课题申报书肾素血管紧张素系统免疫调节机制

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1、题目：肾素血管紧张素系统免疫调节机制及其对肿瘤免疫的作用摘要：肿瘤通过免疫逃避机制引起T淋巴细胞凋亡和增生受抑，而组织肾素血管紧张素系统(RAS)对多种组织细胞的增生和凋亡有重要的调节作用。本课题从时间动力学角度，以T细胞激活诱导的凋亡（AICD）为重点，分析RAS在细胞免疫中的表达变化、RAS对细胞免疫的调节作用及其作用机制，随之初步探讨干预RAS抑制肿瘤细胞引起的T淋巴细胞AICD的可能性。为细胞免疫和肿瘤免疫的调节提供新的思路。研究意义肿瘤的发生、发展和消退取决于与机体免疫系统的相互作用，研究肿瘤免疫的机制和影响因素，对于明确肿瘤的发生，和发展合理的免疫治疗方案均有重要意义。本项目旨在对

2、于肾素血管紧张素系统（renin-angiotensin system, RAS）这一调节包括细胞增生和凋亡等多种重要功能的系统，研究其免疫调节作用和机制，并初步研究RAS对于肿瘤免疫的作用。本项目的思路如图：机体对肿瘤的免疫反应主要是T细胞介导的细胞免疫反应，虽然多种肿瘤特异和肿瘤相关抗原已经分离鉴定，肿瘤免疫反应的先决条件已经具备，但在大多数情况下，机体对肿瘤的免疫反应是无效和微弱的。主要原因是肿瘤在与机体的对抗和选择过程中发展的免疫逃避和免疫抑制机制：1）肿瘤低表达MHC I，不表达MHC II和共刺激分子配基如B7; 2)肿瘤抗原的丧失和遮蔽；3)肿瘤分泌免疫抑制因子如TGF-beta

3、,IL-6和IL-10；4）肿瘤诱导免疫耐受；5）肿瘤或者通过表达FasL，直接杀伤激活的T淋巴细胞，或者通过重定向细胞免疫（TH1-TH2）、激活NK1.1+/CD3+细胞等机制间接诱导T淋巴细胞通过AICD凋亡。虽然肿瘤的免疫豁免机制复杂多样，最终结果是肿瘤特异性的T淋巴细胞的增生受抑和凋亡，从而导致对肿瘤的免疫无反应性1。调节T细胞的增生凋亡是调节肿瘤免疫的一个重要靶点。肾素血管紧张素系统（renin-angiotensin system, RAS）是机体进化过程中高度保守的内分泌网络，其对血压和水钠储留调节的传统的生物学功能已为人们所熟知，但愈来愈多的研究表明RAS具有广泛的生物学功能

4、，而“组织”RAS在局部表达通过自分泌和旁分泌作用，对细胞分化、增殖和凋亡的调节作用成为研究热点2。RAS的促进增殖和凋亡的作用已在包括心肌细胞、神经细胞、嗜铬细胞、成纤维细胞以及多种上皮来源细胞如血管内皮细胞、肺泡上皮细胞等细胞组织证实3。在细胞免疫中，T淋巴细胞已证实表达RAS的各组成成分，组织RAS起作用的先决条件已经具备；血管紧张素II促进小鼠脾细胞自发增殖和在混合淋巴细胞反应中增殖4，血管紧张素转化酶抑制剂卡托普利抑制T淋巴细胞AICD和Fas/FasL介导的凋亡, 在一些免疫介导的炎症中起保护作用5，提示RAS对T淋巴细胞的增生和凋亡这两种看起来截然相反的过程均有重要的促进作用。在

5、细胞免疫中，机体对免疫细胞的增生和凋亡的调节体现在克隆选择和时间动力学控制上。正常的免疫反应是一个多阶段的过程，在免疫反应中，T细胞通过抗原识别和TCR/CD3信号，通过JAK/STAT、calcineurin/NFAT、MAPK等多种信号传导途径，引起T淋巴细胞激活、增生和细胞因子分泌；同时，Fas/FasL，CTLA-4等表达增加，Bcl2/Bax、FLIP等凋亡抑制因子下调，凋3亡敏感性逐步增加，使激活的T细胞发生凋亡6。在细胞周期中，TCR/CD3信号引起细胞周期的进展和细胞激活增生，而进入G1A但不能通过G1/S调定点的细胞将通过AICD凋亡7。机体通过对信号传导通路和细胞周期的调控

6、，使细胞的表型和细胞因子分泌、关键细胞蛋白发生有序变化，从而实现免疫细胞增生和凋亡的精确调控，既保证免疫反应，又避免免疫反应过度，保持免疫稳态。(如图：)： RAS能通过多条信号传导通路发挥作用，在T淋巴细胞可能影响calcineurin/NFAT途径4。RAS信号传导与TCR/CD3信号的相互作用（拮抗和协同/相加）和其作用时T细胞所处的状态，将决定RAS调节凋亡和增生的方向。我们设想RAS对免疫的调节作用，不在于它能调节免疫细胞的增生还是凋亡，而在于RAS调节增生和凋亡作用是否和正常免疫反应的动力学相吻合，从而决定RAS起促进或抑制作用。当然，此设想过于简化，但是，从时间动力学角度，分析R

7、AS在细胞免疫反应的不同阶段，尤其是在细胞激活增生阶段和AICD凋亡阶段的作用，将对正确理解RAS免疫调节作用有重要意义。而最新研究血管紧张素II促进小鼠脾细胞自发增殖，和在混合淋巴细胞反应中增殖，血管紧张素转化酶抑制剂卡托普利抑制T淋巴细胞AICD和Fas/FasL介导的凋亡，提示RAS信号和正常的免疫反应CD3/TCR信号和时间动力学能起协同作用。本项目1）以人周围血T淋巴细胞为实验对象，以CD3/TCR信号刺激T细胞激活增殖、和激活诱导的细胞凋亡（AICD）两阶段为主，从时间动力学角度，力图从总体上把握RAS对细胞免疫的调节作用。2）重点分析RAS对T细胞AICD的调节作用，初步分析RA

