何水林版基因工程分子克隆载体课件

《何水林版基因工程分子克隆载体课件》由会员分享，可在线阅读，更多相关《何水林版基因工程分子克隆载体课件（166页珍藏版）》请在装配图网上搜索。

1、在基因工程中，通常是把外源在基因工程中，通常是把外源DNA片断利用运载工片断利用运载工具送入生物细胞。携带外源基因进入受体细胞的这种工具送入生物细胞。携带外源基因进入受体细胞的这种工具叫做具叫做载体载体(Vector)。载体载体(Vector)载体的本质是载体的本质是DNA。经过人工构建的载体，不但能与外源基因相连接，导经过人工构建的载体，不但能与外源基因相连接，导入受体细胞，还能利用本身的调控系统，使外源基因在新入受体细胞，还能利用本身的调控系统，使外源基因在新细胞中复制以致功能的表达。细胞中复制以致功能的表达。 基因工程中常用的主要载体基因工程中常用的主要载体质粒(Plasmid)，主要指

2、人工构建的质粒噬菌体载体噬菌体载体 柯斯质粒 (cosmid)单链DNA噬菌体M13动物病毒人工染色体人工染色体 (artificial chromosome)载体的功能及特征载体的功能及特征载体的功能载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件为外源基因的扩增或表达提供必要的条件载体应具备的条件载体应具备的条件具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性） 具有合适的筛选标记具有合适的筛选标记 具有较具有较高的外源高的外源DNA的

3、载装能力的载装能力 具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点 pBR3224363 bp克隆载体克隆载体（cloning vector）对目的基因克隆，建立对目的基因克隆，建立DNA文库文库和和cDNA文库，其上有复制子即可文库，其上有复制子即可按功能分类按功能分类表达载体表达载体（expression vector）使目的基因在宿主细胞中表达，既有使目的基因在宿主细胞中表达，既有复制子，又有强启动子复制子，又有强启动子穿梭载体穿梭载体（shuttle vector）可以在

4、原核细胞中复制，也可在真可以在原核细胞中复制，也可在真核细胞中扩增和表达。核细胞中扩增和表达。第一节第一节 质粒质粒 （Plasmid）质粒质粒是一种独立于染是一种独立于染色体外的小分子环状色体外的小分子环状DNA，一般大小约，一般大小约106108D，可自身复制，可自身复制和表达。和表达。基因克隆载体的质粒基因克隆载体的质粒DNA分子，必定包括：分子，必定包括：复制基因、选择性记、克隆位点。复制基因、选择性记、克隆位点。 1质粒的基本特性质粒的基本特性 2质粒质粒DNA的分离纯化的分离纯化4重要的大肠杆菌质粒载体重要的大肠杆菌质粒载体 3质粒载体的构建及类型质粒载体的构建及类型 1.1质粒质

5、粒DNA的构型的构型 两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构，两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构，称为共价闭合环形称为共价闭合环形DNA（cccDNA），通常），通常呈现超螺旋的呈现超螺旋的SC构型构型 只有一条只有一条DNA链出现有一至数个缺口，称链出现有一至数个缺口，称为开环为开环DNA（ocDNA），此即），此即OC构型构型 线性分子线性分子DNA（IDNA），称为），称为L构型构型 1 质质 粒粒 的的 基基 本本 特特 性性 1.2质粒质粒DNA分子大小分子大小质粒宿主分子大小/kbpPbs蓝藻1.5ColE1大肠杆菌6.4ColV2大肠杆菌140Ti致癌农杆菌330左右PV21三叶

6、草根瘤菌700F大肠杆菌941.3质粒的自主复制性质粒的自主复制性质粒能利用寄主细胞的质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制复制系统进行自主复制质粒质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）的多少，质粒可分为两大复制类型：严紧型质粒（严紧型质粒（stringent plasmid）在宿主细胞中拷贝数少的质粒，在宿主细胞中拷贝数少的质粒，1数个拷贝数个拷贝松弛型质粒（松弛型质粒（relaxed plasmid）在宿主细胞中拷贝数多的质粒，在宿主细胞中拷贝数多的质粒，10个拷贝以上个拷贝以上低或单拷贝质粒的复

7、制必需由复制子本身编码一个低或单拷贝质粒的复制必需由复制子本身编码一个必不可少的顺式作用蛋白必不可少的顺式作用蛋白(repA)来对复制起点作正来对复制起点作正调控作用，如调控作用，如psc101等，同时其复制受宿主蛋白合等，同时其复制受宿主蛋白合成的影响。所以这些质粒的拷贝数不能通过诸如成的影响。所以这些质粒的拷贝数不能通过诸如氯氯霉素霉素等蛋白质合成抑制剂来增加拷贝数等蛋白质合成抑制剂来增加拷贝数1） 松弛复制型松弛复制型多拷贝质粒（多拷贝质粒（pMB1或或ColE1等）的复制不受宿等）的复制不受宿主菌蛋白合成的影响的影响；当蛋白质合成不主菌蛋白合成的影响的影响；当蛋白质合成不能进行时，复制

8、依然进行能进行时，复制依然进行2)严紧型复制严紧型复制How many copies can be replicated ?Negative controlpositive control answers Repressor model: cop factorAntisense RNA model: RNARNARep proteinpMBl/colEl复制子复制子pSC101复制子复制子 控制复制引物与模板的结合控制复制引物与模板的结合0-555 0 RNA-2 RnaseHOH RNA-2DNA / RNA primer for DNA replication +150此处复杂的此处复杂的

9、RNA二级结构的正确折叠是复制起始的关键二级结构的正确折叠是复制起始的关键RNA-108 bp RNase H 不能识别不能识别RNA-2, 不能形成不能形成primer 的3-OH -555 -4450RNA-RNA-RNA- 108 bp D.S. RNARNA-1 0 When RNA-2200-360Nt Rom gene expression, RNA- / RNA-D.S. repression RNA- / RNA- 不能形成不能形成primer的的 3-OH 促进促进 限限制制 63 aa ROP(Rom protein) RNA- 只能转录到只能转录到100-220 base

