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1、GSPT1 在结肠癌中的作用及其分子机制研究 结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)是结肠及直肠发生的恶性肿瘤,是最常 见的恶性肿瘤之一 1-5 。近年来 , 随着工业化的进程 , 生活环境恶化 , 饮食结构不合理，生活节奏加快，人口结构变化等,CRC 的发病率逐步增高，严重 威胁人类健康，美国最新癌症流行病学统计数据显示 CRC 的发病率在各类恶性肿 瘤的发病率中位于第三位 6-14 。 在中国 CRC 的新发病率和死亡率有上升趋势。据 2015 年中国癌症统计数据 显示, 在全部恶性肿瘤中结直肠癌发病率、 死亡率均位居第 5 位, 新发病例有 37.6 万 , 死亡病例有
2、19.1 万。 经济发达城市地区发病率远高于农村 , 结直肠癌发病率上升显著 15-21 。当前 , 结直肠癌是以外科手术治疗为主 , 结合化疗 , 放疗 , 靶向药物治疗等综合治疗 , 但总的 5 年生存率约 50%22-30 。 因此, 进一步研究结肠癌的肿瘤特异性标志物 , 为临床结肠癌的诊治提供新 靶点及手段 , 具有重要意义。本研究首先运用生物信息学 , 分析了癌症基因组图谱 (The Cancer Genome Altas,TCGA)中的结肠癌测序数据 31-33v/sup, 挖掘了在正常结肠组织和结肠癌组织中差异表达基因 , 深入分析了差异基因参与 的生物学过程。 在差异基因中发
3、现了 GSPT(1 G1 to S phase transition 1 )在结肠癌发生 发展的生物学过程中发挥重要作用。 基于 UCSCS 因组浏览器分析发现,GSPT1 位 于人类 16号染色体长臂 13 区(chr16 p13.13),在蛋白质编码区有 10 个外显子 组成, 其转录时通过可变剪切形成 2 个不同的转录本 , 翻译编码 508 个氨基酸。 定量 PCR 和免疫组织化学染色发现,GSPT1 在结肠癌组织中异常高表达。据 此推测,GSPT1 结肠癌的发生、进展及转归中某些生物学过程中发挥重要作用 查阅国内外文献发现,GSPT1 在结肠癌中的的生物学功能及分子机制尚未报 道。本
4、论文以 GSPT 伪核心，利用细胞生物学、病理学和分子生物学技术明确 GSPT1 在结肠癌中的生物学功能,并采用高通量 IP-MS 分析寻找 GSPT 调控的靶 基因及参与的分子信号通路，阐述 GSPT 在结肠癌中可能的分子生物学机制。 第一部分基于生物信息学分析 GSPT1 可作为结肠癌的生物标志物及临床意 义目的：利用生物信息学分析 TCGA 数据库中的结肠癌测序数据,预测并验证在结 肠癌发生发展中的关键基因。方法:用 TCGA-Assembler 下载、处理结肠癌测序数 据,以差异倍数>2,Q 值&t;0.05 筛选标准,分析在结肠癌患者中显著差异表 达的基因,随后对差异基因进行基
5、因本体(Gene Ontology,GO)和 KEGG Pathway 富集分析 ,Cytoscape 软件展示差异基因间共表达互作关系。 应用 qRT-PCR western blot 及免疫组化技术检测 GSPT1 在结肠癌组织和正 常结肠组织中的表达,结合临床资料统计学分析 GSPT1 与结肠癌患者的分期、分 级及肿瘤大小等临床特点之间的关系。 结果: 生物信息学分析 , 结肠癌组织中共发 现 1000 个显著差异表达的基因 , 其中 353 个显著上调基因 647 个显著下调的基 因,GO 和 Pathway的功能富集分析发现差异基因主要参与了细胞增殖(cell proliferati