8、S对肿瘤介导的T细胞AICD这一重要免疫逃避机制的调节作用。从动力学角度分析RAS对T淋巴细胞增生和凋亡的调节作用，有助于真正明确RAS的免疫调节作用和机制，从而为发展新的免疫调节手段开辟途径。由于包括胃癌和肝癌等多种肿瘤组织低表达或不表达RAS8,多种成熟的和高特异性的RAS干预手段和药物的存在，预示着调节RAS在调节肿瘤免疫和肿瘤免疫治疗方面的广泛前景。国内外的研究现状RAS在心肌细胞、血管内皮细胞和肺泡上皮细胞等多种组织和细胞的增生和凋亡调节作用及其信号传导通路已进行了深入研究，证明RAS对细胞增生和凋亡起重要调节作用。近两年来RAS对免疫的调节作用逐渐引起重视，目前已经证明：1）T细胞

9、和巨噬细胞表达RAS各组成成分；2）血管紧张素II能通过AT1受体促进T细胞增殖 ，敲除小鼠AT1受体能阻断ANGII的作用；3）血管紧张素转化酶抑制剂卡托普利抑制T淋巴细胞AICD和Fas/FasL介导的凋亡；4）血管紧张素转化酶抑制剂对免疫性炎症有保护作用; 5)RAS参与T细胞的calcineurin/NFAT信号传导通路。但尚有几个关键问题没有解决：1）大多数实验结果来源于动物实验；2）大部分研究局限于血管紧张素转化酶抑制剂，而未对RAS进行系统性的研究。3）虽然提示RAS对T细胞的增生凋亡均有促进作用，但未阐明RAS如何调节淋巴细胞增生和凋亡这两种看起来相反的作用，以及RAS对细胞免

10、疫调节的最终效果；4）未阐明RAS调节淋巴细胞功能的信号传导通路和细胞周期的调控机制。RAS在肿瘤免疫方面的研究国内外尚是空白。 3 三、研究方案1. 研究目标、研究内容和拟解决的关键问题研究目标1） 检测RAS各组成成分在淋巴细胞的mRNA和蛋白表达。2） 从时间动力学角度，以T细胞激活增殖、和激活诱导的细胞凋亡（AICD）两阶段为主，在免疫反应的包括：静止-激活（细胞因子分泌）-增生/分化-免疫下调（细胞凋亡和记忆细胞形成）过程中的不同阶段，分析 RAS的表达变化，分析RAS对T细胞细胞因子分泌、增生和凋亡（AICD）的影响。3） 探讨RAS对T淋巴细胞AICD调节作用的细胞信号传导机制。

11、4） 检测RAS在肿瘤细胞中的表达，初步探讨RAS对肿瘤介导的T细胞AICD这一重要免疫逃避机制的调节作用。研究内容1） 收集健康志愿者新鲜周围血PBMC，采用CD3单克隆抗体刺激T细胞，辅以IL-2，制作T细胞多克隆激活免疫反应和AICD的模型。根据T细胞的表型（phenotype：包括细胞因子分泌情况和表面分子marker的表达）对免疫反应进行分期。2） 分析 RAS对于T细胞细胞因子分泌、增生和凋亡的影响，明确RAS免疫调节作用的时间动力学。在T细胞激活增殖、和激活诱导的细胞凋亡（AICD）两阶段：a) 定性和定量测定RAS组成成分（血管紧张素原、AngII和AT1受体）的表达及其变化情

12、况。b) 采用AngII、ACEI(包括Captopril和Enalapril)和AT1受体特异阻断剂（Losartan）在不同层次上对RAS进行干预，分析 RAS对于T细胞细胞因子分泌、增生和凋亡的影响。3） 从细胞信号传导机制明确RAS的对T细胞凋亡和AICD的调节机制。检测T细胞两条主要凋亡通路的关键信号传导分子：Bcl-2(线粒体/细胞色素C凋亡途径)，FLIP（AICD，Fas/FasL介导的细胞凋亡途径），分析RAS调节何种T细胞凋亡通路，及其在传导通路上的调节作用点。4） 收集同一肿瘤患者的PBMC和肿瘤切除标本中的肿瘤细胞并培养，定性定量测定肿瘤细胞的RAS组成成分表达。制作M

13、HC限制的肿瘤细胞免疫抑制和肿瘤诱导T细胞AICD模型，分析RAS对肿瘤诱导T细胞AICD的调节作用。拟解决的关键问题：1） 明确RAS在免疫反应不同阶段的作用，在免疫反应过程中的免疫调节作用的动力学，以及RAS免疫调节作用的综合效果。2） 明确RAS对T细胞AICD调节作用的细胞信号传导机制。3） 制作MHC限制的肿瘤细胞免疫抑制和肿瘤诱导T细胞AICD模型。4） 合理选用RAS干预手段，调整RAS调节细胞免疫调节肿瘤免疫。42. 拟采取的研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析研究方法a) 细胞生物学方法：肿瘤细胞的培养；人周围血T淋巴细胞的分离、纯化、培养和激活。b) 分子生物学方法：免

14、疫组化、RT-PCR、western blot、Northern Blot定性定量测定c) 免疫学方法：流式细胞仪测量细胞周期、双染色测定细胞凋亡；H3摄入测定细胞增生活性，JAM-Test定量测定细胞凋亡；免疫荧光法测定Caspase3活性。肿瘤细胞/淋巴细胞混合培养。技术路线分为两部分，两部分有交叉5实验方案说明：可行性分析本课题思路明确，技术路线可行，课题组成员均参加过省部级项目研究，具备相关实验技术和方法；已熟练掌握课题中所需要的细胞分子生物学技术，免疫学技术，流式细胞术，而且大部分技术在以往或正在进行的项目中使用；本课题组具有治疗普外科肿瘤包括胃癌、肝癌的丰富临床经验，在胃癌的免疫治

