾病发生过程的研究更为精确。 目前，分子流行病学成为现代流行病学的一个重目前，分子流行病学成为现代流行病学的一个重要组成部分。要组成部分。 最早使用最早使用“分子流行病学分子流行病学”这一术语的是这一术语的是Kilboure，他于他于 1972年用分子生物学技术

4、探讨了流感病毒抗原变年用分子生物学技术探讨了流感病毒抗原变异与流感大流行之间的相互关系，旨在通过研究病毒异与流感大流行之间的相互关系，旨在通过研究病毒分子结构，来阐明流感发生大流行的原因。分子结构，来阐明流感发生大流行的原因。 但作者并未解释但作者并未解释“分子流行病学分子流行病学”的涵义。之后有的涵义。之后有关学者相继使用这一术语，不断有一些解释。关学者相继使用这一术语，不断有一些解释。 1993年年Schulte出版了第一部分子流行病学专著，出版了第一部分子流行病学专著，并给分子流行病学定义为，并给分子流行病学定义为，“在流行病学研究中，应在流行病学研究中，应用生物学标志物，包括生化的、分

5、子的、生理学的、用生物学标志物，包括生化的、分子的、生理学的、免疫学的、遗传学的等信号，这些事件信号代表致免疫学的、遗传学的等信号，这些事件信号代表致病因子与所致疾病之间连续过程中一个个相关的环病因子与所致疾病之间连续过程中一个个相关的环节。节。” （二）血清流行病学定义（二）血清流行病学定义 血清流行病学血清流行病学(seroepidemiology)(seroepidemiology)是应是应用血清学方法检测人群中特异性抗原、抗体用血清学方法检测人群中特异性抗原、抗体、各种代谢产物、遗传标记、生化指标、营、各种代谢产物、遗传标记、生化指标、营养成分等血液成分，借以了解疾病或健康状养成分等血

6、液成分，借以了解疾病或健康状况在人群中的分布及其影响因素，探讨疾病况在人群中的分布及其影响因素，探讨疾病发生的原因并评价预防措施的效果。血清流发生的原因并评价预防措施的效果。血清流行病学是流行病学的一个重要分支之一。行病学是流行病学的一个重要分支之一。 血清流行病学有狭义和广义之分。血清流行病学有狭义和广义之分。 而广义上的血清流行病学实际上由于分而广义上的血清流行病学实际上由于分子流行病学的迅猛发展，已逐步融入分子流子流行病学的迅猛发展，已逐步融入分子流行病学之中，实际上已属于分子流行病学的行病学之中，实际上已属于分子流行病学的研究范畴。所以，我们不再将血清流行病学研究范畴。所以，我们不再将

7、血清流行病学单作一章介绍，而是并于分子流行病学这一单作一章介绍，而是并于分子流行病学这一章中一并介绍，更具实际意义，也更有助于章中一并介绍，更具实际意义，也更有助于读者对分子流行病学的理解。读者对分子流行病学的理解。 二、与传统流行病学的关系二、与传统流行病学的关系 Relationship between conventional and molecular epidemiology 分子流行病学就是要揭开暴露与疾病之间分子流行病学就是要揭开暴露与疾病之间的的“黑匣子黑匣子”之谜。之谜。 三、分子流行病学的发展三、分子流行病学的发展 Progress of molecular epidemi

8、ology 分子生物学技术的不断发展：分子生物学技术的不断发展： 1分子流行病学的研究方法越来越多分子流行病学的研究方法越来越多： 如在分子流行病学产生的初期，主要研究手段是质粒如在分子流行病学产生的初期，主要研究手段是质粒图谱分析、核酸杂交等技术，且程序烦琐、费事费力，目图谱分析、核酸杂交等技术，且程序烦琐、费事费力，目前许多新的技术已应用于分子流行病学研究，且可自动化前许多新的技术已应用于分子流行病学研究，且可自动化或半自动化测定，如聚合酶链反应（或半自动化测定，如聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）、）、DNA序列分析、酶定量分析等等。序列分析、酶定

9、量分析等等。 2研究内容越来越多研究内容越来越多：已从研究传染病的病原体、：已从研究传染病的病原体、传染源、传播途径，逐渐延伸至非传染性疾病或健康状态，传染源、传播途径，逐渐延伸至非传染性疾病或健康状态，以及人群易感性和疾病预防、治疗措施的评价等等。以及人群易感性和疾病预防、治疗措施的评价等等。 3应用范围越来越大应用范围越来越大：从预防医学到整个生命科学。：从预防医学到整个生命科学。 Section two Research methods 一、生物标志的确定与标本采集一、生物标志的确定与标本采集 Determination of biomarkers and collection of s

10、pecimens （一）生物标志的确定（一）生物标志的确定(determination of biomarkers) 生物标志生物标志(biomarker)分为三大类，即暴露标志分为三大类，即暴露标志(exposure marker)、效应标志、效应标志(effect marker)和易感标志和易感标志(susceptibility marker)。 这三类标志只不过是些笼统指标，具体到某一种这三类标志只不过是些笼统指标，具体到某一种疾病或健康状况，应根据研究内容与目的确定与之密疾病或健康状况，应根据研究内容与目的确定与之密切相关连的具体标志。切相关连的具体标志。 1.暴露标志的选择暴露标志的

11、选择 (selection of exposure markers) 应选择那些最具代表暴露剂量而又十分客观、稳定、应选择那些最具代表暴露剂量而又十分客观、稳定、敏感、特异的标志。敏感、特异的标志。 暴露标志是指那些与疾病或健康有关的暴露因素的暴露标志是指那些与疾病或健康有关的暴露因素的 生物标志，包括外暴露标志和内暴露标志。生物标志，包括外暴露标志和内暴露标志。 外暴露标志外暴露标志(external exposure marker)：暴露因素暴露因素进入机体之前的标志，如病毒、细菌、支原体等微生物及进入机体之前的标志，如病毒、细菌、支原体等微生物及毒素、粉尘、烟雾、化学致癌物等。毒素、粉尘