10、, 不能到达不能到达“0”原点原点 不能形成不能形成primer 的的3-OH0RNA和和RNA之间之间“亲吻复合亲吻复合物物”的放大。的放大。由由RNAI和和RNA形成稳定的复形成稳定的复合物通过抑制合物通过抑制RNA与与DNA稳定稳定杂交体的形成而阻止杂交体的形成而阻止DNA合成。合成。 与与Rom/Rop二聚体蛋白结合，二聚体蛋白结合，使使RNA I与与RNAll形成稳定的形成稳定的“亲吻亲吻”复合物。复合物。Rom RNAmodulator(调节器调节器)Roprepressor of primerPcopcopP/OrepreporiCopRep控制复制起始因子与复制起始位点（控制复

11、制起始因子与复制起始位点（ori）的结合）的结合质粒载体及其拷贝数质粒载体及其拷贝数质粒质粒 复制子复制子 拷贝数拷贝数 pBR322 及其衍生质粒 pMB1 1520 pUC 系列质粒及其衍生质粒 突变的 pMB1 500700 pACYC 及其衍生质粒 p15A10212pSC101 及其衍生质粒pSC101 5 ColE1ColE11520 两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性不相容性，它是指在第二个质粒导入后，在不涉及，它是指在第二个质粒导入后，在不涉及 DNA 限制系统时出现的现象。不相容的质粒一般都利限制系统时出现的现象。不相

12、容的质粒一般都利用同一复制系统，从而导致不能共存于同一宿主中。用同一复制系统，从而导致不能共存于同一宿主中。1.4质粒的不相容性质粒的不相容性以大肠杆菌的质粒为例：以大肠杆菌的质粒为例：ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容拥有相似的复制子结构，彼此不相容pSC101、F、RP4 拥有相似的复制子结构，彼此不相容拥有相似的复制子结构，彼此不相容p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容质粒的不相容性：质粒的不相容性：分子机制分子机制两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时

13、受到同一种拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同，拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同，两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定，拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定，因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一细胞内细胞内其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势1.5质粒质粒DNA的转移的转移 G细菌质粒细菌质粒接合型的质粒（

14、接合型的质粒（conjugative plasmid）非接合型的质粒（非接合型的质粒（non-conjugative plasmid）接合型质粒接合型质粒 能在天然条件下自发地从一个细胞转移到能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），如另一个细胞（接合作用），如F、Col、R质粒等质粒等如如Col、R的其它成员的其它成员非接合型质粒非接合型质粒 不能在天然条件下独立地发生接合作用不能在天然条件下独立地发生接合作用F质粒质粒大肠杆菌的某些品系的雄性或供体是被一个致育因子大肠杆菌的某些品系的雄性或供体是被一个致育因子（fertility factor）或性因子（）或性因子（sex

15、 factor）决定的）决定的F因子，因子，具有这种因子的能育品系记为具有这种因子的能育品系记为F，相当于雄性。不含这种，相当于雄性。不含这种致育因子致育因子F的品系记为的品系记为F，相当于雌性。，相当于雌性。 F+细胞的细胞的F因子通过接合管向因子通过接合管向F细胞转递细胞转递使使F变成变成F，F因子还可改变细胞表面的构造，以防因子还可改变细胞表面的构造，以防F细细胞间的接合。胞间的接合。 R质粒质粒也称抗药性因子。也称抗药性因子。R质粒质粒编码一种或数种抗菌素抗编码一种或数种抗菌素抗性基因，此种抗性通常能性基因，此种抗性通常能转移到缺乏该质粒的受体转移到缺乏该质粒的受体细胞，使后者也获得同

16、样细胞，使后者也获得同样的抗菌素抗性能力的抗菌素抗性能力 Col质粒：质粒：此类质粒编码有控制大肠杆菌素合成的基因，即所谓产生此类质粒编码有控制大肠杆菌素合成的基因，即所谓产生大肠杆菌素因子。大肠杆菌素是一种毒性蛋白，它可以使大肠杆菌素因子。大肠杆菌素是一种毒性蛋白，它可以使不带不带Col质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死。质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死。 1.6 携带特殊的遗传标记携带特殊的遗传标记野生型的质粒野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括

17、：物质抗性物质抗性 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物物质合成物质合成 抗生素、细菌毒素、有机碱抗生素、细菌毒素、有机碱这些标记基因对这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义重组分子的筛选具有重要意义按其用途可将按其用途可将标记基因分为标记基因分为选择标记基因选择标记基因筛选标记基因筛选标记基因用于鉴别目标用于鉴别目标 DNA （载（载体）的存在，将成功转化体）的存在，将成功转化了载体的宿主挑选出来了载体的宿主挑选出来可用于将特殊表型的重可用于将特殊表型的重组子挑选出来。组子挑选出来。 1.6.1 选择标记选择标记氨苄青霉素抗性基因氨苄青霉素抗性

18、基因（Ampicillin resistance gene, ampr）四环素抗性基因四环素抗性基因（Tetracycline resistance gene, tetr） 氯霉素抗性基因氯霉素抗性基因（chloramphenicol resistance gene, Cmr, cat） 卡那霉素和新霉素抗性基因卡那霉素和新霉素抗性基因（kanamycin/neomycin resistance gene, kanr, neor） 琥珀突变抑制基因琥珀突变抑制基因 supF蔗糖致死基因蔗糖致死基因 SacB 氨苄青霉素抗性基因氨苄青霉素抗性基因（Ampicillin resistance ge

19、ne, ampr）氨苄青霉素抗性基因是基因操氨苄青霉素抗性基因是基因操作中使用最广泛的选择标记，绝大作中使用最广泛的选择标记，绝大多数在大肠杆菌中克隆的质粒载体多数在大肠杆菌中克隆的质粒载体带有该基因。青霉素可抑制细胞壁带有该基因。青霉素可抑制细胞壁肽聚糖的合成，与有关的酶结合并肽聚糖的合成，与有关的酶结合并抑制其活性，抑制转肽反应。抑制其活性，抑制转肽反应。 四环素可与核糖体四环素可与核糖体 30S 亚基的一种蛋亚基的一种蛋白质结合，从而抑制核糖体的转位。四环白质结合，从而抑制核糖体的转位。四环素抗性基因编码一个由素抗性基因编码一个由 399 个氨基酸组成个氨基酸组成的膜结合蛋白，可阻止四环

