红色荧光蛋白

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1、综合实验：红色荧光蛋白（RFP）的原核表达红色荧光蛋白(RFP)的原核表达生物学实验教学中心 III目 录引言11 实验材料21.1实验材料21.2实验试剂21.3实验仪器32 实验方法32.1重组质粒pET-28a-RFP的构建。32.2活化菌种42.3 IPTG诱导RFP基因表达42.4 蛋白质的提取42.5 蛋白质的纯化42.6 SDS-PAGE检测表达蛋白52.7数据分析与结果处理63 结果与分析73.1 IPTG诱导后菌液颜色及其表达蛋白粗提取73.2 SDS-PAGE检测表达蛋白73.3 分析7总结8参考文献9红色荧光蛋白（RFP）的原核表达摘 要：本实验通过分别将DH-5(pDs

2、Red-N1)和DH-5(pET-28)提取质粒、酶切并连接形成重组质粒，将含有红色荧光蛋白（RFP）外源基因的质粒转入大肠杆菌体内。在活化、扩配含有目的基因的重组大肠杆菌后，用IPTG诱导RFP基因表达，在日光下可以看到菌液呈红色。将蛋白的粗提液经Ni+亲和层析得到纯化蛋白，根据SDS-PAGE电泳检测RFP蛋白的表达。结果：RFP基因在含有重组质粒pET-28a-RFP的大肠杆菌中稳定表达。关键词： 红色荧光蛋白；重组质粒；诱导；原核表达； Expression of RFP in Prokaryotes Abstract: This experiment, respectively, D

3、H-5 (pDsRed-N1) and DH-5 (pET-28) plasmid was extracted, digested and connected to form the recombinant plasmid. The recombinant plasmid containing the foreign gene of red fluorescent protein (RFP) was transduced into E.coli in vivo. By activation and intermediate culture, the recombinant E. coli we

4、re inducted with IPTG, and the RFP was expressed. The red broth can be seen in daylight. The crude extracts of protein were purified by Ni+ affinity chromatography, and the RFP can be detected by SDS-PAGE electrophoresis. Results: RFP gene can be expressed steadily in prokaryotes cellsKey words : RF

5、P ; recombinant plasmid ; induction ; prokaryotic expression缩略词表简写中文全称RFP红色荧光蛋白GFP绿色荧光蛋白PBS磷酸盐缓冲液IPTG异丙基硫代-D-半乳糖苷SDS-PAGE十二烷基磺酸钠-聚丙烯酞胺凝胶电泳综合实验：红色荧光蛋白（RFP）的原核表达RFP的原核表达雷雅琪（指导老师：王友如）（湖北师范学院生命科学学院 生物科学0801班 湖北 黄石 435002）引言红色荧光蛋白（RFP）是Matz等1从印度太平洋与海葵相关的Discosomasp中分离出来的一种能在紫外线的照射下可发射红色荧光的蛋白。RFP基因编码的蛋白质由

6、225个氨基酸组成，相对分子质量（Mr）为25.9ku。它的一级结构与GFP的同源性很低，仅为23%，但它们的二级结构跟相似2。Baird等3研究了RFP的成熟动力学,发现室温下该蛋白最先形成绿色荧光生色团(最大吸收和发射波长分别为475和499 nm),其荧光强度在最高峰可维持7 h,然后逐渐降为零,历时2 d。与此同时,红色荧光在27 h达到最大强度的50%,48 h后,达到最大强度的90%。对RFP进行随机突变,得到了发射绿光的突变株。基于这个发现,人们推测RFP发色团形成的机制主要为:先形成GFP样的绿色阴离子发色团中间体(吸收和发射波长分别为480和500 nm),然后经过氧化反应,

7、转变为成熟的红色荧光发色团(吸收和发射波长分别为558和583nm)。总之,RFP的发色团是GFP发色团的延伸4。实验结果表明,RFP的发色团只有在寡聚化的情况下才能形成及发挥作用。对RFP碱变性、酸变性及胍变性实验表明,RFP的发色团要经过几步折叠才可形成,而寡聚化在它的成熟过程中起重要的作用。RFP已被广泛用于动物、植物、和酵母等真核细胞内基因表达的报告基因 5-11，其作为报告基因在原核细胞中的应用也越来越受关注12。大肠杆菌是第一个用于重组蛋白生产的宿主菌，它不仅具有遗传背景清楚、培养操作简单、转化和转导效率高、生长繁殖快、成本低廉、可以快速大规模地生产目的蛋白等优点13。而且其表达外