6、on )、细胞周期( cell cycle )、细胞分裂( cell division )、细胞 分子代谢过程( cell molecule metabolic process )、 Focal adhesion (细胞粘 附)、Metabolic pathways (代谢通路)、MAP 信号通路(MAPKsignaling pathway) 等生物学过程及信号通路。 结果提示 GSPT1 可能在结肠癌的发生发展中发挥重要作用。定量 PCR 和免疫 组织化学染色分析发现,GSPT1 在结肠癌患者中异常高表达,具有统计学差异 P<0.05 ）。 结论：基于生物信息学发现了 GSPT 在结肠
7、癌中异常表达及在组织样本中定 量PCR和免疫组织化学染色分析验证,GSPT1是潜在的临床诊断标志物。 第二部 分GSPT1在结肠癌细胞中的生物学功能研究目的：以结肠癌细胞株 HCT116 和 SW48C 为研究模型,探讨 GSPT 对结肠癌细胞的细胞增殖、细胞周期、凋亡及侵 袭能力的影响。 通过裸鼠体内皮下成瘤实验,检测 GSPT1 寸结肠癌细胞体内成瘤能力的影响。 方法:运用 siRNA 干扰技术合成靶向 GSPT 的小干扰 RNA 在结肠癌细胞株中干扰 GSPT1的表达，定量 PCR 和 western blot 检测 siRNA 的沉默效率，Cell Counting Kit-8 (CC
8、K8、EdU 平板克隆形成、流式细胞仪和 transwell 分别检测结肠癌 细胞中沉默GSPT1 后增殖、细胞周期、凋亡、侵袭能力的变化。 合成靶向 GSPT 的 shRNA 的慢病毒，感染 HCT116 后嘌呤霉素筛选稳定低表达 细胞株,荧光定量 PCR 和 western blot 鉴定低表达细胞株。构建人源 GSPT1 真核 过表达载体,转染 HCT116 细胞后，探讨过表达 GSPT1 寸结肠癌细胞周期、凋亡和 克隆形成的影响。 裸鼠体内皮下成瘤实验,检测稳定低表达GSPT1后对结肠癌细胞成瘤能力的 影响。结果：定量 PCR 和 western blot 结果显示,合成的 siRNA
9、 转染 HCT116 和 SW48C 后能有效沉默 GSPT1 勺表达。 GSPT1 被沉默 24 小时后 HCT116 和 SW48 啲增殖能力开始受到抑制,随着干 扰时间的增加 , 结肠癌细胞的增殖能力的抑制逐渐明显 , 呈时间梯度的依赖。 流式 细胞仪检测凋亡结果发现,沉默 GSPT1 后可以诱发结肠癌细胞凋亡发生。 流式细胞周期检测和 EdU实验结果发现,沉默 GSPT1后抑制了结肠癌细胞 DNA的合成,阻滞细胞周期 G1 到 S 期的转换的正常进程。裸鼠体内皮下成瘤结果 显示稳定低表达 GSPT 的结肠癌细胞肿瘤生长受到抑制；定量 PCR 和 western blot 表明在 HCT
10、116中成功过表达了 GSPT1 过表达 GSPT 后促进了结肠癌细胞的 增殖和周期进展 ,抑制了凋亡的发生。 结论：在结肠癌细胞中 GSPT1 促进了细胞增殖和周期，抑制细胞凋亡，其在结 肠癌的发生发展中起着重要作用。第三部分 GSPT1 调控结肠癌细胞周期的分子机 制研究目的：探讨 GSPT1 调控结肠癌细胞生物学功能相互作用的靶基因和参与的 信号通路。 方法：运用 GSPT1 的 IP 级抗体，在 HCT116 吉肠癌细胞中进行免疫沉淀（IP）, 和 IP-normal IgG 组比 IP-GSPT1 组的特异性条带进行质谱分析处理,分析 GSPT1 相互作用的蛋白,并应用 Western blot 检测 GSPT 参与的 GSK 串的下游信号通 路。结果:发现和 IP-normal IgG 组比 IP-GSPT1 组有特异性条带,质谱分析结果 发现 GSPT1 和泛素化连接酶 TRIM4 直接结合,导致 GSK-3B 蛋白的泛素化降解。 Western blot 结果发现，沉默 GSPT1 后 GSK-3B、P21、P27 表达升高，周期 相关蛋白 CyclinD1、 CDK4 CDK6 CyclinE 和 CDK2 勺表达下降。 结论：在结肠癌 中 GSPT1和泛素化连接酶 TRIM4 相互作用,负向调节 GSK-3B 信号通路,GSPT1 促 进结肠癌细胞周期、增殖
GSPT1在结肠癌中的作用及其分子机制研究