20、素进入细胞。的膜结合蛋白，可阻止四环素进入细胞。 pBR322 质粒除了带有氨苄青霉素抗性基质粒除了带有氨苄青霉素抗性基因外，还带有四环素抗性基因。因外，还带有四环素抗性基因。 四环素抗性基因四环素抗性基因（Tetracycline resistance gene, tetr） 氯霉素抗性基因氯霉素抗性基因（chloramphenicol resistance gene, Cmr, cat） 氯霉素可与核糖体氯霉素可与核糖体 50S 亚基结亚基结合并抑制蛋白质合成。目前使用的合并抑制蛋白质合成。目前使用的氯霉素抗性基因来源于转导性氯霉素抗性基因来源于转导性 P1 噬噬菌体（也携带菌体（也携带

21、Tn9）。）。cat 基因编码氯霉素乙酰转移酶，基因编码氯霉素乙酰转移酶，一个四聚体细胞质蛋白（每个亚基一个四聚体细胞质蛋白（每个亚基 23kDa）。在乙酰辅酶）。在乙酰辅酶 A 存在的条存在的条件下，该蛋白催化氯霉素形成氯霉件下，该蛋白催化氯霉素形成氯霉素羟乙酰氧基衍生物，使之不能与素羟乙酰氧基衍生物，使之不能与核糖体结合。核糖体结合。 卡那霉素和新霉素抗性基因卡那霉素和新霉素抗性基因（kanamycin/neomycin resistance gene, kanr, neor） 卡那霉素和新霉素是一种脱氧链霉胺氮基糖苷，都可与核卡那霉素和新霉素是一种脱氧链霉胺氮基糖苷，都可与核糖体结合并抑

22、制蛋白质合成。糖体结合并抑制蛋白质合成。 卡那霉素和新霉素抗性基因实际卡那霉素和新霉素抗性基因实际就是一种编码氨基糖苷磷酸转移酶（就是一种编码氨基糖苷磷酸转移酶（APH（3）-, 25kDa）的基因，氨基糖苷磷酸转移酶可使这两种抗生素磷酸化，从而的基因，氨基糖苷磷酸转移酶可使这两种抗生素磷酸化，从而干扰了它们向细胞内的主动转移。在细胞中合成的这种酶可以干扰了它们向细胞内的主动转移。在细胞中合成的这种酶可以分泌至外周质腔，保护宿主不受这些抗生素的影响。分泌至外周质腔，保护宿主不受这些抗生素的影响。 kanamycin/neomycin resistance gene, kanr, neor在基因

23、的编码区中，若某个密码子发生突变后变成终止密码在基因的编码区中，若某个密码子发生突变后变成终止密码子，则称这样的突变为子，则称这样的突变为赭石突变（突变为赭石突变（突变为 UAA），或琥珀突变），或琥珀突变（突变为（突变为 UAG），或乳白突变（突变为），或乳白突变（突变为 UGA）。 supF 基因编码细菌的抑制性基因编码细菌的抑制性 tRNA ，可在，可在 UAG 密码子上编密码子上编译酪氨酸。译酪氨酸。 琥珀突变抑制基因琥珀突变抑制基因 supF如果在某一宿主中含具琥珀突变的如果在某一宿主中含具琥珀突变的 tetr 基因和基因和 ampr 基因，只基因，只有当宿主含有有当宿主含有 sup

24、F 基因时才会对基因时才会对 Amp 和和 Tet 具有抗性。具有抗性。supE 基因在基因在 UAG 密码子上编译谷氨酰氨。密码子上编译谷氨酰氨。来自淀粉水解芽胞杆菌来自淀粉水解芽胞杆菌 （Bacillus amyloliquefa- ciens） ，编码果聚糖蔗糖酶。，编码果聚糖蔗糖酶。在含蔗糖的培养基上在含蔗糖的培养基上 sacB 基因的表达对大肠杆菌来基因的表达对大肠杆菌来说是致死的，因此该基因可用说是致死的，因此该基因可用于插入失活筛选重组子。于插入失活筛选重组子。 蔗糖致死基因蔗糖致死基因 SacB1.6.2 筛选标记基因筛选标记基因筛选标记主要用来区别重组质粒与非重组质粒筛选标记

25、主要用来区别重组质粒与非重组质粒当一个外源当一个外源 DNA 片段插入到一个质粒载体上时，可片段插入到一个质粒载体上时，可通过该标记来筛选插入了外源片段的质粒，即通过该标记来筛选插入了外源片段的质粒，即重组质粒重组质粒。 大肠杆菌的乳糖大肠杆菌的乳糖 lac 操纵子中的操纵子中的 lacZ 基因编码基因编码 -半乳糖苷半乳糖苷酶（酶（-galactosidase），如果），如果 lacZ 基因发生突变，则不能合成基因发生突变，则不能合成有活性的有活性的 -半乳糖苷酶。半乳糖苷酶。 -互补（互补（-complementation）lacZ：只编码：只编码 N-端端 140 个氨基酸的个氨基酸的

26、lacZ 基因基因 ，其产物也，其产物也没有酶学活性。没有酶学活性。lacZM15 基因是缺失了编码基因是缺失了编码 -半乳糖苷酶中第半乳糖苷酶中第 11-41 个氨个氨基酸的基酸的 lacZ 基因，无酶学活性。基因，无酶学活性。 当这两个无酶学活性的产物混合在一起时，可恢复当这两个无酶学活性的产物混合在一起时，可恢复 -半乳半乳糖苷酶的活性，实现基因内互补。糖苷酶的活性，实现基因内互补。在在 lacZ编码区上游插入一小段编码区上游插入一小段 DNA 片段（如片段（如 51 个碱基个碱基对的多克隆位点），不影响对的多克隆位点），不影响 -半乳糖苷酶的功能内互补。半乳糖苷酶的功能内互补。若在该若