12、、烟雾、化学致癌物等。 内暴露标志内暴露标志(internal exposure marker) ：暴露因素暴露因素进入机体之后的标志。进入机体之后的标志。 2.效应标志的选择效应标志的选择 (selection of effect markers) 机体在暴露于有关危险因子以后到疾病发生这期机体在暴露于有关危险因子以后到疾病发生这期间，会产生与之相对应的生物学效应间，会产生与之相对应的生物学效应(biological effect)或称为生物学反应或称为生物学反应 (biological response)。因此。因此，可以产生功能性或结构性变化的生物标志，如发生，可以产生功能性或结构性变化

13、的生物标志，如发生变异的基因、产生的特异性产物等。变异的基因、产生的特异性产物等。 应选择那些最能代表生物学效应实际情况的标应选择那些最能代表生物学效应实际情况的标志，且同样应具特异、敏感、简便等优点。志，且同样应具特异、敏感、简便等优点。 3.易感标志的选择易感标志的选择 (Selection of susceptibility marker) 易感标志是指机体对疾病发生、发展易感程度易感标志是指机体对疾病发生、发展易感程度的生物标志。的生物标志。 在确定易感人群时，通常选择免疫学指标和在确定易感人群时，通常选择免疫学指标和易感基因作为易感测定标志。易感基因作为易感测定标志。 （二）标本的采

14、集（二）标本的采集(Collection of specimens) 标本的采集、运送和储存是实验室分析标本的采集、运送和储存是实验室分析的第一步，也是很关键的一步。为了采集高的第一步，也是很关键的一步。为了采集高质量的标本，应注意以下几个问题：质量的标本，应注意以下几个问题： 1.采集最适标本采集最适标本 (Collection of optimal specimens) 首要问题是有的放矢，一般根据已有流行病首要问题是有的放矢，一般根据已有流行病学资料和疾病的临床表现进行分析，初步推断可学资料和疾病的临床表现进行分析，初步推断可能是哪类疾病，再根据发病规律和病程决定采集能是哪类疾病，再根据

15、发病规律和病程决定采集何种标本。何种标本。可以从以下几个方面考虑取材部位：可以从以下几个方面考虑取材部位： 从病原体入侵部位取材；从病原体入侵部位取材； 从病原体感染的靶器官取材；从病原体感染的靶器官取材； 根据病原体的排泄途径取材；根据病原体的排泄途径取材； 非传染性疾病主要从受损组织取材或其它非传染性疾病主要从受损组织取材或其它能反映效应指标的标本；能反映效应指标的标本； 直接采集病原标本。直接采集病原标本。 此外，根据疾病的种类、病情采集标本。有此外，根据疾病的种类、病情采集标本。有的疾病需要在发病的早期采集标本，有的则需要的疾病需要在发病的早期采集标本，有的则需要在早期和晚期采集标本。

16、在早期和晚期采集标本。常采集的标本有：常采集的标本有： 病原体标本；病原体标本； 体液标本，体液标本，如血液、尿液、胃液、精液、如血液、尿液、胃液、精液、分泌物等；分泌物等； 组织标本，组织标本，如机体各种组织、毛发、如机体各种组织、毛发、媒介体等。媒介体等。 2.标本的运送与储存标本的运送与储存 (Transport and storage of specimens) 标本采集后应尽快送往实验室，马上检测最好标本采集后应尽快送往实验室，马上检测最好，如不能马上进行应注意适当保存。根据情况可采取如不能马上进行应注意适当保存。根据情况可采取冷冻、冷藏运输，以保持活性。冷冻、冷藏运输，以保持活性。

17、 采集的标本应放入适当的容器，采集的标本应放入适当的容器，以不易损坏和以不易损坏和泄漏，特别是烈性病原体标本，应加金属套罐，派泄漏，特别是烈性病原体标本，应加金属套罐，派专人专车运送。专人专车运送。 采集的标本除了防止扩散，采集的标本除了防止扩散，也应防止被污染包也应防止被污染包括生物性的、化学的或其它标本的污染。括生物性的、化学的或其它标本的污染。 采集的标本储存后应不影响检测结果，采集的标本储存后应不影响检测结果，即在任即在任何时间检测都可获得一致的结果。何时间检测都可获得一致的结果。 所有的标本都应有详细的记录和标签所有的标本都应有详细的记录和标签等。等。 二、常用实验室方法二、常用实验

18、室方法(Common lab methods) （一）核酸研究方法（一）核酸研究方法(Research methods of nucleic acid) 随着分子生物学和分子遗传学的发展，人们随着分子生物学和分子遗传学的发展，人们清楚地了解到生物的任何性状（表型）是由于其清楚地了解到生物的任何性状（表型）是由于其本身的遗传物质本身的遗传物质 核酸（核酸（DNA或或RNA）所决）所决定的。对于核酸的分析最能客观地反映各种生物定的。对于核酸的分析最能客观地反映各种生物现象（效应）的本质。现象（效应）的本质。 1.核酸中碱基含量的测定核酸中碱基含量的测定 (Assay of basyl conten

19、t in nucleic acid) 常用的是常用的是G+C含量的测定。亲缘关系近的含量的测定。亲缘关系近的病原体，它们的病原体，它们的G+C含量相同或近似，亲缘关含量相同或近似，亲缘关系远的病原体，它们的含量不同。系远的病原体，它们的含量不同。 因此，可用于传染病传染源和传播途径的因此，可用于传染病传染源和传播途径的分析。但在某些情况下，分析。但在某些情况下，G+C含量相同或近似含量相同或近似的病原体其亲缘关系不一定近似。因为上述分的病原体其亲缘关系不一定近似。因为上述分析只反映了核酸的核苷酸组成，并不能反映核析只反映了核酸的核苷酸组成，并不能反映核苷酸序列。苷酸序列。 2.核酸电泳和限制性