15、疗方面较有心得。以上情况说明我们有能力在此领域开展深入研究。本项目的创新之处：1. 率先开展对组织肾素血管紧张素系统对细胞免疫的调节作用的深入研究，结合细胞满意动力学分析明确RAS的免疫调节作用，并深入研究起作用的信号传导和细胞周期调控机制。目前尚未发现对RAS免疫调节作用较为系统的研究及相关文献。2. 率先开展RAS对肿瘤免疫调节作用的探讨，本研究可能的RAS干预方法机制调节肿瘤免疫。目前国内外在此方面尚是空白。4. 年度研究计划及预测进展2003年1月2004年12月：收集胃癌、肝癌组织标本。测定肿瘤组织RAS表达与正常组织的差别。2003年1月2003年5月：人周围血淋巴细胞RAS表达的

16、检测2003年3月2003年7月：完成Northern Blot、western Blot、RT-PCR等检测技术、CD3抗体/IL-2激活淋巴细胞、增生和凋亡检测等的技术考核。2003年8月2004年3月：完成RAS对免疫细胞增生、凋亡和细胞因子分泌的作用检测。2004年4月2004年5月：阶段总结，合理调整思路，准备对RAS调节机制的研究。2004年5月2004年12月：RAS免疫调节细胞信号传导通路的研究。2005年1月2006年5月：RAS免疫调节细胞周期调控的研究。2005年6月2005年9月：RAS对肿瘤免疫调节的初步研究。2005年10月2005年12月：统计数据，结合分析得出结

17、论。5. 预期研究成果1）明确RAS在T淋巴细胞表达情况。2）明确肿瘤细胞RAS表达的变化。3）明确RAS在免疫反应不同阶段和过程中的免疫调节作用的动力学。4）与正常细胞免疫动力学结合分析，得出RAS免疫调节作用的综合效果。5）采用合理的RAS干预手段，能调节RAS调节细胞免疫。6）采用合理的RAS干预手段，能调节RAS调节肿瘤免疫。登记序号： 项目编号：中医药、中西医结合科研项目课题设计书课题名称：痛痹颗粒对骨关节炎细胞凋亡和增殖的机理研究申报单位： 江苏省中医院课题负责人： 朱萱萱计划年限：邮政编码： 210029 联系电话： 8661714130306申报日期：江苏省中医药局制填写提纲一

18、、立项依据：与选题直接相关的国内外现状、水平和发展趋势；选题的理论和实践依据；研究目的、意义；本研究达到的科学技术水平，预期社会经济效益和应用推广前景。二、科研假说或技术构思，主要研究内容、关键技术、目标（达到的主要技术指标或技术经济指标），技术特征及创新之处，开发项目应说明开发规模。三、研究试验方法及技术路线（工艺路线）。四、现有工作条件和基础：开展本项研究的技术优势，现有的主要仪器设备及应用合格实验动物的基本条件等；已有工作基础，预试验情况。五、计划进度：根据总的研究期限、年度计划进度，分别列出具体的目标和进度的考核指标。六、参加（协作）单位意见及具体分工（附协议书）。七、经费概算（包括其

19、他部门的拨款、贷款、自筹记忆取得的自主）和核算依据，以及分年度使用计划。填写说明一、内容填写自备附页，用纸大小和封页一致，字迹清楚，装订整齐后按申报要求上报。二、填写提纲所列内容，要全面详细、如实填写。三、封面上“登记序号”“项目编号”请勿填写。1、 立项依据1.1 研究目的、意义骨关节炎（osteoarthritis，OA）又称退行性关节病，以关节软骨发生弥漫性龟裂、纤维化和脱失及因骨组织增生性变化为特征的一组临床征候群，是多见于中年以后的慢性进行性关节疾患。该病发病率随年龄增长而升高，据调查，在美国目前2亿多人口中，就有骨关节炎4500万，发病率占总人口的20%，在老年人中所占比例更高，5

20、0岁以上人群中，OA的患病率仅次于心血管疾病，位居第二位。在我国，根据流行病学调查显示，5564岁的人群中发病率达40%，而65岁以上人群的患病率达60%90%。随着计划生育政策的长久实施及经济发展，我国已进入老龄化社会，OA的发病率还将越来越高，这不仅严重危害人民的生活、健康，对社会也将造成很大负担。同时世界其他国家也面临着同样的问题，因而OA引起了国际、国内医学界的相当重视。近年来对OA的研究颇多，在发病机制、检测手段以及治疗方法上均取得较大进步，但总的来说还缺乏令人满意的突破性进展。西药治疗OA的主要手段是非甾体药，但存在副作用大、作用单一及有较多禁忌症等缺点。虽然中药治疗OA也取得了一

21、些经验，但对其具体的作用机制有深入研究的却很少，因此在中医理论的指导下，运用现代科学技术，对疗效确切的中药复方进行深入的机理研究，使中药治疗OA的疗效在国际先进行列中占一席之地，是摆在我们面前非常重要的课题。1.2 国内外现状水平和发展趋势近十年来，国内外对OA进行了较深入地研究，大致归纳如下：1.2.1 流行病学研究已广泛开展在近100种不同类型的关节疾病中，OA是影响人类健康最常见的关节疾患之一，没有明显的种族和地域差异，本病的患病率随年龄增加而增高，故随着人类平均寿命的延长，患病率也有增高的趋势。Felson等报道70岁以下人群膝OA患病率为7%（男6.4%，女11.4%），80岁以上为

