无菌工艺验证培养基模拟试验培训

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1、无菌工艺验证无菌工艺验证 培养基模拟试验培养基模拟试验 定义与目的使用培养基模拟药品进行无菌灌装，对无菌工艺进行验证。又称为“工艺模拟试验”.-2- 目的验证一个无菌工艺对无菌工艺过程无菌保证水平的综合评估（设备、人员、操作、灭菌过程、环境）对无菌操作人员进行资格确认确认进行重大变更后对无菌工艺的影响作为问题调查的手段为什么需要进行培养基模拟试验？-3-来自法规的要求FDA CGMP 无菌工艺药品指南USP 31 洁净室和其它控制环境的微生物学评价EU GMP 附件1 无菌药品的生产中国药品生产质量管理规范附录-4-来自生产工艺的要求对产品进行最终灭菌，是降低微生物污染风险的常用办法。但有大量

2、药品不适用于最终灭菌而只能采用无菌生产工艺方法。无菌工艺要旨是降低、消除导致污染的各种可能性-5- 环境 原料 生产过程 设备 人员质量管理体系最终灭菌工艺与无菌生产工艺的差异最终灭菌工艺在高洁净净环境下进行灌装和密封通常，产品、容器和密封件的微生物污染水平很低在密封容器中进行最终灭菌无菌生产工艺产品、容器和密封件分别进行灭菌，然后进行灌装在极高洁净环境下进行灌装和密封产品在最终容器中不再做进一步的灭菌处理对各个组成部分的灭菌工艺需要进行严格验证和监控在灌装前和灌装过程中的操作会带来污染风险-6-无菌生产作业环节与风险-7-作业环节验证难易度人员依赖程度相关风险灭菌易低低房间设计N/AN/A中

3、等环境监测中等可变高消毒难高高更衣难很高很高物品转移难高高无菌技术（灌装）难很高很高无菌装配难很高很高培养基模拟试验的 常规要求-8-一般流程将培养基暴露于设备、容器胶塞密封系统的表面和关键环境条件中，并模拟实际生产完成工艺操作。-9-对装有培养基的密闭容器进行培养以检查微生物的生长。评价结果，确定实际生产中（如灌装前的调试、加入无菌原辅材料、无菌连接、灌装和密封）产品污染的可能性。 验证时机及频率初始验证首次验证，每班次应当连续进行3次合格试验。重复多次，以确保结果的一致性和有效性。-10-有差异的多次试验结果工艺过程失控的象征定期再验证定期进行，评估无菌工艺的受控情况。按照生产工艺每班次半

4、年进行1次，每次至少一批。空气净化系统、设备、生产工艺及人员重大变更后，应当重复进行培养基模拟试验。对人员的资格再确认应纳入到定期再验证中。培养基的选择选择时的注意事项适应广谱微生物生长，包括细菌和真菌较好的澄明度，较小的粘度易于除菌过滤常用培养基：3大豆胰蛋白肉汤（TSB）厌氧培养基仅在特殊情况下使用其他模拟剂常用的惰性剂有聚乙二醇8000、羧甲基纤维素、乳糖、甘露醇用于分装的无菌粉末应流动性好，可用于分装，可溶于液体培养基，用射线照射灭菌。使用前须做无菌性、抑菌性及溶解性试验。-11-灌装体积与数量灌装体积每只容器的灌装体积不少于总容积的1/3灌装体积也不宜过大，尽量按产品实际灌装体积既要

5、考虑到瓶倒转或旋转时，培养基能充分接触到容器和密封件的内表面，又要保证容器内有足够的氧气支持微生物生长。灌装数量综合考虑统计学要求和实际生产批量。FDA (5000瓶)：如果正常生产的批次量低于5000瓶，则培养基模拟灌装至少应为实际生产线的最大批次量。PIC (3000瓶)：如果正常生产的批次量低于3000瓶，则培养基模拟灌装至少应为实际生产线的最大批次量。-12-灌装速度高速运行比较适用于评估需要频繁干扰操作的生产工艺或手工操作多的生产工艺，低速运行则一般适用于评估无菌产品、容器/胶塞在无菌区暴露时间比较长的工艺。u举例：多规格的瓶子： 最慢的速度，最大的瓶子规格;最小的瓶子规格，最快的速

6、度单一规格的瓶子： 正常或略慢速度-13-样品培养样品培养应对所有完整的容器进行培养为了评估无菌组装的风险，商业生产灌装开始可能被剔除的所有产品也应进行培养。这些产品应单独进行培养，而且不作为判断培养基模拟灌装试验失败的依据确保其内壁和瓶塞充分接触培养基样品应先在20-25下倒置培养7天，然后在30-35下倒置培养7天-14-合格标准FDA指南与EU GMP 附件1标准统一1.灌装量10000瓶时，若有1瓶污染，需彻底调查；若有两瓶污染，必须进行彻底调查，并重新验证（3批）。-15-培养基促生长试验样品为完成14天培养的西林瓶装培养基模拟灌装试验样品加入0.1ml小于100cfu/0.1ml的