20、内切酶图谱分析核酸电泳和限制性内切酶图谱分析 (Nucleic acid electrophoresis and restriction enzyme analysis) 某些病原体，如引起腹泻的轮状病毒，它们的核某些病原体，如引起腹泻的轮状病毒，它们的核酸是分节段的，直接提取核酸即可进行琼脂糖凝胶电酸是分节段的，直接提取核酸即可进行琼脂糖凝胶电泳，产生特定的电泳带，每一型的轮状病毒的电泳带泳，产生特定的电泳带，每一型的轮状病毒的电泳带具有特定的数目和大小、分布特征等。具有特定的数目和大小、分布特征等。 其它大多数病原体或生物标本的核酸，可用限制其它大多数病原体或生物标本的核酸，可用限制性内切

21、酶酶切消化以后，再进行电泳分析，不同的病性内切酶酶切消化以后，再进行电泳分析，不同的病原体或生物标本产生不同电泳图谱。原体或生物标本产生不同电泳图谱。 图2 T-A克隆后酶切鉴定结果 Fig 2 Enzyme digestion analysis of T-A control clone fragment of JR23 strain 3.核酸杂交核酸杂交 (nucleic acid hybridyzation) 核酸杂交需要一个探针核酸杂交需要一个探针(probe)，即一种标有示踪，即一种标有示踪分子的特异单链分子的特异单链 DNA 或或 RNA分子，这种探针分子，这种探针可与待测标本中的特

22、异性序列结合。可与待测标本中的特异性序列结合。 常用于生物标本中病原体特异核苷酸序列常用于生物标本中病原体特异核苷酸序列的检测。的检测。 常用的有斑点杂交、原位杂交、转印杂交常用的有斑点杂交、原位杂交、转印杂交等方法。等方法。 4.寡核苷酸指纹图寡核苷酸指纹图 (oligonucleotide finger printing) 病原体或生物标本的核酸经特定的酶消化病原体或生物标本的核酸经特定的酶消化后，可进行双向电泳，然后再进行放射自显影，后，可进行双向电泳，然后再进行放射自显影，显示出一定的图谱特征，称为指纹图显示出一定的图谱特征，称为指纹图 (finger printing)。此图谱具有特

23、异性。此图谱具有特异性。 常用于微生物同源性分析。常用于微生物同源性分析。 5.质粒图谱分析质粒图谱分析(plasmid figure analysis) 不同的细菌的质粒不同的细菌的质粒DNA不同，因此可对不同，因此可对质粒质粒DNA进行酶切反应、电泳、图谱分析。进行酶切反应、电泳、图谱分析。 常用于微生物同源性分析。常用于微生物同源性分析。 6. PCR(polymerase chain reaction) PCR是一种是一种80年代初发展起来的一种高效年代初发展起来的一种高效体外基因体外基因DNA扩增技术，需要一对寡核苷酸引扩增技术，需要一对寡核苷酸引物（上游和下游各一），在耐热的物（上

24、游和下游各一），在耐热的DNA多聚酶多聚酶的作用下，合成特异的的作用下，合成特异的DNA序列，包括高温变序列，包括高温变性、低温退火、中温引物延伸三个步骤，这三性、低温退火、中温引物延伸三个步骤，这三个步骤反复循环，在短时间内可扩增至几百万个步骤反复循环，在短时间内可扩增至几百万倍。倍。 此法具有高度特异、敏感、快速、简便等此法具有高度特异、敏感、快速、简便等优点。优点。 常用于基因扩增、克隆、标本中特异性核常用于基因扩增、克隆、标本中特异性核苷酸序列检测等。苷酸序列检测等。 7. DNA序列分析序列分析 (DNA sequencing) DNA序列分析有了很大的发展，常用双脱序列分析有了很大

25、的发展，常用双脱氧末端终止法。由于与计算机相结合产生了自氧末端终止法。由于与计算机相结合产生了自动化分析仪，使核酸序列分析变得非常简便、动化分析仪，使核酸序列分析变得非常简便、快速、准确、可靠。快速、准确、可靠。 该方法是所有核酸分析技术中最可靠的一该方法是所有核酸分析技术中最可靠的一种方法，可用于任何来源的两个或多个种方法，可用于任何来源的两个或多个DNA片片段之间核苷酸序列的比较。段之间核苷酸序列的比较。 所以，是追踪传染源、分析传播途径、阐所以，是追踪传染源、分析传播途径、阐明流行规律十分可靠的分子流行病学方法。明流行规律十分可靠的分子流行病学方法。 8.单链构象多态性分析单链构象多态性

26、分析 ( single-stranded conformation polymorphism,SSCP) 是将基因扩增产物变性为单链核酸，然后是将基因扩增产物变性为单链核酸，然后进行非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳（进行非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），），观察区带的迁移率。由于迁移率与核酸的构象观察区带的迁移率。由于迁移率与核酸的构象密切相关，只有一个核苷酸的突变就可以改变密切相关，只有一个核苷酸的突变就可以改变分子构象，因而表现在电泳迁移率上的差别。分子构象，因而表现在电泳迁移率上的差别。 此法可以检测基因突变。但不能确定基因此法可以检测基因突变。但不能确定基因变异的位点及方式，最后还需要

27、进行序列测定。变异的位点及方式，最后还需要进行序列测定。 SSCP可用于病原体和生物标本的研究。可用于病原体和生物标本的研究。 9.基因定点突变技术基因定点突变技术 (Site-directed mutagenesis) 此技术可随意在克隆的基因上进行突变，此技术可随意在克隆的基因上进行突变，然后测量突变后基因功能的改变。常用于基然后测量突变后基因功能的改变。常用于基因结构与功能的研究。因结构与功能的研究。 （二）蛋白质研究方法（二）蛋白质研究方法(Research methods of proteins) 只要有蛋白质在，就有基因在，蛋白质是只要有蛋白质在，就有基因在，蛋白质是基因表达的产物