22、11.2%（男5.4%，女15.8%）；而放射学膝OA70岁以上为27.4%（男30.4%，女25.1%），80岁以上为43.7%。Butter等报道，44岁以下、4559岁、60岁以上人群中，放射血OA 患病率各为6.2%、21.6%和42.0%。国内陈顺乐等队13541名钢铁工人的调查结果显示，症状性OA患病率2.2%；无症状性OA患病率53%，其中3039、4049、5059岁患病率各为11%、27%和62%。汕头大学医学院统计551例，结果40岁以下、4049、5059和60岁以上各占12.2%、17.4%、26.1%和44.3%。另外不同关节OA易感性不同。美国在卫生统计中心调查结果

23、，OA患病率以手最高，以下依次为足、膝、髋。国内陈顺乐等调查结果OA是颈椎最多，以下依次为腰椎、膝、手和腕。本病性别差异在脊柱差别不大，但手、膝、髋OA均以女性较多，且女性骨关节炎的遗传易感性较男性高。在Framingham的研究中，Felaon等发现女性体重减少11磅，骨关节炎形成的风险相应减少50%。 Saase等调查结果，膝OA患病率男、女峰值分别为24.7%和54.6%。根据1994年统计，在美国，骨关节炎的消耗为155亿美元，约为类风湿关节炎的3倍，其中一半以上消耗缘于工作丧失。在我国虽未作全国大范围的普查，但随着老龄化社会进程的不断加快，OA的发病率会越来越高，这必将给家庭、社会带

24、来沉重负担。1.2.2 病因、发病机制有了巨大突破目前基础研究认为软骨的损伤与退变是OA的根本，随着分子生物学免疫学的发展，近年来众多学者对OA关节软骨退行性改变的原因从不同角度进行了大量研究，其发病机制仍未完全明了，又提出了许多学说，如软骨下骨内高压学说：由于骨血液动力学的改变，在骨髓腔容积不变的前提下增加内容物引起压力增高，即表现为骨内压力增高。骨内高压持续增高存在下关节滑液pH值下降，成分改变，干扰并破坏了软骨细胞的正常代谢导致细胞变性坏死，胶原纤维解聚，蛋白多糖分解，软骨下骨破坏、修复，最终产生骨性关节炎。自由基学说：认为自由基对软骨细胞DNA和PG的合成具有抑制作用。自由基作用软骨细

25、胞后，引发膜脂质过氧化，使脂质过氧化代谢产物丙二醛增多，丙二醛可与DNA发生交联，自由基也可直接攻击软骨细胞DNA即合成DNA所需的酶，使DNA链断裂、碱基损伤从而影响了DNA的合成，也造成前列腺（PG）合成障碍。骨关节炎时，滑膜、滑液、血管翳内常有中性白细胞、巨嗜细胞浸润，其表面受免疫复合物、补体等作用能释放大量O2-和H2O2；细胞因子学说：细胞因子对骨关节炎的发生、发展起了重要作用，如白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子（TNF）等在OA中水平明显增高。IL-1具有刺激软骨细胞分泌一氧化氮、前列腺E和IL-6的作用，引起滑膜炎症和疼痛，同时IL-1也是软骨

26、基质降解的主要驱动因子；软骨酶降解学说：OA软骨细胞的基质降解酶类的合成与分泌率明显增加，并与关节炎的严重程度密切相关。参与降解基质大分子的降解酶类可以增加达到几倍。酸性和中性蛋白酶可以降解蛋白多糖的核心蛋白。基质金属蛋白酶，尤其是基质溶素和胶原酶，参与关节软骨的降解过程，这些酶类可以降解细胞外基质的所有成分，与循环系统中的纤维蛋白溶酶和局部合成的纤溶酶原一起，快速降解软骨。在滑膜细胞和软骨细胞产生的IL-1和TNF的作用下，软骨细胞以酶原的形式分泌大量的基质金属蛋白酶，而对金属蛋白酶组织抑制剂无影响，使二者失衡从而增加对软骨主要成分型胶原和蛋白聚糖合成的抑制作用，使软骨进行性破坏；一氧化氮学

27、说：NO是一种细胞间信使分子，可介导许多生物学现象。NOS可催化重要炎性介质NO的产生，OA患者血清、滑液中NO含量明显高于正常。NO可通过抑制软骨细胞增殖，促进软骨细胞凋亡，改变蛋白多糖和胶原蛋白的合成与分泌功能，同时使软骨细胞分泌透明质酸减少，滑膜粘蛋白解聚，抑制软骨细胞合成软骨基质，促进软骨细胞糖酵解，使软骨破坏。细胞凋亡学说：细胞凋亡是细胞死亡的形式之一，许多正常组织均可发现凋亡，但凋亡亢进与不足则会引起相关疾病，在骨关节炎患者软骨中软骨细胞的凋亡有异常表现，且凋亡细胞数目与骨关节炎严重程度明显相关。凋亡小体存在于软骨细胞小孔或间隙内，其产生的焦磷酸盐能从溶液中沉积钙，有NTPPH（n

28、ucleosid triphosphate pyrophos phohydrolase）和碱性磷酸酶作用,造成余下软骨细胞修复过程失败，而逐渐发展成关节软骨的完全丢失。OA软骨细胞凋亡主要通过两种相互独立的途径完成，一种是同滑膜炎症无关的途径,由NO介导;另一种是同滑膜炎症相关的途径,由Fas介导。典型的OA不存在明显的炎症反应,此时软骨细胞凋亡以NO途径为主;当产生炎症反应时,则通过as途径加剧软骨细胞凋亡和关节破坏。NO通过两种方式造成组织及细胞损伤。一是高浓度的NO能抑制多种与线粒体呼吸传递系统及柠檬酸循环有关的酶,从而抑制线粒体呼吸,造成组织损伤;二是NO与超氧化阴离子2-反应,生成氧