8、源基因产物的水平远高于其它基因表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌中蛋白量的30%，因此大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统14。大肠杆菌表达系统是目前最常用的外源蛋白表达系统,大肠杆菌由于遗传背景清楚、易操作,以及有大量可供选择的克隆或表达载体,使之成为人们克隆表达外源基因的主要菌株15。本实采用重组、诱导、SDS-PAGE电泳检测16等技术验验证了RFP基因在原核细胞中的稳定表达。1 实验材料1.1实验材料菌种：携有重组质粒pET-28a-RFP的DH-5重组菌株（由本实验室保存）。1.2实验试剂药品名称配方LB培养基10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10g氯化钠，溶于蒸馏水中，定容

9、至1000ml，用NaOH调节pH至7.2，分装后高压蒸汽灭菌。卡那霉素用无菌水溶解卡那霉素，浓度为100mg/ml。IPTG用无菌水溶解IPTG，浓度为1mM。8TrisHCl （pH6.8）在40mL水中溶解6.05g Tris碱（0.5 mol/L），用1mol/L HCl调校至pH6.8,补加水至整体积100mL，用0.45um滤膜过滤，再加入0.4g SDS 0.4%(m/V) 溶解后于4C保存。超声缓冲液0.5mol/L NaCl、20mmol/L PBS。平衡液0.5mol/L NaCl 、20mmol/L PBS 、pH7.2.洗脱液50mM咪唑 、0.5mol/L NaCl

10、、 50mmol/L PBS 、pH7.2。洗脱液500mM 咪唑 、0.5mol/L NaCl 、50mmol/L PBS 、pH7.2。15%分离胶4.7mL 双蒸水、10mL 30%丙烯酰胺混合物、5.0mL 1.5mol/L Tris (pH8.8)、0.2mL 10%SDS、0.1mL 10%过硫酸铵(用时配制)、10L TEMED。总体积20mL。5%浓缩胶5.8mL 水、1.6mL 30%丙烯酰胺混合物、2.5mL 1.5mol/L Tris (pH6.8)、100L 10%SDS、50L 10%过硫酸铵(用时配制)、10L TEMED。总体积10mL2Tricine样品缓冲液2

11、mL TrisHCl /SDS pH6.8 （0.08mol/L）、2.4 mL甘油24% （V/V）(3.0g) 0.8g SDS 8%(m/V)、0.31g DTT（0.2mol/L）、2mg考马斯亮蓝G-250 0.02%(m/V)、加水至10 mL，并混匀。固定液甲醇水乙酸=301060（V/V/V）脱色液甲醇水乙酸=4.54.51（V/V/V）染色液0.25g考马斯亮蓝（R250）溶解于100mL脱色液。1.3实验仪器仪器名称生产地BCM-1000生物洁净工作台苏州净化设备有限公司THZ-C-1台式冷冻恒温振荡器太仓市实验设备厂DYY-12型电泳仪北京市六一仪器厂TGL-16C台式离

12、心机上海安亭科学仪器厂HJ-3控温磁力搅拌器江苏金坛市金南仪器厂雷磁PHS-3C pH计上海精密科学仪器有限公司AB204-N电子天平Mettler-Toleda GroupKDM型调温电热套武汉精华科教仪器有限公司2 实验方法2.1重组质粒pET-28a-RFP的构建。E.coli E.coliDH-5(pDsRed-N1) DH-5(pET-28)质粒 提取 质粒 提取质粒pDsRed-N1 质粒 pET-28酶切 回收 酶切 回收插入片段 载体片段连 接重组质粒（pET-28-RFP） 转化 DH5(?)转 化 菌落PCR鉴定 酶切鉴定BL-21 (?) 质粒pET-28-RFP菌落PC

13、R鉴定 酶切鉴定 转 化BL-21（pET-28-RFP） BL-21（pET-28-RFP）2.2活化菌种所有操作均在无菌条件下进行。1) 将卡那霉素100 mg/mL以11000的比例加入到LB液体培养基中，后将LB液体培养基取2 mL分装至无菌红帽试管中。2) 取活化的工程菌株10 L于红帽试管中。3) 在37恒温培养箱中培养中过夜培养。（转速：180 rpm）2.3 IPTG诱导RFP基因表达将过夜培养物按照11000的比例加入到含有卡那霉素的5 mL培养基中， 37条件下180rpm培养24h至对数期。其后，将IPTG（1 mmol/L）按照11000的比例加入到培养基中，每隔2h观

14、察培养基的颜色变化。此过程中设置一个对照，即在培养基中不加入IPTG。此过程均在无菌条件下进行。2.4 蛋白质的提取（1）将表达的菌液（Fig.1（a）取出进行离心，转速为5000 r/m，时间为5 min。（2）沉淀（Fig.1（b）用超声缓冲液洗涤混合，使菌重悬置于小管中（Fig.1（c）。（3）进行超声破壁。利用超声波细胞粉碎仪经行超声破碎细胞5 min。 a、采用冰水浴，低温操作。 b、用泡沫固定样品管。 c、探头伸入1/23/4管深。 d、数值设定：间隔3 s，超声3 s，全程5 min，温度23。（4）于4,12000 rpm，离心10 min，取上清液，得到RFP的粗提取液（Fi