28、，几乎所有生物体都具有蛋白基因表达的产物，几乎所有生物体都具有蛋白质，包括结构蛋白和功能蛋白。对蛋白质进行质，包括结构蛋白和功能蛋白。对蛋白质进行研究分析，实际上是间接地对其相对应的基因研究分析，实际上是间接地对其相对应的基因进行分析，因为蛋白质的氨基酸（进行分析，因为蛋白质的氨基酸（aa）顺序是）顺序是由相对应的核苷酸顺序决定的，因此蛋白质分由相对应的核苷酸顺序决定的，因此蛋白质分析也具有特异性。析也具有特异性。 蛋白质技术包括蛋白质技术包括PAGE、肽图分析、肽图分析(peptide mapping)、转印技术、色谱技术、测序技术等。、转印技术、色谱技术、测序技术等。 （三）酶学技术（三）

29、酶学技术(Enzymatic techniques) 大多数酶属于蛋白质，因此可以用分离大多数酶属于蛋白质，因此可以用分离蛋白质的方法分离酶，并可在特定条件下定蛋白质的方法分离酶，并可在特定条件下定性、定量测定其活性，同样也可以测其分子性、定量测定其活性，同样也可以测其分子量。量。 （四）免疫学技术（四）免疫学技术(Immunological techniques) 分子流行病学的研究中，常用分子免疫学分子流行病学的研究中，常用分子免疫学标记技术，如酶标记（标记技术，如酶标记（EIA）、荧光标记（）、荧光标记（FIA）、）、放射标记（放射标记（RIA）三大标记技术。）三大标记技术。 单克隆抗体

30、（单克隆抗体（McAb）技术的应用为免疫学）技术的应用为免疫学技术开辟了新的天地，不仅可以用于疾病的诊、技术开辟了新的天地，不仅可以用于疾病的诊、治，还可用于病原体同源性分析等。治，还可用于病原体同源性分析等。 （五）生物芯片技术（五）生物芯片技术(Biochip techniques) 生物芯片生物芯片(biochip)技术是近几年才发展起来的技术是近几年才发展起来的一种基于分子杂交原理的检测技术。它是通过缩微一种基于分子杂交原理的检测技术。它是通过缩微技术，根据分子间特异性地相互作用原理，将生命技术，根据分子间特异性地相互作用原理，将生命科学领域中不连续的分析过程集成于硅芯片或玻璃科学领域

31、中不连续的分析过程集成于硅芯片或玻璃芯片表面的微型分析系统，以便对细胞、蛋白质、芯片表面的微型分析系统，以便对细胞、蛋白质、基因或其它生物组分的准确、快速、大信息量的检基因或其它生物组分的准确、快速、大信息量的检测。测。 按照芯片上固化的生物材料的不同，可以将生按照芯片上固化的生物材料的不同，可以将生物芯片划分为基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片和物芯片划分为基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片和组织芯片。与传统的仪器检测相比，生物芯片有高组织芯片。与传统的仪器检测相比，生物芯片有高通量、微型化、自动化、成本低、防污染等优点。通量、微型化、自动化、成本低、防污染等优点。目前最成功的是基因芯片。目前最成功

32、的是基因芯片。 （六）其他技术（六）其他技术(other techniques) 分子流行病学应用的实验室技术很多，分子流行病学应用的实验室技术很多，除了上述介绍的技术外，还有各种色谱技术除了上述介绍的技术外，还有各种色谱技术、毛细管电泳技术、其他理化分析等实验室、毛细管电泳技术、其他理化分析等实验室技术。技术。 当然分子流行病学研究方法也离不开传当然分子流行病学研究方法也离不开传统流行病学的现场流行病学研究方法，即描统流行病学的现场流行病学研究方法，即描述性、分析性、干预性研究等（见有关章节述性、分析性、干预性研究等（见有关章节）。传统流行病学研究方法结合生物学标志）。传统流行病学研究方法结

33、合生物学标志检测，从分子或基因水平更深一层次揭示病检测，从分子或基因水平更深一层次揭示病因、致病机制等，是当前常用的分子流行病因、致病机制等，是当前常用的分子流行病学研究模式。学研究模式。 三、研究设计要点三、研究设计要点(Key points for research design) 分子流行病学研究设计，是在传统流行病学研究设计分子流行病学研究设计，是在传统流行病学研究设计的原理和模式的基础上，再考虑分子生物学技术或生物学的原理和模式的基础上，再考虑分子生物学技术或生物学标志的应用带来的有关问题。标志的应用带来的有关问题。 生物学标志是指代表生物生理、组织、细胞、亚细胞生物学标志是指代表生

34、物生理、组织、细胞、亚细胞以及大分子的可识别物质。如前所述，分子流行病学就是以及大分子的可识别物质。如前所述，分子流行病学就是要揭开暴露与疾病之间的要揭开暴露与疾病之间的“黑匣子黑匣子”之谜。之谜。 因此，因此，在进行分子流行病学研究设计时，首先应按照在进行分子流行病学研究设计时，首先应按照传统流行病学研究设计的一般要求，如明确的研究目的，传统流行病学研究设计的一般要求，如明确的研究目的，选择有代表性的样本及数量，各种对照组的设置，对照组选择有代表性的样本及数量，各种对照组的设置，对照组和实验组的可比性、方法的准确性、合适的资料统计分析和实验组的可比性、方法的准确性、合适的资料统计分析方法、偏

35、倚的控制等。方法、偏倚的控制等。 这些是流行病学研究的最基本要点，如果脱离这些要这些是流行病学研究的最基本要点，如果脱离这些要点，即使在研究中使用了先进的实验室技术，也得不到准点，即使在研究中使用了先进的实验室技术，也得不到准确的研究结果。确的研究结果。 以下几点供进行分子流行病学研究设计时参考。以下几点供进行分子流行病学研究设计时参考。 （一）明确研究目的（一）明确研究目的 进行研究设计时首先要明确该研究要解决的问题，进行研究设计时首先要明确该研究要解决的问题，确实做到有的放矢。确实做到有的放矢。 （二）选择客观准确的测定指标（二）选择客观准确的测定指标 研究中所选择的各种研究中所选择的各种