27、在该 DNA 小片段中再插入一个片段，将几乎不可避免小片段中再插入一个片段，将几乎不可避免地导致产生无地导致产生无-互补能力的互补能力的 -半乳糖苷酶片段。半乳糖苷酶片段。 利用这一互补性质，可用于筛选在载体上插入了外源片段利用这一互补性质，可用于筛选在载体上插入了外源片段的重组质粒。的重组质粒。 异丙基异丙基-D- -D- 硫代半乳糖苷硫代半乳糖苷（IPTGIPTG）是乳糖的衍生物，可）是乳糖的衍生物，可作为作为 lac lac 操纵子的诱导物，但不能作为反应的底物；操纵子的诱导物，但不能作为反应的底物；乳糖既是乳糖既是 lac lac 操纵子的诱导物，也是作用的底物，乳操纵子的诱导物，也是

28、作用的底物，乳糖及其衍生物可诱导糖及其衍生物可诱导lacZ lacZ 表达。表达。5- 5-溴溴-4-4-氯氯-3-3-吲哚吲哚-D-D-半乳糖苷（半乳糖苷（X-galX-gal） 可作为可作为 lac lac 操纵操纵子的底物，但不能作为诱导物。子的底物，但不能作为诱导物。底物底物 X-gal X-gal 还可充作生色剂，被还可充作生色剂，被 -半乳糖苷酶分解后可半乳糖苷酶分解后可产生兰色产物，可使菌落或噬菌斑呈兰色。产生兰色产物，可使菌落或噬菌斑呈兰色。-互补：互补：载体带有一个来自大肠杆菌的载体带有一个来自大肠杆菌的lac操纵子的操纵子的DNA区段，区段，该区段编码该区段编码 半乳糖苷酶

29、（半乳糖苷酶（ -galactosidase ，由，由 1024 个氨基个氨基酸组成）酸组成） N端的一个片段。端的一个片段。IPTG诱导该片段的合成，而该片诱导该片段的合成，而该片段能与宿主细胞所编码的缺陷型段能与宿主细胞所编码的缺陷型 半乳糖苷酶实现基因内互半乳糖苷酶实现基因内互补（补（-互补）。互补）。插入失活插入失活 (insertional inactivation) 外源外源DNA的插入而导致基因失活的现象，称为的插入而导致基因失活的现象，称为插插入失活入失活(insertional inactivation)。插入失活常被用于检测含有外源插入失活常被用于检测含有外源DNA的重组体

30、，例的重组体，例如若在质粒如若在质粒pBR322的的BamHI的位点插入外源的位点插入外源DNA，然后转化大肠杆菌然后转化大肠杆菌(Tets、Amps)。有重组质粒有重组质粒( (即带有外源即带有外源DNADNA的质的质粒粒) )的宿主细胞失去对四环素的抗的宿主细胞失去对四环素的抗性，所以不能在含有四环素培养性，所以不能在含有四环素培养基的平板上生长，但仍能在含有基的平板上生长，但仍能在含有氨苄青霉素培养基的平板上生长。氨苄青霉素培养基的平板上生长。而那些含有不带外源基因的质粒而那些含有不带外源基因的质粒的宿主细胞，则可以在含有四环的宿主细胞，则可以在含有四环素或氨苄青霉素培养基的平板上素或氨

31、苄青霉素培养基的平板上生长，这样就很容易筛选到含有生长，这样就很容易筛选到含有目的基因的细菌，从而淘汰不含目的基因的细菌，从而淘汰不含目的基因的细菌。目的基因的细菌。 3质粒载体的构建及类型质粒载体的构建及类型 3.1天然质粒用作隆载体的局限性天然质粒用作隆载体的局限性 天然质粒天然质粒：一般是指那些没有经过以基因克隆为目标一般是指那些没有经过以基因克隆为目标的体外修饰改造的质粒。的体外修饰改造的质粒。在大肠杆菌中，常见的要用于基因克隆的天然质粒有在大肠杆菌中，常见的要用于基因克隆的天然质粒有ColE1、RSF2124和和pSC101等等 现行通用的基因克隆载体，绝大多数就是以质粒为基础改现行

32、通用的基因克隆载体，绝大多数就是以质粒为基础改建而成的。一般说来，一种理想的用作克隆载体的质粒必须满建而成的。一般说来，一种理想的用作克隆载体的质粒必须满足如下几个方面的条件：足如下几个方面的条件：(i) 具有复制起点具有复制起点 (ii) 具有抗菌素抗生基因具有抗菌素抗生基因(iii) 具若干限制酶单一识别位点具若干限制酶单一识别位点(iv) 具有较小的分子量和较高的拷贝数具有较小的分子量和较高的拷贝数 3.2质粒载体必须具备的基本条件质粒载体必须具备的基本条件3.3不同类型的质粒载体不同类型的质粒载体 高拷贝数的质粒载体高拷贝数的质粒载体 适于分离大量的高纯度的克隆基因的适于分离大量的高纯

33、度的克隆基因的DNA片段。如片段。如ColE1、pMB1或它们的派生质粒。或它们的派生质粒。 低拷贝数的质粒载体低拷贝数的质粒载体 适合于克隆含量过高对寄主代谢有害的适合于克隆含量过高对寄主代谢有害的DNA。例如，。例如，pLG338、pLG339及及pHSG415。 失控的质粒载体失控的质粒载体 失控的质粒载体（失控的质粒载体（runaway plasmid vectors）：是一些低）：是一些低拷贝的质粒，其复制控制是温度敏感型的，也就是说在不拷贝的质粒，其复制控制是温度敏感型的，也就是说在不同的温度下，拷贝数会有显著的变化。同的温度下，拷贝数会有显著的变化。 B.E.Uhlin等人（等人

34、（1979）首先发展了失控的质粒载体）首先发展了失控的质粒载体pBEU1和和Pbeu2。 插入失活型的质粒载体插入失活型的质粒载体 选用插入失活型质粒，将外源选用插入失活型质粒，将外源DNA片段插入在会导致选择片段插入在会导致选择记号基因（如记号基因（如tetr、ampr、cmlr等）失活的位点，就有可能通等）失活的位点，就有可能通过抗菌素抗性的筛选，大幅度地提高获得阳性克隆的几率。过抗菌素抗性的筛选，大幅度地提高获得阳性克隆的几率。 正选择的质粒载体正选择的质粒载体 正选择质粒载体（正选择质粒载体（direct selection vectors）：这种质粒载）：这种质粒载体具有直接选择记号