29、化亚硝基阴离子ONOO-,在酸性条件下(如病理条件)迅速分解为OH-和NO2自由基,这两种自由基具有很强的细胞毒性,可造成组织细胞损伤。在OA患者中,受损区软骨细胞的凋亡比例明显高于未受损区。Fas表达的结果与其相符,OA受损区的Fas表达远高于未受损区,提示Fas表达可诱导软骨细胞凋亡。除NO途径和Fas途径外,还有一些因素可导致软骨细胞凋亡、关节破坏,如IL-1、IL-8、TNF-、PGE2、Aggrecan G1区等。1.2.3 治疗方面有了不少新方法目前中西医治疗OA的药物较多，西药治疗OA主要有三大类，第一类为快作用药，即非甾体药，特点是发挥作用快，但副作用较大，对胃肠、肝肾、血小板

30、均有较大影响，OA多为老年人，长期服用此类药尤其不能耐受，且部分药物价格不菲，而且由于过分的镇痛，导致病人失去警惕过分运动，以致出现“消炎痛髋”，从长期疗效来看反而不佳，最新观点认为乙酰氨基酚应作为治疗OA的首选药，但尚有一定争议，且同样存在上述副作用；第二类为慢作用药，发挥作用慢，疗效不确切，价格昂贵，临床上尚未广泛运用；第三类为软骨保护剂，尚未问世。关节清理术、膝关节置换术，适应症较少，费用高，创伤大，病人难以接受。中哦药治疗OA的研究取得了可喜的进步，但中药治疗仍存在较多共性的问题：多属临床经验，无对照组，特别是西药对照组观察，处方不固定。缺乏用客观的最新的国际公认的、量化的临床观察指标

31、及疗效判断标准为手段来寻找治疗OA的中药。未针对OA发病机制进行临床及动物试验从生化、免疫、病理、细胞分子水平来探讨中药的药物作用机理。缺乏高效的、作用综合、副作用小的新药。中医认为OA属痹症中的痹、痛痹、骨痹，认为其病因与年老体衰、长期劳损、外感风寒湿邪有关，明确指出肝肾亏虚、气血不足、筋骨失养为OA的发病基础，而寒湿、痰瘀为病理因素及病理产物。周尊谦等人在传统中医理论基础上，阐述了膝OA骨内高压血瘀证氧自由基之间的密切关系；谢林等论述了膝OA与血瘀证之间的内在联系，旨在为运用活血化淤药治疗OA提供理论依据。治疗方面从古到今绝大部分医家皆针对其病因病机采用益肝肾、强筋骨、补气血治其本；散寒通

32、络、化痰胜湿治其标。独活寄生汤是用于治疗风寒湿痹、关节疼痛和脑血管后遗症的传统固防，具有补肝肾、活血通络之功，临床常见本方加减治疗OA，疗效比较肯定。朱健儿以本方加味治疗262例，总有效率94.7%。单文龙等用本方加减治疗骨关节炎24例，有效率为87.5%。陆智报道用本方加减治疗104例，总有效率91.3%。1.2.4 实验研究方面有了较大的进展随着对OA发病机理的不断深入认识，对OA的实验研究方面也开始了向多层次多角度的方向发展。动物实验不再只局限于微循环和一般抗炎、镇痛试验，现已使用针对OA的动物实验，并采用相关的指标进行检测。目前实验研究内容主要有以下几个方面，研究最多的是OA的血液流变

33、学、氧自由基及一氧化氮含量等，这些试验一般均可通过建立骨关节炎的模型来完成，也可通过使用其它相似的模型检测相关指标来进行，如可建立急性血淤模型来检查血液流变学指标，使用老龄动物通过检测体内SOD及MDA含量推断药物的抗氧自由基的能力等。在NO对OA影响的实验中，一般采用硝酸还原酶法来测定NO含量，运用PT-PCR技术测定NOS基因表达。IL-1、IL-6、TNF等细胞因子、软骨降解酶尤其是基质金属蛋白酶、诱导关节滑膜炎症的物质如纤溶酶原/纤溶酶原激活物和前列腺素PGE2、软骨细胞的细胞凋亡及增殖情况、性激素水平等也越来越多地被作为检测指标使用到实验研究中来。1.3 选题的理论和实践依据祖国医学

34、并无骨关节炎的病名，从历代文献来看本病应归属于“骨痹”、“痛痹”范畴。我们认为OA病人除了肝肾亏虚，寒湿痹阻外，一般OA病人体重超重较多，也即为痰湿偏盛之体，另外脾虚生湿及寒湿痹阻日久湿聚成痰，痰淤交阻是引起膝关节肿胀畸形、活动受限的重要因素，所谓顽症怪病皆质之于痰淤。基于现代医学对OA发病机理的深入研究，我们在补益肝肾、活血通络基础上，结合中药对缓解软骨降解，增加软骨细胞功能，抑制滑膜增生及炎症的研究成果，于1995年即对备急千金要方中的独活寄生汤进行化裁，重用活血化淤，加用化痰清热之品，总结制定出了高效、药源广泛、安全可行的痛痹颗粒，并于1999年采用痛痹颗粒的组方治疗膝OA，方中以独活为

35、君药，以祛下焦与筋骨间风寒湿邪；威灵仙舒筋通络止痹痛；淫羊藿、怀牛膝补肝肾，强筋骨，通经络，其中怀牛膝为引经药；当归养血柔肝、舒筋活血；川芎则通达四肢关节，为血中气药；虎杖活血清热解毒，同时防诸药辛燥太过。诸药合用共起补肝肾、祛风湿、化瘀痰之功，冀能消炎止痛，保护软骨。通过36例的临床研究、观察，结果表明本方疗效显著且副作用小。因此有必要对痛痹颗粒治疗骨性关节炎的作用机制尤其是该方对软骨细胞的细胞凋亡与增殖机理做进一步的研究，冀能证实痛痹颗粒的临床疗效，明确其作用机制，并初步探讨本病发病的可能机理，为新药问世提供客观的依据，所以进行设计并立题。1.4本研究达到的科学技术水平，预期社会效益和应用