36、“标志标志”，必须是，必须是客观客观的、的、稳稳定定的和的和有代表性有代表性的测定指标，并且的测定指标，并且容易检测容易检测到。到。 生物学标志的选择是否恰当，决定着分子流行病生物学标志的选择是否恰当，决定着分子流行病学研究的成败。学研究的成败。 （三）选择科学的测定方法（三）选择科学的测定方法 所选择的测定方法应结合实验室条件，使用所选择的测定方法应结合实验室条件，使用简便简便快速、成熟可靠、被公认的测定方法快速、成熟可靠、被公认的测定方法。应用新的测定。应用新的测定方法时，应注意所得结果和其他方法所得结果的可比方法时，应注意所得结果和其他方法所得结果的可比性。性。 （四）研究模式的选择（四

37、）研究模式的选择 流行病学研究设计模式一般分为描述流行病学、流行病学研究设计模式一般分为描述流行病学、分析流行病学和实验流行病学研究模式。不论那种研分析流行病学和实验流行病学研究模式。不论那种研究模式，都可以引入分子生物学理论和技术，构成分究模式，都可以引入分子生物学理论和技术，构成分子流行病学研究。子流行病学研究。 实验中应根据实际情况选择适当的研究模式。实验中应根据实际情况选择适当的研究模式。 （五）样本的选择（五）样本的选择 样本的选择是任何流行病学研究中不可避免的问题，样本的选择是任何流行病学研究中不可避免的问题，分子流行病学研究样本的选择其原理和方法与一般流行分子流行病学研究样本的选

38、择其原理和方法与一般流行病学研究设计相同，但对分子流行病学来说，样本及其病学研究设计相同，但对分子流行病学来说，样本及其大小的选择难度更大一点。大小的选择难度更大一点。要特别注意样本来源的地区、要特别注意样本来源的地区、人群、遗传因素和环境因素的交互作用。人群、遗传因素和环境因素的交互作用。 （六）质量控制（六）质量控制 质量控制是分子流行病学研究设计中一个重要部分，质量控制是分子流行病学研究设计中一个重要部分，它直接关系到所得结果的准确性、可靠性、科学性和可它直接关系到所得结果的准确性、可靠性、科学性和可信性。信性。 1.一般性实验质量控制一般性实验质量控制 确定标本采集方案：确定标本采集方

39、案：包括采集部位、时间及方法；包括采集部位、时间及方法；标本采集后的贮存问题等；标本采集后的贮存问题等； 药品和试剂的选择：药品和试剂的选择：同一测定指标最好使用同一同一测定指标最好使用同一批号的药品和试剂。更换批号时应进行对比和标准化；批号的药品和试剂。更换批号时应进行对比和标准化； 实验方法的确定：实验方法的确定：对于同一种生物标志的测定要对于同一种生物标志的测定要用统一的方法；用统一的方法； 仪器设备的确定：仪器设备的确定：如无特殊情况，不要更换仪器。如无特殊情况，不要更换仪器。调校后一般不应重新调校；调校后一般不应重新调校； 操作要规范化：操作要规范化：每一实验步骤都要规范化，保证每一

40、实验步骤都要规范化，保证同一操作者或操作者之间的可重复性。同一操作者或操作者之间的可重复性。 2.设立多种对照设立多种对照 实验开始前就应设立好对照，一般应设以下对照：实验开始前就应设立好对照，一般应设以下对照： 标准对照（阳性对照）：标准对照（阳性对照）：是指含有待测或某种生物是指含有待测或某种生物标志，并已知其含量的生物标本；标志，并已知其含量的生物标本； 空白对照（阴性对照）空白对照（阴性对照）：是指不含待测或某种生物：是指不含待测或某种生物标志的生物标本；标志的生物标本； 重复对照（相关对照）：重复对照（相关对照）：是指来源于同一份待测生是指来源于同一份待测生物标本具有不同编号的多份生

41、物标本或与待测生物标本有物标本具有不同编号的多份生物标本或与待测生物标本有关系的生物标本。关系的生物标本。 3.预实验预实验 正式实验开始前应进行预实验，确保所用方法的正式实验开始前应进行预实验，确保所用方法的可重复性。一般包括本实验室内和实验室之间不同操可重复性。一般包括本实验室内和实验室之间不同操作者之间的交叉重复实验等。作者之间的交叉重复实验等。 4.误差、偏倚的控制误差、偏倚的控制 分子生物学技术虽然敏感、精确，但导致误差、分子生物学技术虽然敏感、精确，但导致误差、偏倚的因素也很多。包括偏倚的因素也很多。包括: 检测者本身、试剂、药品、材料、仪器等；检测者本身、试剂、药品、材料、仪器等

42、； 同一受检者的生理生化变化；同一受检者的生理生化变化； 人群中的生物遗传学差异等方面。人群中的生物遗传学差异等方面。 应针对具体环节制定详细的质控方法。应针对具体环节制定详细的质控方法。 （七）分析与总结（七）分析与总结 (Analyses and summary) 在研究设计中要预测研究结果，事先确定在研究设计中要预测研究结果，事先确定明确的资料统计分析方法，并拟定资料的总结、明确的资料统计分析方法，并拟定资料的总结、分析与报告的详细计划。分析与报告的详细计划。 Section three Common lab techniques 正确应用实验技术是分子流行病学研究成功的关键。正确应用实

43、验技术是分子流行病学研究成功的关键。 （一）生物标本中核酸的提取（一）生物标本中核酸的提取(Extraction of nucleic acid from biospecimens) 核酸携带有生物体的遗传物质，是生物体细胞的重要核酸携带有生物体的遗传物质，是生物体细胞的重要组成成分。组成成分。 基因分型、变异分析、多态性分析、基因序列分析等基因分型、变异分析、多态性分析、基因序列分析等是分子流行病学研究中非常重要的手段之一。但在进行这是分子流行病学研究中非常重要的手段之一。但在进行这些分析之前，首先要提取和纯化核酸。些分析之前，首先要提取和纯化核酸。 1. DNA的提取的提取(Extract