35、并赋予寄主细胞相应的表型。通过选择体具有直接选择记号并赋予寄主细胞相应的表型。通过选择具这种表型特征的转化子，便可大大降低需要筛选的转化子具这种表型特征的转化子，便可大大降低需要筛选的转化子的数量，从而减轻了实验的工作量，提高了选择的敏感性。的数量，从而减轻了实验的工作量，提高了选择的敏感性。 表达型的质粒载体表达型的质粒载体 使克隆在大肠杆菌中特定位点的外源真核基因的编码序使克隆在大肠杆菌中特定位点的外源真核基因的编码序列置于大肠杆菌的转录列置于大肠杆菌的转录-转译信号控制之下，并能在大肠杆菌转译信号控制之下，并能在大肠杆菌细胞中正常转录并转译成相应蛋白质的克隆载体特称为细胞中正常转录并转译

36、成相应蛋白质的克隆载体特称为表达表达载体（载体（expression vectors）。它分为。它分为表达型质粒载体表达型质粒载体和和表达表达型噬菌体载体型噬菌体载体两种不同的类型。两种不同的类型。 4.1pBR322质粒载体质粒载体 pBR322质粒载体的构建质粒载体的构建(p93) 由由F.Bliver和和R.L.Rodriguez构建构建 4重要的大肠杆菌质粒载体重要的大肠杆菌质粒载体 pBR322质粒的三个不同来源的组成部分质粒的三个不同来源的组成部分pBR322质粒载体的优点质粒载体的优点pSF2124质粒易位子质粒易位子Tn3的氨苄青的氨苄青霉素抗性基因（霉素抗性基因（ampr）p

37、SC101质粒的四环素质粒的四环素抗性基因（抗性基因（tetr）ColE1的派生质粒的派生质粒pMB1的的DNA复制起点（复制起点（ori） pBR322质粒载体优点主要表现在以下几个方面：质粒载体优点主要表现在以下几个方面： 具有较小的分子量，具有较小的分子量，pBR322质粒质粒DNA分子为分子为4 363bp。 具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号。具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号。 具有较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增之后，每个细胞具有较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增之后，每个细胞中可累积中可累积10003000个拷贝。个拷贝。 4.2 pUC质粒载体质粒载体 pU

38、C载体是在载体是在pBR322质粒载体的基础上，组入了一质粒载体的基础上，组入了一个在其个在其5-端带有一段多克隆位点的端带有一段多克隆位点的lacZ基因，而发展成基因，而发展成为具有双功能检测特性的新型质粒载体系列。为具有双功能检测特性的新型质粒载体系列。 pUC质粒载体的结构质粒载体的结构包括包括pUC7、8、9、12、13、18、19、118、119等等（i）来自）来自pBR322质粒的复制起点（质粒的复制起点（ori）；）；（ii）氨苄青霉素抗性基因（）氨苄青霉素抗性基因（ampr），但它的），但它的DNA核苷酸核苷酸序列已经发生了变化，不再含有原来的核酸内切限制酶的序列已经发生了变化

39、，不再含有原来的核酸内切限制酶的单识别位点；单识别位点；（iii）大肠杆菌）大肠杆菌-半乳糖酶基因（半乳糖酶基因（lacZ）的启动子及其编码）的启动子及其编码-肽肽链的链的DNA序列，此结构特称为序列，此结构特称为lacZ基因；基因；（iv）位于）位于lacZ基因中的靠近基因中的靠近5-端的一段多克隆位点（端的一段多克隆位点（MCS）区段，但它并不破坏该基因的功能区段，但它并不破坏该基因的功能 （2）pUC质粒载体的优点质粒载体的优点 如如pUC8为为2 750bP，pUC18为为2686bP。 pUC8质粒平均每个质粒平均每个细胞即可达细胞即可达500700个拷贝。个拷贝。 具有更小的分子量

40、和更高的拷贝数具有更小的分子量和更高的拷贝数重组体重组体 pUC8质粒结构中具有来自大肠杆菌质粒结构中具有来自大肠杆菌lac操纵子的操纵子的lacZ基基因，所编码的因，所编码的-肽链可参与肽链可参与-互补作用。因此，在应用互补作用。因此，在应用pUC8质质粒为载体的重组实验中，可用粒为载体的重组实验中，可用X-gal显色的组织化学方法一步显色的组织化学方法一步实现对重组体转化子克隆的鉴定。实现对重组体转化子克隆的鉴定。 适用于组织化学方法检测适用于组织化学方法检测pUC8质粒载体具有与质粒载体具有与M13mp8噬菌体载体相同的多克隆位噬菌体载体相同的多克隆位点点MCS区段，它可以在这两类载体系

41、列之间来回区段，它可以在这两类载体系列之间来回“穿梭穿梭”。具有多克隆位点具有多克隆位点MCS区段区段 因此，克隆在因此，克隆在MCS当中的外源当中的外源DN片段，可以方便地从片段，可以方便地从pUC8质粒载体转移到质粒载体转移到M13mp8载体上，进行克隆序列的核着载体上，进行克隆序列的核着酸测序工作。同时，也正是由于具有酸测序工作。同时，也正是由于具有MCS序列，可以使具两序列，可以使具两种不同粘性末端（如种不同粘性末端（如EcoRI和和BamHI）的外源）的外源DNA片段，无片段，无需借助其它操作而直接克隆到需借助其它操作而直接克隆到pUC8质粒载体上。质粒载体上。4.3 T载体与载体与

42、TA克隆方法克隆方法TA克隆方法（克隆方法（Original TA Cloning Kit）即利用）即利用Taq聚合聚合酶同时具有的末端连接酶的功能，在每条酶同时具有的末端连接酶的功能，在每条PCR扩增产物扩增产物的的3端自动添加一个端自动添加一个3-A突出端。突出端。T载体：载体：一个线性含一个线性含3-T突出端的载体用于直接高效地突出端的载体用于直接高效地连接连接PCR产物。产物。 Invitrogen公司公司TA克隆系统克隆系统和和Topo TA克隆系统克隆系统第二节第二节 病毒（病毒（virus）质粒载体携带的外源基因限于以下质粒载体携带的外源基因限于以下构建基因组文库时，目的构建基因