7、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉及环境监测菌每个菌平行做两份，同时做阴性对照细菌在30-35培养3天，真菌在20-25培养5天，逐日观察结果标准：空白对照管应无菌生长，加菌的培养基管均生长良好-16-不同剂型的特殊要求 注射液冻干制剂 -17-冻干制剂对培养基模拟灌装的要求冻干制剂的典型生产流程配制灌装半加塞冻干压塞、出料轧盖-18-第一种方式，模拟装载/卸载过程，缩短放置时间（首选）容器内灌装好培养基，以半压塞状态装入冻干机在室温放置一定的时间，不得冷冻。全压塞，出料，并在出料后20min内翻转轧盖冻干制剂培养基模拟试验的特殊性对产品在冻干机内放置及

8、取出步骤的模拟冻干制剂对培养基模拟灌装的要求第二种方式，模拟冻干时间半压塞产品在冻干机腔室内的放置时间同于正常工艺。缺点：耗时长-19-第三种方式，以经稀释的培养基模拟冻干过程容器内灌装好经稀释的培养基（diluted medium），以半压塞状态装入冻干机模拟冻干过程，直到容器内的培养基大致达到正常浓度（full strength）为止。缺点：耗时长，需开发特殊的冻干程序，营养支持性不均一，影响微生物的存活力。粉针剂对培养基模拟灌装的要求第一种方法在灌装线上直接灌装液体培养基，灌装后压塞-轧盖或熔封。第二种方法先灌装干粉培养基，再加入注射用水第三种方法先灌装惰性剂，再加入液体培养基要点采用第

9、二、三种方法时，所用惰性剂或干粉培养基需事先经过辐射灭菌。常用惰性剂有聚乙二醇8000、羧甲基纤维素、乳糖。-20-方案与报告-21-制订培养基模拟试验方案的考虑因素（一）生产线最长运行时间及其造成的相关风险干预的次数、类型和复杂程度是否有冻干工序设备的无菌装配总人数和所从事的操作无菌加入和无菌转移的次数班次更换、暂停和必要的更衣无菌设备的拆卸与连接环境监测-22-制订培养基模拟试验方案的考虑因素（二）生产线的配置和运行速度容器/密封系统与无菌操作相关的各种特殊规定总人数和所从事的操作-23-n总的原则n综合考虑生产线可能造成污染的各种因素 n尽可能模拟实际生产的无菌操作 n可能时，应包括最差

10、条件的模拟测试验证开始前的准备工作设备确认通风系统（HVAC）的确认设备的在线清洗和灭菌CIP,SIP灭（除）菌工艺验证湿热、干热灭菌工艺除菌过滤空气过滤器的完好性检测容器/胶塞密封完好性测试人员培训洁净室环境达到设计要求-24-培养基模拟试验方案的内容举例定义被模拟的工艺定义使用的房间，灌装线和设备使用的容器和密封件的类型灌装线的速度灌装数量模拟过程中的干扰和中断的数目和类型参与的人员数目使用的培养基-25-灌装到容器内培养基的体积选择的最差条件及其原理培养条件，培养温度，培养时间所进行的环境监测批记录职责说明所有工作的合格标准列举最终报告中需要的文件本次模拟的持续时间方案的执行与记录（一）

11、培养基模拟灌装的日期和时间使用的房间和设备容器的型号和尺寸培养基种类和灭菌方式每容器中的灌装体积灌装速度灌装过程中的干扰项目灌装的瓶数，各工序剔除的瓶数和原因培养的瓶数，阳性的数量培养时间和温度-26-方案的执行与记录（二）环境监测的数据参与培养基模拟灌装的人员培养基促生长试验的结果有无阳性结果。如有，要给出微生物鉴定的结果。如发生异常情况，需给出调查报告。-27-培养基模拟试验中的环境监测环境监测按照相应的规程进行，包括：空气粒子数沉降碟浮游菌表面监测人员监测对无菌生产区环境的评估-28-培养基模拟试验的总结报告最终报告中应包括以下内容模拟的最差条件过程事件清单环境监测结果微生物鉴别结果培养

12、基的营养检查试验结果培养条件、结果读取日、结果读取人、每位参与者的灌装瓶数等信息。结论（结果是否可以接受）-29-难点讨论-30-培养基模拟试验阳性结果的调查 (一)调查的范围应包括环境微生物监测数据，空气悬浮粒子监测数据CIP设备，清洁、消毒程序的执行情况培养基、设备和零件的灭菌工艺，灭菌釜的校正情况高效过滤器检测 (空气悬浮粒子水平，过滤器检漏，风速测量，密封系统检查，使用年限等)除菌过滤器完好性房间气流型式与压差人员操作技术培训情况-31-培养基模拟试验阳性结果的调查 (二)调查的范围还应包括以往产品无菌检查试验结果人员卫生状况监测数据培养基模拟试验中的干预方式分析该区域近期是否有过维修