44、ion of DNA) 通过破坏细胞质和细胞核膜后，再除去蛋白质通过破坏细胞质和细胞核膜后，再除去蛋白质可获得基因组可获得基因组DNA。 基本过程：基本过程： （1）在）在EDTA和变性剂存在下加入蛋白酶和变性剂存在下加入蛋白酶K消消化除去蛋白质；化除去蛋白质； （2）用）用 RNA 酶除去酶除去 RNA； （3）用酚和氯仿抽提）用酚和氯仿抽提 DNA； （4）用乙醇和异丙醇把）用乙醇和异丙醇把 DNA从溶液中离心沉从溶液中离心沉淀出来。淀出来。 2. RNA的提取的提取 (Extraction of RNA) RNA提取的基本过程：提取的基本过程： 裂解细胞；裂解细胞； 除去蛋白质；除去蛋白

45、质； 提取核酸混合物；提取核酸混合物； 将将RNA与与DNA分离。分离。 （二）质粒（二）质粒DNA的提取的提取(Extraction of plasmid DNA) 一般首先培养足够量的细菌，先将所研究的一般首先培养足够量的细菌，先将所研究的质粒质粒 DNA 转化感受态细菌，然后进行克隆，培转化感受态细菌，然后进行克隆，培养扩增一定量后，提取质粒养扩增一定量后，提取质粒DNA进行其它分析。进行其它分析。 提取方法很多，其共同点是：提取方法很多，其共同点是： 离心沉淀细菌；离心沉淀细菌； 裂解细菌；裂解细菌； 除去细菌残壁、染色体除去细菌残壁、染色体DNA、RNA； 异丙醇沉淀质粒异丙醇沉淀质

46、粒DNA。 实际应用中，有小量提取法和大量提取法之实际应用中，有小量提取法和大量提取法之分。分。 （三）（三）DNA限制性内切酶酶切技术限制性内切酶酶切技术 (Restriction endonuclease technique of DNA) 限制性内切酶限制性内切酶(restriction endonuclease)是一类是一类能识别双链能识别双链 DNA 分子中特异核苷酸序列的分子中特异核苷酸序列的 DNA 水水解酶，是基因工程、基因诊断、解酶，是基因工程、基因诊断、DNA序列分析中常序列分析中常用的工具酶。用的工具酶。 因此，内切酶酶切技术是基因分子生物学中最因此，内切酶酶切技术是基因

47、分子生物学中最基本、最重要的技术。基本、最重要的技术。 限制性内切酶主要来自于原核细胞，每种酶都限制性内切酶主要来自于原核细胞，每种酶都有自己特定的反应条件如缓冲液、反应温度、作用有自己特定的反应条件如缓冲液、反应温度、作用时间等，根据研究目的可选用小量酶解反应，大量时间等，根据研究目的可选用小量酶解反应，大量酶解反应和双酶解反应等。然后进行琼脂糖凝胶电酶解反应和双酶解反应等。然后进行琼脂糖凝胶电泳，对酶切产物（泳，对酶切产物（DNA片段）进行鉴定分析。片段）进行鉴定分析。 表表1 限制性内切酶酶切反应的一般条件限制性内切酶酶切反应的一般条件条件条件反应类型反应类型小量小量(分析用分析用)大量

48、大量(制备用制备用)反应体积反应体积20 l根据需要根据需要DNA量量0.5-1.0 g根据需要根据需要酶用量酶用量1-2u/g DNA1-2u/g DNA10 x缓冲液缓冲液2l根据需要根据需要牛血清白蛋白牛血清白蛋白100 g/ml100 g/ml反应温度反应温度根据需要根据需要根据需要根据需要反应时间反应时间2 h2 h(可适当延长可适当延长) （四）（四）DNA重组技术重组技术(Recombination techniques of DNA DNA重组（重组（DNA recombination)是指将两个基是指将两个基因（或因（或 DNA 片段）经内切酶消化切割，互相交换片段）经内切酶

49、消化切割，互相交换连接形成新的连接形成新的DNA片段的过程。片段的过程。 常将目的基因插入质粒常将目的基因插入质粒 DNA 载体之中，进行载体之中，进行基因重组，基因定点突变分析，结构与功能关系的基因重组，基因定点突变分析，结构与功能关系的研究，其功能往往是通过基因表达来测定的。研究，其功能往往是通过基因表达来测定的。 DNA重组的方法主要有粘端连接法、平端连重组的方法主要有粘端连接法、平端连接法和平接法和平-粘连接法。粘连接法。具体采用何种方法，要根据具体采用何种方法，要根据目的基因末端的性质、载体目的基因末端的性质、载体 DNA 经内切酶切割后经内切酶切割后的性质来选择应用。的性质来选择应

50、用。 1.粘端连接法粘端连接法 粘端连接法有两种情况，主要取决于目的粘端连接法有两种情况，主要取决于目的DNA粘端粘端的性质。的性质。 目的目的DNA两端为相同的粘性末端：两端为相同的粘性末端：带有相同粘性带有相同粘性末端的目的末端的目的DNA可以克隆到具有匹配的相同粘性末端的可以克隆到具有匹配的相同粘性末端的线性质粒线性质粒DNA中。中。 优点：优点：目的目的DNA和质粒和质粒DNA连接处的酶切位点仍然连接处的酶切位点仍然保留。保留。 缺点：缺点：质粒质粒DNA容易自身环化，重组体可能带有目容易自身环化，重组体可能带有目的的DNA的串联拷贝，目的的串联拷贝，目的DNA可能反方向插入。可能反方

51、向插入。 目的目的DNA两端为非互补的粘性末端：两端为非互补的粘性末端：用两种不同的用两种不同的内切酶对目的内切酶对目的DNA进行消化时即可产生带有互补突出端的进行消化时即可产生带有互补突出端的DNA 片段。用同样的两种酶将质粒片段。用同样的两种酶将质粒 DNA 切开，这样载体切开，这样载体DNA末端和目的末端和目的DNA末端完全互补，在末端完全互补，在DNA连接酶的作用连接酶的作用下，二者就可形成重组体。下，二者就可形成重组体。 此法的优点是：此法的优点是： 原酶切位点仍然保留；原酶切位点仍然保留； 目的目的DNA只以一个方向插入至质粒只以一个方向插入至质粒DNA中，故此法中，故此法称为定向