36、推广前景1.4.1继承和发扬祖国医学，保持中医特色，以临床疗效为前提，以实验研究为基础，制造规范化大鼠的膝OA模型，从发病机理探讨本药的作用机制。本实验采用可靠地国际公认的方法复制动物模型，并采用最新的检测指标IL-1、TNF、SOD、MDA、NO等，总之本研究基于现代医学对OA发病机制的最新研究成果，从生化、免疫等多个角度多个层次，系统观察并进行归纳总结，确保本课题不但可行而且先进，冀能填补省内外运用中药治疗OA的空白，并希望以此为基础，进一步从细胞水平（包括本药对软骨细胞及细胞凋亡与增殖的影响）研究中药对OA的长久作用及影响，从而达到挤身国际先进水平的目的，让中药真正走向世界。1.4.2目

37、前，中药治疗OA的方法颇多，但大多以临床疗效研究为主，大样本、规范化的研究很少，中医中药治疗机理的研究，虽有涉及，但大多分散且存在一定的重复性，理想的治疗药物尚未问世，具有公认疗效的小儿迁延性腹泻临床治疗方案尚未确立，其疗效评价体系尚需研究确定，尤其是缺少中医药治疗学整体研究思路与方法，使中药复方治疗OA的疗效机理尚未能全面揭示，影响了该领域研究的深入。而痛痹颗粒是在中医理论指导下选用千金要方中独活寄生汤进行加减所得，并采用可靠的实验模型及最新的国际公认的相关指标进行实验研究，观察其对OA的确切疗效及作用机理，这必将对OA的中医理论产生较大影响，同时对临床治疗也起到更好的指导作用，从而产生较好

38、的社会经济效益。随着改革开放的形势发展，以及中国加入WTO与国际接轨的进程的不断完善，祖国医学国际地位不断的提高，我们将从祖国医学宝库中发掘出的治疗OA的高效药物与现代新技术、新方法进行研究总结，从而为人类造福，为振兴中医事业做出应有的贡献。2.科研假说或技术构想：主要内容、技术关键目的，技术特征及创新之处，开发项目应说明开发规模。2.1主要内容2.1.1探讨OA的病因病机，提出新见解，发展中医理论。2.1.2运用现代科学技术，开展实验研究，从分子生物学、免疫学、生理生化学等多方面来探讨“痛痹颗粒”治疗膝OA的疗效机制及药理毒理作用。2.2主要技术关键2.2.1膝OA模型的复制目前所使用的OA

39、动物模型一般可分为两大类，其一是诱发模型，即通过各种操作方法如制动、手术、关节内注药、关节内植入软骨碎片或微粒等诱导OA产生；另一类为自发模型，即不用任何外界干预，动物自发OA，如C57黑鼠等。在选择动物模型时一般应考虑动物的种属（包括其生活习性、关节结构、组织学及病理学特征）、不同方法的造模机制和OA模型的特点，并应参照研究目的加以选择。在诱发模型中，常用的方法是手术造成关节的应力改变及关节腔内注入木瓜蛋白酶， 这两种方法都能复制出较成功较高的OA模型，且操作较为简单。具体的造模机制在于低应力可以造成软骨厚度减少，SO染色变淡，水分增加，蛋白聚糖聚集度损伤等变化，木瓜蛋白酶作为一种蛋白水解酶

40、会引起关节软骨的退行性改变。在具体的造模过程中我们选用以上两种方法来分别复制动物模型。用于动物模型的动物一般有狗、兔、鼠等，我们选用大鼠做OA模型，因为该模型关节软骨退变的组织学特征与人类相似，且动物来源较广泛，且经济。2.2.2关节软骨细胞的获取和培养基于来源广泛，操作可行的原则，目前用于体外培养的软骨细胞一般均为兔关节软骨细胞原代培养所得。软骨需在严格无菌的条件下分离，经过一系列的漂洗、消化等工作后获取软骨细胞。目前还没有专门用于软骨细胞培养的培养液，国外采用的培养液种类繁多，有199、1640、F12、改良Eagle等，国内的有199、1640、DMEM（高糖）等，其中加入胎牛血清（占1

41、5%），一般以使用DMEM培养液居多。在培养液中还含有一些辅助添加剂，包括25mmol/L Hepes、1mmol/L 丙酮酸钠、2mmol/L 谷氨酰胺、50umol/L 二硫基乙醇以及10万单位/L的青霉素和10万单位/L的链霉素，PH7.4。培养过程中一般使用5%CO237的恒温培养箱。2.2.3采用的检测手段及指标在病理组织形态学的检查中，一般采用以下几个观察指标：大体肉眼观察软骨及滑膜表面情况；HE染色观察有关的形态变化；Masson三色染色观察胶原的变化；Sanfranin-O即沙红O染色用于组织学评分，评分方法按Mankin法；电镜下观察软骨细胞内结构形态变化及其周围胶原纤维的变

42、化。在细胞培养的相关检测中，我们采用MTT法检测软骨细胞的增殖能力，用全自动生化分析仪对检测总蛋白含量，使用细胞流式仪进行细胞凋亡的测定，对iNOS、NO含量的测定则使用分型NOS试剂盒和NO试剂盒。2.3目标（达到的主要技术指标或技术经济指标）、技术特征及创新之处。现代科学技术与中医药理论相结合，深入研究中医药治疗OA的作用机制，为临床应用提供更加科学有利的客观依据，发挥中医药治疗OA的特色和优势，为临床常见、严重影响人类健康的OA研究出有效、安全、便于推广应用的中医药治疗方法，使能迅速缓解症状，大大减轻病人痛苦，降低膝骨关节炎的致残率和复发率，且副作用小的简、便、廉、验的中药制剂问世。治疗