43、组文库时，目的DNA10kb，应采用病毒载体。，应采用病毒载体。病毒是一类非细胞微生物，能高效率高特异性地侵染宿主细胞病毒是一类非细胞微生物，能高效率高特异性地侵染宿主细胞（转导转导）,然后或然后或自主复制繁殖自主复制繁殖，或，或整合入宿主基因组中潜伏起整合入宿主基因组中潜伏起来来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。病毒的上述特性使得它们的病毒的上述特性使得它们的DNA能被开发成为基因工程的能被开发成为基因工程的有用载体，因为：有用载体，因为：高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞自主复制繁殖

44、性能使外源基因在受体细胞中高效扩增自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增大肠杆菌的大肠杆菌的 噬菌体噬菌体DNA衍生的载体衍生的载体黏性质粒黏性质粒载体：含有载体：含有 噬菌体噬菌体DNA的某些位点并被包装的某些位点并被包装而获得的载体而获得的载体M13：小分子的丝状单链噬菌体：小分子的丝状单链噬菌体1 噬菌体噬菌体1.11.1l l 噬菌体的生物学特性：噬菌体的生物学特性： 生物结构生物结构l l 噬菌体是噬菌体是大肠杆菌的温和型噬菌体大肠杆菌的温和型噬菌体l l 噬菌体噬菌体由外壳包装蛋白和由外壳包装蛋白和l l-DNA组成组成 l l-DNA全长全长48502个核苷酸个核苷酸l

45、l-DNA上上至少有至少有61个基因个基因1.1.11.1.1l l 噬噬菌菌体体基基因因组组结结构构The phage l cos ends： cos位点（位点（cohesive-end site，粘性末端位点，粘性末端位点 ）在在噬菌体线性双链噬菌体线性双链 DNA分子的两端，各有一条由分子的两端，各有一条由12个核苷酸组成的彼此完全互补的个核苷酸组成的彼此完全互补的5单链突出序列，即通常单链突出序列，即通常所说的所说的粘性末端粘性末端。Circular form Linear form 3-GCCCCGCCGCTGGAGC-55-CGGGGCGGCGACCTCG-3Cleavage (d

46、uring packaging) Ligation (after infection)GGGCGGGCGACCTCG-3GC-55-CG3-GCCCCGCCGCTGGA占占噬菌体噬菌体 DNA4050% ，裂解生长所必须裂解生长所必须右臂右臂约为约为 8-10kb ，从，从 PR 启启动子到右侧动子到右侧 cos 位点。位点。左臂左臂约约 20kb ，从基因，从基因 A 至基至基因因 J 的区域，含有编码噬菌的区域，含有编码噬菌体头部和尾部蛋白的基因体头部和尾部蛋白的基因l l 噬菌体基因组至少可编码噬菌体基因组至少可编码 50 个基因，它们的分布和排列与其个基因，它们的分布和排列与其功能有一

47、定关系。根据执行功能可将基因组分为三个区。功能有一定关系。根据执行功能可将基因组分为三个区。Right armLeft arml l 噬菌体的可取代区（中间区或非必需区）噬菌体的可取代区（中间区或非必需区）J 基因与基因与 Cro 基因之间的基因之间的 DNA ，占占噬菌体噬菌体 DNA 的的 1/3 ，主，主要包含控制要包含控制噬菌体进入溶源状态的调节基因和功能基因。噬菌体进入溶源状态的调节基因和功能基因。可被可被 ga1 基因或基因或 bio 基因基因替换，不影响替换，不影响 噬菌体裂噬菌体裂解生长解生长。Nonessential regionDNAProtein coatcoscosNo

48、nessential regionLong (left)armshort (right)armExogenous DNA(20-23 kb)12bp phage1.1.21.1.2l l 噬菌体生命周期与溶原状态噬菌体生命周期与溶原状态整合主要由-DNA上的cI和int两基因的产物所激活，而这两个基因的开放与关闭又取决于宿主细胞本身的性质。噬菌体感染大肠杆菌后，除能裂解细胞外，也可能将其DNA直接整合到宿主细胞的染色体DNA上，并不产生子代噬菌体颗粒，这种情况为溶原状态。DNA重组技术一般需要噬菌体进入溶菌状态人们可以根据需要改变-DNA或宿主细胞的性质，使噬菌体或处于溶菌状态，或处于溶菌状态

49、1.21.2l l 噬菌体的选择性标记噬菌体的选择性标记 lacZ 基因也可用于基因也可用于 噬菌体载体，噬菌体载体，通过插入或替换载体中的通过插入或替换载体中的 -半乳糖半乳糖苷酶基因片段，在苷酶基因片段，在 IPTG/X-gal 平板平板上可通过噬菌斑的颜色，筛选重组噬上可通过噬菌斑的颜色，筛选重组噬菌体。菌体。 lacZ 基因基因c基因基因 c编码的编码的抑制子与操纵区抑制子与操纵区 OR1 和和OR2发生亲和作用结合后，发生亲和作用结合后，激活激活PRM启动启动 c 表达表达抑制子，结合抑制子，结合Cro及下游裂解蛋白基因及下游裂解蛋白基因的表达，抑制裂解生长的表达，抑制裂解生长溶原溶

50、原裂解裂解 hfl-的的 E.coli 中，中，c 的表达使的表达使 噬菌体进入溶源状态噬菌体进入溶源状态hfl+的的 E.coli 中，中，噬菌体可高效率地进入溶源状态噬菌体可高效率地进入溶源状态Hfl：高频溶源化，：高频溶源化， high frequency of lysogenization 重组子中外源基因插入到重组子中外源基因插入到c 中，中，c不能表达不能表达,将高将高频率地使频率地使 hfl -E.coli 进入裂解生长状态，长出噬菌斑。进入裂解生长状态，长出噬菌斑。在构建基因文库时，可提高排除非重组噬菌体的效率，从而在构建基因文库时，可提高排除非重组噬菌体的效率，从而降低对基因

51、文库进行筛选的劳动强度。降低对基因文库进行筛选的劳动强度。c 基因基因在在hfl E.coli中增加基因中增加基因 c 的产物，高效地进入溶源状态的产物，高效地进入溶源状态c产物产物(c)结合结合PRE激活激活c的表达，生长向溶原方向进行的表达，生长向溶原方向进行 重组子中外源基因插入到重组子中外源基因插入到c 中，中，c不能表达，将高频不能表达，将高频率地使率地使 hfl -E.coli 进入裂解生长状态，长出噬菌斑。进入裂解生长状态，长出噬菌斑。Spi 筛选筛选野生型野生型 噬菌体在带有噬菌体在带有 P2 原噬菌体的溶源性原噬菌体的溶源性 E.coli 中中 的生长会受到限制的表型，称作的