52、克隆；称为定向克隆； 载体载体DNA末端不互补，不能自身环化。末端不互补，不能自身环化。 2.平端连接法平端连接法 某些内切酶不产生粘性末端，而是产生平某些内切酶不产生粘性末端，而是产生平端，也称顿性末端。有些情况下，目的端，也称顿性末端。有些情况下，目的 DNA虽经内切酶切割产生粘性末端，但在载体虽经内切酶切割产生粘性末端，但在载体DNA上找不到与之相匹配的酶切位点，这种情况下上找不到与之相匹配的酶切位点，这种情况下需将二者或其中之一的粘性末端补平，再采用需将二者或其中之一的粘性末端补平，再采用平端连接法连接。平端连接法连接。 平接法：平接法：目的目的DNA和载体和载体DNA的平端或粘性的平

53、端或粘性末端补齐后用末端补齐后用DNA连接酶连接。连接酶连接。 接头法：接头法：此法是利用核酸化学合成技术，合此法是利用核酸化学合成技术，合成一种含有特定酶切位点的双链成一种含有特定酶切位点的双链DNA片段（称为接片段（称为接头），再用头），再用DNA连接酶将接头连接到目的连接酶将接头连接到目的DNA的两的两端，然后用该内切酶切割成能与载体端，然后用该内切酶切割成能与载体DNA粘性末端粘性末端互补的粘性末端，最后将二者连接。互补的粘性末端，最后将二者连接。 此法适用于没有所需内切酶位点的目的此法适用于没有所需内切酶位点的目的DNA。 3.平平-粘连接法粘连接法 此法在目的此法在目的DNA和载体

54、和载体DNA只有一个匹配只有一个匹配酶切位点，又要考虑目的酶切位点，又要考虑目的DNA插入方向时使用，插入方向时使用，也属于定向克隆。此法优点是单方向插入，非也属于定向克隆。此法优点是单方向插入，非重组体克隆背景低。重组体克隆背景低。 上述各种方法建立的重组质粒上述各种方法建立的重组质粒DNA是否成是否成功需要鉴定。功需要鉴定。 常用方法有：常用方法有： 互补；互补； 插入失活；插入失活； 菌落原位杂交；菌落原位杂交； 限制性内切酶分析；限制性内切酶分析； DNA序列分析。序列分析。 实验中可根据具体情况来选择鉴定方法。实验中可根据具体情况来选择鉴定方法。 （五）（五）DNA的凝胶电泳的凝胶电

55、泳(Gel electrophoresis of DNA) 电泳技术是分子生物学领域中常用的实验技术。电泳技术是分子生物学领域中常用的实验技术。常用琼脂糖凝胶电泳和常用琼脂糖凝胶电泳和PAGE或或SDS-PAGE分离、分离、鉴定、纯化鉴定、纯化DNA或或RNA。 此法具有简便、快速、分辨率高等优点，并可此法具有简便、快速、分辨率高等优点，并可将分离片段（电泳带）从凝胶中回收用于将分离片段（电泳带）从凝胶中回收用于 DNA 重重组或克隆。组或克隆。 1.琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 (Agarose gel electrophoresis) 琼脂糖加热至琼脂糖加热至90-100即可熔化成透明液即

56、可熔化成透明液体，浇到电泳槽内，冷却后即可形成凝胶，用于体，浇到电泳槽内，冷却后即可形成凝胶，用于电泳，常用电泳，常用TAE作为电泳缓冲液。作为电泳缓冲液。 电泳时根据电泳时根据DNA片段大小确定凝胶浓度，一片段大小确定凝胶浓度，一般用般用0.8-1.0%。一般检测鉴定时，用常规琼脂糖。一般检测鉴定时，用常规琼脂糖凝胶电泳，要想从凝胶中回收凝胶电泳，要想从凝胶中回收DNA，需要低熔点，需要低熔点琼脂糖凝胶电泳，若要分析单链琼脂糖凝胶电泳，若要分析单链DNA，需要碱性，需要碱性琼脂糖凝胶电泳。琼脂糖凝胶电泳。 图图 3 pBSK+-NDV HN DNA琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 1：Marke

57、r；2,3,5,6,9,10,122,3,5,6,9,10,12：突变株；：突变株；4,7,8,114,7,8,11：野毒株野毒株 2.聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE PAGE分两种：分两种： 非变性非变性PAGE：非变性非变性PAGE用于分离纯用于分离纯化双链化双链DNA片段，缺点是不能测定片段，缺点是不能测定DNA的大小，的大小，因为迁移率受碱基组成和序列的影响，同样大因为迁移率受碱基组成和序列的影响，同样大小的小的DNA片段由于空间结构不同，其迁移率出片段由于空间结构不同，其迁移率出现差异。现差异。

58、变性变性PAGE：变性变性PAGE用于分离和纯化用于分离和纯化单链单链DNA片段，片段，DNA的迁移率与碱基组成和序的迁移率与碱基组成和序列有关，可用于列有关，可用于DNA序列分析，分离同位素标序列分析，分离同位素标记的探针等。记的探针等。 1 2 3 4 5 图图 4 风疹病毒风疹病毒E1基因表达产物基因表达产物SDS-PAGE（上清，考马斯亮蓝染色）（上清，考马斯亮蓝染色）1: Negative control GS1152: Plasmid control pGAPZA3: Low range protein marker4: Expression strain 15: Expressi