43、膝OA的新药生产及对其在治疗中所起作用机制的深入探讨，既符合国情又能够走向世界，产生较大的社会和经济效益，这必然形成高新技术产业进入高新领域，对促进科技进步，发展中医药，有着积极的作用，同时这也是中药现代化研究的发展方向和新的探索。3.实验研究方法及技术路线。3.1对实验性大鼠骨性关节炎的防治作用 OA模型的制备：（1）取SD雄性大鼠50只，体重200220g，固定，常规备皮消毒，沿髌韧带内侧缘切口，切断双后肢内侧副韧带及膝前内侧筋膜扩张部，并在断端处修剪去除约2mm，造成双后肢膝外翻畸形。术后第二天放造模大鼠于拖箱内每天赶其行走30m。（2）取SD雄性大鼠50只，体重200220g，4%木瓜

44、蛋白酶溶液与0.03mol/L半胱氨酸溶液1：1混置0.5小时后，分别在第1、3、5、7天于实验大鼠膝关节腔内注入混合液20ul。方法：将造模后的大鼠随机分为模型组、阳性对照组（维骨力组）、治疗组，另设正常对照组，分别灌胃给药或蒸馏水，连续7周。七周后将动物麻醉后，立即将大鼠以仰卧位固定，颈总取血，接入试管中，2000rmp15min离心获取含药血清；切开关节囊，进行大体观察后，然后以锐利刀片切取膝关节前正中部分的滑膜组织，作HE染色，电镜下观察。再用锐利刀片切取股骨内倮软骨使其呈2mm1mm全层软骨标本，2.5%戊二醛溶液固定，电镜下观察。所余之股骨内倮连同软骨下骨一并切下，10%福尔马林溶

45、液固定24小时以上，分别作HE、沙红-O及Masson三色染色后光镜检查，取样后即可将动物处死。观察指标：大体肉眼观察软骨及滑膜表面情况；HE染色观察有关的形态变化；Masson三色染色观察胶原的变化；Sanfranin-O即沙红O染色用于组织学评分，评分方法按Mankin法（附评分等级表如下）；电镜下观察软骨细胞内结构形态变化及其周围胶原纤维的变化。评分等级.结构正常 0表面结构微小不规则 1表面结构中等不规则 2表面结构严重不规则 3过渡层出现裂隙 4辐射层出现裂隙 5钙化层出现裂隙 6过渡层消失 7辐射层消失 8钙化层消失 9结构完全破坏 10.细胞1. 切线的区域正常 0细胞肿胀 1细

46、胞消失 22. 过渡和辐射的区域正常 0少量的细胞增多 1中等量的细胞增多 2大量的细胞增多 3少量的克隆 4中等量的克隆 5大量的克隆 6少量的细胞减少 7中等量的细胞减少 8大量的细胞减少 9细胞消失 10.变异标记 完整 0多层 1模糊 2血管的交叉 3.血管翳形成没有 0少量 1中等量 2大量 33.2 对体外培养兔膝关节软骨细胞的影响 3.2.1 兔膝软骨细胞的原代培养 无菌条件下取两周龄新西兰白兔后肢关节，用刀片取关节表面软骨，收集在含磷酸缓冲液（PBS）的无菌小培养皿内，反复清洗除去软骨片表面的血液，以及可能勿带之滑膜组织。漂洗完毕后，用无菌的眼科小剪刀在培养皿中将其细切至不大于

47、1mm3。切碎后将其装入10u试管内，按1：10量加入消化酶类进行化学解离。先用0.25%胰酶消化30min，然后去除胰酶，加入0.2%胶原酶消化78小时后，1500rpm10min离心，弃上清，加入PBS，摇匀在同上离心弃上清，在加PBS反复三次，最后一次加含15%胎牛血清DMEM培养液，用吸管轻轻吹打均匀，200目筛网过滤，放入培养瓶中， 5%CO237培养箱培养，定期换液，并观察照相，长满后用0.25%胰酶消化传代。3.2.2 对软骨细胞增殖反应的作用 将在培养瓶中长满的细胞消化，接入96孔培养板中，100ul/孔， 待细胞长成单层后，将旧液弃去，用PBS轻轻荡洗一遍，然后加入含药血清，

48、100ul/孔，每组4个复孔。二氧化碳恒温培养箱孵育72h后，取上清液。每孔加入MTT试剂20ul（5g/L）既无血清培养液100ul，再孵育4h。取上清，每孔加入200ul溶甲瓒液，以主波长570nm，参比波长690nm于酶标仪上比色，读取吸光度（A）值。3.2.3 对软骨细胞的细胞凋亡的影响 单层细胞培养板制作同上，加入含药血清，每组4个复孔，于5%CO237培养箱中培养48h，弃去旧液，用0.25%胰酶消化待细胞有变圆趋势即取出消化液，加入PBS，用吸管轻轻吹打，使成单个细胞悬液，移入离心管离心，1000rpm，5min，去掉上清液，约留0.5ml细胞悬液，用振荡器使细胞分散，用细滴管或

49、注射器将细胞迅速注入4冷乙醇中（乙醇终浓度为70%），用细胞流式仪检测凋亡细胞数目，计算凋亡百分率。3.2.4 对软骨细胞蛋白合成和NO含量的影响 同样将各组含药血清加入已长成单层细胞的培养板内，CO2恒温培养箱培养48h后，收集上清液，用全自动生化分析仪检测总蛋白含量，用分型NOS试剂盒和NO试剂盒检测各组iNOS、NO含量。3.2.5 拆方后对软骨细胞的影响 进行拆方实验，筛选出补肝肾组方、祛风湿组方和化瘀痰组方三组，对这三组及复方分别进行体外的软骨细胞实验，设立阳性对照组（维骨力组）：细胞毒性实验 将各组方药液用培养基分别配成几个待测浓度，加入已长成单层细胞的培养板内，分别观察24h、4