15、g.1（f）。2.5 蛋白质的纯化11Ni+亲和层析柱柱体积为1.5 ml。加3倍柱体积平衡液洗柱。加1倍NiCl挂柱。加3被柱体积平衡液洗柱。添加收集的样品（上清），去杂蛋白。加3倍柱体积平衡液洗柱。加2倍柱体积洗脱液洗脱，使蛋白与树脂分离。加2倍柱体积洗脱液洗脱；收集提纯，收集蛋白。Ni+亲和曾洗柱密封保存。2.6 SDS-PAGE检测表达蛋白安装双垂直板电泳槽。制备12%分离胶，混匀后加入电泳槽的玻璃夹缝中，并在胶面上加入约2mL双蒸水，1h后等胶自然凝聚，去净双蒸水，并在夹缝中放入梳子。制备5%浓缩胶，混匀后加入夹缝中并没过梳孔，待凝聚后，小心拔出梳子，用电泳缓冲液冲洗加样孔。样品制备

16、：将样品2上样缓冲液11混匀，在100废水中水浴35 min，取出。上样：用移液器在加样孔中加样及标准蛋白1520L。电泳：在凝胶上加80 V/cm电压，待溴酚蓝进入分离胶后将电压提高到140 V/cm继续电泳，直到溴酚蓝到离底部约3 cm停止电泳。固定和染色：将分离胶从玻璃板上去下，用考马斯亮蓝R-250染色液浸泡，加热几分钟。脱色：半小时更换一次脱色液，处理35次，直到胶板呈现淡蓝色。观察蛋白现带情况（Fig.2）。2.7数据分析与结果处理（1）、IPTG诱导后菌液颜色及其表达蛋白粗提取Figure 1, the extraction of proteins(a), having expr

17、essed (b), centrifugation and precipitation (c), ultrasound buffer resuspended(d), broken after the ultrasound (f) high-speed refrigerated centrifuge（2）、SDS-PAGE检测表达蛋白Figure 2 SDS-PAGE protein detection1: standard protein; 2: containing pET-28-RFP plasmid in total protein samples of bacterial suspen

18、sion (positive control); 3: It is with empty pET-28-RFP plasmid in the broth of total protein sample (negative control 1); 4 : It is not adding IPTG in the non-diversion of the bacterium BL-21 the total protein sample (negative control 2); 5: is the addition of IPTG in the non-diversion of the bacte

19、rium BL-21 the total protein sample (negative control 3)3 结果与分析3.1 IPTG诱导后菌液颜色及其表达蛋白粗提取由图一可知，携有重组质粒pET-28a-RFP的工程菌株（E.coli）在经过异丙基硫代-D-半乳糖苷（IPTG）诱导后，E.coli诱导培养导致的一个非常直观的结果是菌液或蛋白粗提取液在日光下就显示粉红色，这表明RFP基因可能在E.coli中已经表达，并且其在日光下就能发出红色荧光。3.2 SDS-PAGE检测表达蛋白图二分析，由第1道与其他道对比可知，含有RFP基因工程菌经过IPTG诱导后大量的表达了分子量为28kDa

20、的蛋白，而在仅转化空质粒的重组工程菌E.coli中以及转化含有目标基因质粒的重组菌种均没有这一条蛋白带。这说明，RFP蛋白在原核生物E.coli细胞中获得了稳定的表达。其表达所需条件：（1）含有RFP目的基因；（2）需要IPTG诱导表达。在实验的过程中，制胶的过程出现了一些问题，使得凝胶不能聚合，分析原因可能有：(1) 试剂质量差，应使用电泳级别的试剂 （2）过硫酸铵和TEMED的量不够或失活，可增加剂量或重配新鲜的储存液 （3）凝胶聚合时温度太低，应以室温为宜。3.3 分析真核表达和原核表达的常用的另一种经典的报告基因是绿色荧光蛋白（GFP或EGFP），但GRP得缺点是组织穿透性教弱，需要紫

21、外光激发并在荧光显微镜下才能观察到绿色荧光，而红色荧光蛋白(RFP)基因在经过IPTG诱导后可以原核表达，而其表达后的培养液在日光下显示粉红色，可以直观的观察。这一结果说明RFP可作为原核表达系统的报告基因，且比GFP更加方便直观。本实验同时也验证了RFP基因在我们建立的E.col原核表达应用平台的有效性，在异丙基硫代-D-半乳糖苷（IPTG）诱导后稳定表达了RFP蛋白。总结在为期两个星期的综合实验中，我以及我们班的一些同学由王友如老师指导实验RFP的原核表达。在这短短的两个星期内，我不仅学会了如何完成一个探究性试验的过程，也学会应该怎样去发现以及学习。这次实验让我在知识的理解水平得到提高，学