52、生长会受到限制的表型，称作 Spi+ ，即对，即对 P2 噬菌噬菌体的干扰敏感（体的干扰敏感（sensitive to P2 interference）。）。Spi+如果如果 噬菌体缺少两个参与重组的基因噬菌体缺少两个参与重组的基因 red 和和 gam ，同时带有同时带有 chi 位点位点，并且宿主菌为，并且宿主菌为 rec + ，则可以在，则可以在 P2 溶源性溶源性 E.coli 中生长良好，中生长良好，噬菌体的这种表型称噬菌体的这种表型称作作 Spi- 。Spi-因此，通过因此，通过噬菌体载体噬菌体载体 DNA 上的上的 red 或或 gam 基因基因的缺失或替换，的缺失或替换，可在可

53、在 P2 噬菌体溶源性细菌中鉴别重组和非重组噬菌体溶源性细菌中鉴别重组和非重组噬菌体。噬菌体。 1.31.3l l 噬菌体载体构建噬菌体载体构建野生型野生型-DNA包装的上限为包装的上限为51kb，本身长度为，本身长度为48.5kb，只有，只有当插入的外源当插入的外源DNA片段不大于片段不大于2.5kb时（时（包装范围为原包装范围为原DNA的的75 - 105%） ，才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。，才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。因此，缩短野生型因此，缩短野生型-DNA的长度，可以提高装载量。的长度，可以提高装载量。野生型野生型l-DNA上约有上约有40-50%的片段是复制和裂解所非必需

54、的。的片段是复制和裂解所非必需的。根据切除的多少，可将根据切除的多少，可将-DNA分成两大类载体：分成两大类载体：插入型载体插入型载体取代型载体取代型载体1.3.1 插入型载体（插入型载体（insertion vectors）只具有一个可供外源只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点。插入的克隆位点。外源的外源的DNA克隆到插入型的克隆到插入型的载体分子上，会使噬菌体的某载体分子上，会使噬菌体的某种生物功能丧失效力，即所谓的插入失活效应。种生物功能丧失效力，即所谓的插入失活效应。-半乳糖苷酶失活的（半乳糖苷酶失活的（inactlvatlon of E.coli -galactosidase）免疫

55、功能失活的（免疫功能失活的（inacti- vatiort of immunityfunction）免疫功能失活的（免疫功能失活的（inacti- vatiort of immunityfunction）基因组中有一段免疫区（基因组中有一段免疫区（c），有一两种核酸内切限制酶的），有一两种核酸内切限制酶的单切割位点。当外源单切割位点。当外源DNA片段插入到这种位点上，不能进入片段插入到这种位点上，不能进入溶源周期。溶源周期。turbid plaquesclarificationplaques带有外源带有外源DNA插入的插入的重组体形成清晰的噬菌斑重组体形成清晰的噬菌斑（clarificatio

56、n plaques）没有外源没有外源DNA插入的亲本噬菌体形成混浊的噬菌斑（插入的亲本噬菌体形成混浊的噬菌斑（turbid plaques）-半乳糖苷酶失活的（半乳糖苷酶失活的（inactlvatlon of E.coli -galactosidase）基因组中基因组中lacZ区段，编码着区段，编码着半乳糖苷酶，由这种载体感染的半乳糖苷酶，由这种载体感染的大肠杆菌大肠杆菌lac-指示菌，涂布在补加有指示菌，涂布在补加有IPTG和和Xgal的培养基平的培养基平板上，会形成蓝色的噬菌斑。板上，会形成蓝色的噬菌斑。如果外源如果外源DNA插入到插入到lacZ区段上，阻断了区段上，阻断了-半乳糖着酶基因

57、半乳糖着酶基因lacZ的编码序列，不能合成的编码序列，不能合成-半乳糖昔酶，只能形成无色的噬菌斑。半乳糖昔酶，只能形成无色的噬菌斑。 插入型载体插入型载体只能承受较小分子量（一般在只能承受较小分子量（一般在10kb左右）的外源左右）的外源DNA片段的插入，应用于片段的插入，应用于cDNA及小片段及小片段DNA的克隆。的克隆。体外包装体外包装插入位点插入位点体外包装体外包装插入片段插入片段载体长度载体长度 37 kb插入片段大小：插入片段大小：0 - 14 kb（51 37）具有成对的克隆位点，在这两个位点之间的具有成对的克隆位点，在这两个位点之间的DNA区段可区段可以被外源插入的以被外源插入的

58、 DNA片段所取代片段所取代 1.3.2 替换型载体（替换型载体（replacement vectors）替换型载体又叫做取代型载体（替换型载体又叫做取代型载体（substitution vector），），是一类在是一类在噬菌体基础上改建的、在其中央部分有一个可以噬菌体基础上改建的、在其中央部分有一个可以被外源插入的被外源插入的DNA分子所取代的分子所取代的DNA片段的克隆载体。片段的克隆载体。 NM781载体中，可取代的载体中，可取代的EcoRI片段编码有一个片段编码有一个supE基因，可基因，可抑制寄主细胞抑制寄主细胞lacZ基因的琥珀突变，基因的琥珀突变， NM781感染写宿主后能在感

59、染写宿主后能在乳糖麦康基氏（乳糖麦康基氏（Macconkey）琼脂培养基上产生出红色的噬菌）琼脂培养基上产生出红色的噬菌斑，或是在斑，或是在Xgal琼脂培养基上产生出蓝色的噬菌斑。琼脂培养基上产生出蓝色的噬菌斑。NM781如果这个具有如果这个具有supE基因的基因的EcoRI片段被外源片段被外源DNA取代了，那取代了，那么所形成的重组体噬菌体，在上述这两种指示培养基上都只么所形成的重组体噬菌体，在上述这两种指示培养基上都只能产生出无色的噬菌斑。能产生出无色的噬菌斑。 NM781感染写宿主后能在乳糖麦感染写宿主后能在乳糖麦康基氏（康基氏（Macconkey）琼脂培养）琼脂培养基上产生基上产生红色