50、8h、72h细胞形态的变化，选择细胞不发生变圆、萎缩、漂浮的最大浓度为药物对细胞的最大无毒浓度，以便继续实验。对软骨细胞的细胞凋亡、增殖、NO含量及iNOS基因表达的影响 将各组方药液分别配置成最大无毒浓度，加入已长成单层软骨细胞的细胞培养板内，具体检测操作则同加入含药血清的实验。4.现有工作条件和基本条件本课题主要承担者是江苏省中医院临床医学研究所。本所具有江苏省科学技术委员会，江苏省标准局颁布的动物饲育环境合格证书，动物质量合格证书，人员素质高，均拥有实验动物从业人员岗位证书。仪器设备先进完善，拥有无菌室，能够进行细胞培养及指标检测等一系列工作，具有较强的科研能力。本组方的提供者是本院的风

51、湿科，该科拥有专科病房（20张病床）及全天专科门诊，同时还开展了专病门诊（包括OA），技术力量较强，技术水平较高，在省内外中西医风湿界均有一定的影响。本课题负责人朱萱萱主任药师，副教授，是省药理学会理事、中华中医药学会制剂分会委员。主要从事中药药理，毒理和中药制剂的研究工作。 养阴生肌膜治疗口腔溃疡的临床及实验研究获省中医药科技进步一等奖、排名第3；保精片治疗前列腺炎的实验研究获省中医药科技进步二等奖、排名第4 ；中医治疗原发性视网膜色素变性临床及机理研究获省中医药科技进步一等奖、排名第5；小儿退热滴肠液的临床研究获省中医药科技进步二等奖、排名第4；洋金花伤膏获省中医药科技进步二等奖、排名第4

52、；克乳痛治疗乳腺炎的临床及机理研究获省政府二等奖、排名第6；津血源治疗干燥综合症的临床及实验获省政府三等奖、排名第5；宫颈宁治疗宫颈炎的临床及实验研究获省中医药科技进步二等奖、排名第5；养心托毒颗粒剂治疗病毒性心肌炎的临床机理研究获省政府三等奖、排名第5；血康糖浆治疗小儿贫血的临床和实验研究获市科技进步三等奖、排名第3；中药缓释口腔粘附片的研制获市科技进步三等奖、排名第1。通过成果鉴定项目有：病毒清眼膜的研制消症饮治疗子宫内膜异位症临床和实验研究强心合剂治疗心衰的临床及实验研究病窦灵治疗窦房结综合症临床及实验研究乌鳖口服液治疗卵巢功能早衰的实验研究 益肾健脾颗粒剂治疗青春期功血的临床和实验研究

53、四通颗粒剂与紫外线照射充氧自血回输结合治疗急性缺血性中风的临床及机理研究 热痹消治疗急性痛风性关节炎的研究 从脾肺论治免疫性溃疡性结肠炎（IUC）的临床和实验研究大黄蛰虫丸对阿霉素肾病伴高血脂症大鼠的实验研究 滋阴抑元颗粒对免疫性不孕的机理研究 脑血通对急性出血性脑中风的实验研究 茱萸颗粒对病毒性心肌炎免疫损伤作用的研究。完成新药基金的药效学和毒理学研究3项，其中1项为863计划，编号2002AAZ3214，排名第5；1项为口腔膜的研制（省中管局）排名第1；1项为薤白胶囊的研制，(省科委高新开发项目)，排名第4。 近年来发表论文33篇，其中国家级刊物30篇第一作者30篇，省级刊物3篇第一作者3

54、篇 。现阶段我们已完成了一部分痛痹颗粒机理的实验研究，其中包括该方抗炎镇痛作用、抗氧化作用及改善血液微循环等方面一系列的实验工作， 同时我们也进行了一些预实验，包括对OA模型的复制等。已有以下主要仪器设备，可满足本项研究使用。超低温冰箱 MDF-382E 日本三洋公司倒置显微镜 CK 日本TOKYO公司紫外分光光度计 751G 上海分析仪器总厂低温高速离心机 MEGAFUGE2.0R 德国HERMLE公司蛋白核酸分析仪 DU600 美国Beckman公司PCR仪 PE-9600 美国PE公司96孔酶标仪 3550 美国Bio-Rad公司紫外线检测仪 ZF-2 上海长兴机械厂DNA荧光定量分析仪

55、LightCycle 美国Roche公司FA1004电子天平 上海天平厂净化工作台 苏州净化设备厂CO2恒温培养箱 德国贺利氏公司欠缺的有TBX2细胞流式仪5、计划进度：总研究期限？年（2005. 4 200 ）分三个阶段实施。第一阶段：（2005.42005.6）调研及资料检索，准备阶段并上报待批。第二阶段：（2005.6200 ）完成全部实验工作。第三阶段：（200 ）资料汇总、总结、处理数据、分析与研究成果撰写论文、上报鉴定、鉴定后申报成果。6、经费预算：6.1检索、调研、研制药物、检查费、购买特殊试剂盒、打字复印约2万。6.2动物实验、药理、毒理、细胞培养材料约3万。总计 5万7、主要研究人员姓名性别年龄单位专业职务在本项目中的主要工作朱萱萱女江苏省中医院药学主任药师课题负责人董朝岚女24南京中医药大学药学药理毒理刘丽敏女27南京中医药大学药学药理毒理闻国兰女江苏省中医院动物饲养