22、习方法上有所拓宽。在实验过程中，由于实践与理论的联系，我对课堂上所讲到的平面的理论知识有了三维式的理解，字面的内容在实验的体会中在头脑中形象化，对微观世界里的物质与课本上的曾经空洞的消除了陌生感，对知识的认知达到一个新的层面，让我明白知识的吸收最重要的在于实践。这是我实验的首要动力。 同时我也体验到额实验艰。要真正投身实验，并不是一件容易的事。第一，也是真正重要的，是要不断的积累知识，多看文献，要做到“胸中有丘壑”；第二，是实验过程中要头脑灵活，要懂得运用一些技巧，使实验过程尽量由繁琐变简单明了，要做到这一点，第一点是必要条件，关于时间的统筹安排，尤其需要技巧；第三，也是我尤其缺乏的，就是实验

23、过程中思维的细致缜密和思想上的探索与创新，这是科研的精髓，是每一个科研工作者都应具备的。 在实验的过程中我们还应该注意的有：1 上样时，样品不能沉到加样孔底部，可能是上样缓冲液中甘油含量不足；或是加样孔底部留有聚合的丙烯酰胺。2 经过煮沸的样品虽然可以在-20保存数周，但若反复冻融会导致蛋白质的降解。从-20取出的样本，上样前应先升至室温，确保SDS沉淀溶解。3 注意避免电泳条带弯曲畸变：（1）“微笑” 现象，可能是因为凝胶中间部分温度过高，降低电压便可得到改善.（2）“皱眉”现象，常常是因为凝胶底部有气泡或聚合不均匀。（3）“拖尾”、“纹理”现象，则多为样品溶解不佳，增加蛋白样品的溶解度并离

24、心除去不溶性颗粒即可克服。（4）“晕轮”效应（holo effect）多为加样过量所致。4 非特异性的染色主要是由于未溶解的染料的沉积而成，应将染料溶液过滤后再用。最后，我感谢王友如老师在实验过程中对我们的谆谆教诲，感谢同与我们一起做实验的同学们，我们共同学习，共同克服困难，共同进步。参考文献1Matz MV, Fradkov AF, Labas YA,et al. Fluorescent proteins from nonbioluminescent Anthozoa species J.Nat Biotechnol, 1999, 17(10):969-973.2Yarbrough D, W

25、achter RM, Kallio K,et al. Refined crystal structure of DsRed, a red fluorescent protein from coral at 2.0 resolutionJ.Proc NatlAcad Sci USA, 2001, 98(2):462-467.3Baird GS, Zacharias DA, Tsien RY. Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coralJ. Proc Na

26、tlAcad Sci USA, 2000, 97(22):11984-11989.4Verkhusha VV, Chudakov DM, Gurskaya NG,et al. Common pathway for the red chromophore formation in fluorescent proteins and chromoproteinsJ.Chem Biol, 2004, 11(6):845-854.5 Yanushevich Y G, Staroverov D B, Savitsky A P, et al. A strategy for the generation of

27、 non-aggregating mutants of Anthozoa fluorescent proteins J.FEBS Lett,2002,511:1114. 6 刘娜,万瑛,周镜然,等.红色荧光蛋白与卵白蛋白表位融合蛋白的表达与纯化J.免疫学杂志,2005,21(5):382385.7 Mizuno H, Sawano A, Eli P, et al.Red fluorescent protein from discosoma as a fusion tag and a partner for fluorescence resonance energy transfer J.Bio

28、chemistry,2001,40:25022510.8 Lauf U, Lopez P, Falk M M. Expression of florescently tagged connexins: a novel approach to rescue function of oligomeric DsRed-tagged proteins J.FEBS Lett,2001,498:1115.9 Jach G, Binot E, Frings S, et al. Use of red florescent protein fromDiscosomasp. (dsRED) as a repor

29、ter for plant gene expression J.Plant J,2001,28:483491.10 Rodrigues F, Van Hemert M, Steensma H Y, et al. Red florescent protein (DsRed) as a reporter in Saccharomyces cerevisiaeJ.J Bacteriol,2001,183:37913794.11 Czymmek K J, Bourett T M, Sweigard J A, et al, Utility of cytoplasmic fluorescent prote

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31、 B,Li J,et al.Expression and Purification of Intact and Functional Soybean (Glycine max)Seed Ferritin Complex in Escherichia coli J.J Microbiol Biotechnol,2008,18 (2):299-307.15 大肠杆菌中表达外源重组蛋白的研究 吕素芳，刘峥，郭广君，蔡永萍，邱德文16 蛋白质的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 现代分子生物学技术/魏春红，李毅主编。-北京：高等教育出版社，2006.7中心地址：湖北省黄石市磁湖路11号邮政编码：435002联系电话：0714-6511613E-mail：hbnubio网 址：