60、的噬菌斑红色的噬菌斑重组重组NM781感染写宿主后能感染写宿主后能在乳糖麦康基氏（在乳糖麦康基氏（Macconkey）琼脂培养基上产生琼脂培养基上产生无色的噬菌无色的噬菌斑斑对重组体的对重组体的DN A分子进行分子进行包装和增殖，以得到有感染包装和增殖，以得到有感染性的性的重组噬菌体。重组噬菌体。 用替换型载体克隆外源用替换型载体克隆外源DNA包括三个步骤：包括三个步骤：应用适当的核酸内切限制酶消应用适当的核酸内切限制酶消化化载体，除去基因组中可取载体，除去基因组中可取代的代的DNA区段区段DNA臂同外源臂同外源DNA片段连接。片段连接。替换型载体克隆外源替换型载体克隆外源DNA可能出现三种情

61、况可能出现三种情况替换型载体替换型载体可承受较大分子量的外源可承受较大分子量的外源DNA片段的插入，所片段的插入，所以适用于克隆高等真核生物的染色体以适用于克隆高等真核生物的染色体DNA 最小装载长度最小装载长度 10 kb最大装载长度最大装载长度 25 kb体外包装体外包装体外包装体外包装插入片段插入片段（51 26）载体长度载体长度 26 kb插入片段插入片段（36 26）1.4重组体重组体DNA分子的转染作用与体外包装分子的转染作用与体外包装 1.4.1重组体重组体DNA分子的转染作用分子的转染作用 用用重组体重组体DNA分子直接感染大肠杆菌，使之侵入寄主细分子直接感染大肠杆菌，使之侵入

62、寄主细胞内。这种由寄主细胞捕获裸露的噬菌体胞内。这种由寄主细胞捕获裸露的噬菌体DNA的过程叫做的过程叫做转染（转染（transfection） 野生型野生型 DNA典型转染效率为典型转染效率为 105106之间之间体外连接的结果，转染效率便下降到了体外连接的结果，转染效率便下降到了104103左右。左右。 转染效率：转染效率：每微克每微克DNA转染产生的噬菌斑数目转染产生的噬菌斑数目DNA的转染作用，是一种低效的过程。的转染作用，是一种低效的过程。1.4.2DNA的体外包装的体外包装 DNADNA的体外包装作用，在离体条件下，将重组体的体外包装作用，在离体条件下，将重组体DNADNA包入包入噬

63、菌体等病毒颗粒中的过程，以形成有功能的病毒载体噬菌体等病毒颗粒中的过程，以形成有功能的病毒载体噬菌体的头部和尾部的装配是分开进行的。头部基因发生了噬菌体的头部和尾部的装配是分开进行的。头部基因发生了突变的噬菌体只能形成尾部，而尾部基因发生了突变的噬菌体突变的噬菌体只能形成尾部，而尾部基因发生了突变的噬菌体则只能形成头部。将这两种不同突变型的噬菌体的提取物混合则只能形成头部。将这两种不同突变型的噬菌体的提取物混合起来，便能够在体外装配成有生物活性的噬菌体颗粒。起来，便能够在体外装配成有生物活性的噬菌体颗粒。 体体外外互互补补作作用用研研究究1.4.3噬菌体噬菌体DNA的包装限制问题的包装限制问题

64、 上限不得超过其正常野生型上限不得超过其正常野生型DNA总量的总量的5左右左右噬菌体头部外壳蛋白质容纳噬菌体头部外壳蛋白质容纳DNA的能力是有一定限度的。的能力是有一定限度的。下限不得少于正常野生型下限不得少于正常野生型DNA总量的总量的75 噬菌体的包装上限是噬菌体的包装上限是 51kb。编码必要基因的编码必要基因的DNA区段占区段占28kb因此，因此，载体克隆外源载体克隆外源DNA的的理论极限值应是理论极限值应是23kb按野生型按野生型DNA分子长度为分子长度为 48kb计算计算gateway3柯柯 斯斯 质质 粒粒 载载 体体 是一类由人工构建的含有是一类由人工构建的含有 DNA的的 c

65、os序列和质粒复制子的序列和质粒复制子的特殊类型的特殊类型的质粒载体（质粒载体（cosmid vectors） 。 柯斯质粒（柯斯质粒（cosmid）1978年，年，JCoffins及及BHohn等人发展出柯斯质粒载体。等人发展出柯斯质粒载体。“cosmid”一词是由英文一词是由英文“cos site-carrying plasmid”缩写而缩写而成的，其原意是指带有粘性末端位点（成的，其原意是指带有粘性末端位点（cos）的质粒。）的质粒。 由于考斯质粒和噬菌粒不再携带包装蛋白基因，因此重组由于考斯质粒和噬菌粒不再携带包装蛋白基因，因此重组DNA分子在细胞内不能形成噬菌体颗粒分子在细胞内不能形

66、成噬菌体颗粒1.8 kb的的l l-DNA片段片段 + pBR322片段片段装载范围为装载范围为31 - 45 kb柯斯克隆柯斯克隆 应用柯斯质粒载体，在大肠杆菌细胞中克隆大片段的真核应用柯斯质粒载体，在大肠杆菌细胞中克隆大片段的真核基因组基因组DNA技术，叫做技术，叫做“柯斯克隆柯斯克隆”（cosmid cloning） 线性线性噬菌体噬菌体DN分子末端分子末端cos位点，在位点，在噬菌体的正常生命周噬菌体的正常生命周期中，会产生由数百个期中，会产生由数百个DNA拷贝组成的多连体分子。拷贝组成的多连体分子。末端酶（末端酶（terminase）或）或Ter体系体系：噬菌体具有的一种位点特异噬菌体具有的一种位点特异的切割体系（的切割体系（site-specific cutting system），），叫做末端酶叫做末端酶（terminase）或）或Ter体系体系，能识别两个相距适宜的能识别两个相距适宜的cos位点，将位点，将多连体分子切割成多连体分子切割成单位长度的片段，并将它们包装到单位长度的片段，并将它们包装到噬菌体噬菌体头部中去。头部中去。DNA分子具有分子具有两个两个cos位点位