13、活动，生产线的改造情况该生产线培养基模拟试验历史数据已灭菌物品的储存条件培养基模拟灌装过程中的异常事件阳性污染菌与环境监测污染菌的鉴别-32-33-培养基模拟试验阳性结果的调查 (三)调查结论与风险评估培养基模拟试验结果有效暂停生产，直至确定污染来源并采取有效的纠偏措施。再验证合格后，产品方可放行。对培养基模拟试验后和此前所生产的产品，进行风险评估培养基模拟试验结果无效重新进行培养基模拟试验条件1无菌灌装区的物理条件不满足要求条件2人员未按照正常生产程序操作条件3 促生长试验失败-34-培养基模拟灌装后的生产培养基模拟灌装后可以进行生产，但要等培养基模拟灌装合格后产品才能放行（产品有报废的风险

14、）。无效的培养基模拟灌装后可以进行生产，但所生产的批次要在成功培养基模拟灌装后方可放行。培养基模拟灌装失败 生产线不能用来生产，根据调查结果决定培养基模拟灌装的次数和数量，培养基模拟灌装合格后，才能生产。-35-最差条件 WORST CASE最差条件最差条件高于或低于正常范围的条件限度，与正常生产条件相比最有可能造成工艺或生产失败的条件。注意注意如果某些做法会带来污染的风险，则不允许用培养基模拟灌装的结果为它的不合理的进行辩护 -36-最差条件的设计（1）储存时间Holding time灌装设备、灌装部件、储罐、无菌物料、药液在实际灌装前能够放置的最长时间1. 灌装设备、灌装部件、储罐、无菌物

15、料需要再灭菌（除菌）的时间间隔Worst case: 用超出保存时间的灌装设备、灌装部件、储罐、无菌物料参与培养基模拟灌装2. 产品从无菌过滤到灌装加塞完成所需要的时间Worst case：无菌过滤后存放在储罐内的培养基模拟实际生产时产品的最大储存时间后再灌装产品在灌装后的储存时间应在培养基模拟灌装中验证-37-最差条件的设计（2）灌装的持续时间Duration of runs最保守的设计：在培养基模拟试验中，模拟用时最长的瓶子满批量生产所需要的时间，其中包括正常的干扰时间（换班、设备维修）。其他的设计：1.在生产完成后接着进行培养基模拟试验2.为了减少灌装瓶数，在每批试验刚开始及结束前均灌装

16、培养基，中间空运行灌装机以达到所需要的时间在任何情况下模拟了与实际生产不相同的情况，都要有记录，并解释原因在正常生产过程中所需的最长时间，包括可能发生的事件，人员的换班等，应予以模拟-38-最差条件的设计（3）灌装数量灌装数量没必要总是满批量惯例：小批量，至少要满批量 大批量，一般至少5000瓶在模拟无菌生产时间时会超过5000瓶-39-最差条件的设计（4）灌装速度与瓶子规格灌装速度和瓶子规格的关系最慢的速度，最大的瓶子规格最小的瓶子规格，最快的速度-40-最差条件的设计（5）人员培养基模拟灌装时模拟无菌区可能容纳最多的人数无菌区工作人员至少每年参与一次成功的培养基模拟试验不是每个人员都要参与

17、最差条件的模拟-41-最差条件的设计（6）设备装配动作多对灌装区环境产生直接影响-42-最差条件的设计（7）干扰操作正常的（灌装线装配，称量调节，加胶塞，取样，环境监测）非正常的（处理倒瓶，设备故障，灌装线堵塞，轨道调节，拆卸/替换破损的部件）SOP中应列出哪些干扰是容许的-43-综合理解培养基模拟试验的条件应充分体现生产操作的实际情况采取特别的生产控制和预防措施，或在环境条件特别好时进行工艺模拟，会造成良好工艺条件的假象。选取SOP范围内的苛刻条件，能证明其有效性挑战条件不是人为的创造特别环境缺陷样品的处理有密封性缺陷的样品应在培养前剔除。对培养过程中发现损坏的样品处理。培养基模拟试验中断续

18、出现微生物污染，是无菌生产线呈现不良趋势的征兆。-44-MajpjMVcyzj21HLfrvy96dv02lPPfYgxUS7IYmZkyEmZ0kGeYZS3bpLCkYH1lt4EK7CxmUX3ijoYSOer7ZuaVWYgz4EpZrUirVpMzzvNtf1XZw5oswSXOtFaejnOcmfE1lZgnN1RSXg8wLCG8CVQ3XPJMvodPFWcpiYJgZazNSEPNIaklYSu7qSd1UpaxmZDlpN9zW7kljfsLCLi26Yv109ffbnDH8LbUN1G6ACURQ39eG12KHL9tXsZ1jzgoCK8g1kuNOh5eFvcmVT5

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