59、on strain 2 3.从凝胶中回收和纯化从凝胶中回收和纯化DNA (Recovery from gel and purificaiton of DNA) 在进行基因克隆、重组、探针标记等实验在进行基因克隆、重组、探针标记等实验中，需要从凝胶中回收中，需要从凝胶中回收DNA，回收的方法有：，回收的方法有： 低熔点琼脂糖法低熔点琼脂糖法 压碎浸泡法压碎浸泡法 透析袋洗脱法透析袋洗脱法 DEAE-纤维素膜法等。纤维素膜法等。 上述每种方法均有各自的使用范围、回收上述每种方法均有各自的使用范围、回收率和特点，应根据情况选择合适的回收方法。率和特点，应根据情况选择合适的回收方法。 （六）核酸杂交（

60、六）核酸杂交(Nucleic acid hybridization) 据据DNA碱基互补配对原理，先制备一条带有碱基互补配对原理，先制备一条带有标记的多核苷酸链作为探针标记的多核苷酸链作为探针,检测标本中与之相对检测标本中与之相对应的那条互补链，称为核酸杂交应的那条互补链，称为核酸杂交 ( nucleic acid hybridization)。 核酸杂交技术具有高度特异性，广泛用于对核酸杂交技术具有高度特异性，广泛用于对待测待测DNA或或RNA进行定性和半定量分析。进行定性和半定量分析。 核酸探针分为基因组核酸探针分为基因组DNA探针、探针、cDNA探针、探针、cRNA探针及人工合成的寡核苷

61、酸探针等。探针及人工合成的寡核苷酸探针等。实验实验时根据研究目的选择不同类型的探针。探针需用时根据研究目的选择不同类型的探针。探针需用标记物标记。标记物标记。 标记物一般分为放射性标记和非放射性标记。标记物一般分为放射性标记和非放射性标记。两种标记方法各有优缺点，放射性标记灵敏度和两种标记方法各有优缺点，放射性标记灵敏度和特异性高，但应用不当时放射性物质易造成环境特异性高，但应用不当时放射性物质易造成环境污染和人体损害，同时也比较昂贵。污染和人体损害，同时也比较昂贵。 所以，近年来非放射性标记方法越来越多，所以，近年来非放射性标记方法越来越多，并不断完善。放射性标记物有并不断完善。放射性标记物

62、有3H，14C，32P，35S，125I，131I等。非放射性标记物有生物素等。非放射性标记物有生物素(biotin)、地高辛地高辛(digoxigenin，Dig)、荧光素、荧光素(fluorescin)、标记金属等。标记金属等。核酸杂交方法很多，如：核酸杂交方法很多，如：斑点杂交斑点杂交(dot hybridization)原位杂交原位杂交(In-situ hybridization)Southern杂交杂交(Southern hybridization) Northern杂交杂交(Northern hybridization)等。等。 （七）聚合酶链反应（七）聚合酶链反应(polymer

63、ase chain reaction, PCR PCR 技术在分子流行病学研究中具有非常技术在分子流行病学研究中具有非常重要的地位。已被广泛地应用于体外基因扩增、重要的地位。已被广泛地应用于体外基因扩增、基因诊断、基因克隆、基因序列分析、基因定点基因诊断、基因克隆、基因序列分析、基因定点突变分析等。突变分析等。 优点是简便、快速、灵敏等。优点是简便、快速、灵敏等。 缺点是实验室污染问题，易出现假阳性。缺点是实验室污染问题，易出现假阳性。 基本原理是：基本原理是： 根据待测基因两端设计一对引物，即上游引物根据待测基因两端设计一对引物，即上游引物和下游引物，在标本中模板存在的情况下，和下游引物，在

64、标本中模板存在的情况下，耐热耐热DNA聚合酶聚合酶可利用四种可利用四种dNTP使引物沿着模板延伸。使引物沿着模板延伸。整个过程可分为整个过程可分为三个步骤三个步骤： 变性变性94-97 30-50S； 退火退火25-65 60-90S； 延伸延伸70-74 60-120S。 一般重复一般重复25-30个循环，即可进行琼脂糖凝胶电个循环，即可进行琼脂糖凝胶电泳。用杂交、泳。用杂交、PCR-SSCP、序列分析等对扩增产物进、序列分析等对扩增产物进行分析。行分析。 PCR技术不断发展和完善，并产生了一些改良技术不断发展和完善，并产生了一些改良的的PCR方法，如定量方法，如定量PCR、原位、原位PCR

65、、RT-PCR、免疫免疫PCR等等。等等。 （八）（八）DNA序列分析序列分析(DNA sequencing) DNA序列分析是鉴定基因一级结构、基因突变序列分析是鉴定基因一级结构、基因突变分析、突变株检测等研究的重要手段。测序方法很分析、突变株检测等研究的重要手段。测序方法很多，常用的是双脱氧末端终止法。多，常用的是双脱氧末端终止法。 基本原理：基本原理： 特异性引物和特异性引物和DNA模板相退火，在模板相退火，在DNA聚合酶作聚合酶作用下进行延伸反应，在用下进行延伸反应，在双脱氧核苷三磷酸（双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）作用下进行特异性链的终止，然后用作用下进行特异性链的终止，然后用PAG

66、E区分长度区分长度相差一个核苷酸（相差一个核苷酸（nt）的）的DNA，通过一定的显示阅读，通过一定的显示阅读nt序列。序列。 目前测序工作已与计算机相结合，趋向于自动化，目前测序工作已与计算机相结合，趋向于自动化，因此大量测序仪应运而生，并得到广泛应用。因此大量测序仪应运而生，并得到广泛应用。固定末端固定末端 ACGTTGCACGTA “A”反应反应 “C”反应反应 “G”反应反应 “T”反应反应 A AC ACG ACGTACGTTGCA ACGTTGC ACGTTG ACGTTACGTTGCACGTA ACGTTGCAC ACGTTGCACG ACGTTGCACGT PAGE： A C G T ACGTTGCACGTA ACGTTGCACGT ACGTTGCACG ACGTTGCAC ACGTTGCA ACGTTGC ACGTTG ACGTT ACGT ACG AC A DNA序列测定基本原理示意图序列测定基本原理示意图 （九）蛋白质的（九）蛋白质的SDS-PAGE及肽图分析及肽图分析(SDS-PAGE of proteins and peptide analysis) 1.SDS