第二章 细胞分离与破碎.ppt

《第二章 细胞分离与破碎.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《第二章 细胞分离与破碎.ppt（141页珍藏版）》请在装配图网上搜索。

1、1第二章第二章 细胞分离与破碎细胞分离与破碎2总体学习目的和要求总体学习目的和要求 通过本章学习，要求掌握通过本章学习，要求掌握细胞分离细胞分离和和目标产物释放目标产物释放的的原理原理和和影响因素影响因素，熟，熟知各种方法的知各种方法的优缺点优缺点和应用范围。和应用范围。 3 了解细胞分离的基本方法，掌握离心沉降的基本理论；了解细胞分离的基本方法，掌握离心沉降的基本理论； 理解细胞壁的特点和细胞破碎率的定义；理解细胞壁的特点和细胞破碎率的定义； 掌握珠磨破碎机、高压匀浆机、超声波机等机械破碎掌握珠磨破碎机、高压匀浆机、超声波机等机械破碎法的工作原理、主要工作参数、主要优缺点和应用范法的工作原理

2、、主要工作参数、主要优缺点和应用范围；围； 理解非机械法（酶溶法、化学法）的原理、优点和不理解非机械法（酶溶法、化学法）的原理、优点和不足；足； 了解物理法（渗透压冲击法、冻融法、干躁法）的各了解物理法（渗透压冲击法、冻融法、干躁法）的各自特点；自特点； 理解目标产物的性质、在细胞中的位置与破碎方法之理解目标产物的性质、在细胞中的位置与破碎方法之间关系。间关系。4 收集含生化物质的液相，分离除去固体悬浮物收集含生化物质的液相，分离除去固体悬浮物（细胞、菌体、细胞碎片、蛋白质的沉淀物和（细胞、菌体、细胞碎片、蛋白质的沉淀物和它们的絮凝体等）。它们的絮凝体等）。 收集胞内产物的细胞或菌体，分离除去

3、液相。收集胞内产物的细胞或菌体，分离除去液相。一、固液分离的目的一、固液分离的目的5二、二、*影响发酵液固液分离的因素影响发酵液固液分离的因素1 1）发酵液中悬浮离子的大小）发酵液中悬浮离子的大小62）发酵液的黏度（）发酵液的黏度（viscosity） 固液分离速度通常与粘度成反比，粘固液分离速度通常与粘度成反比，粘度越大，固液分离越困难。影响粘度的因度越大，固液分离越困难。影响粘度的因素：素：l 菌体的种类和浓度（重要因素）菌体的种类和浓度（重要因素）l 培养液中蛋白质、核酸大量存在培养液中蛋白质、核酸大量存在l 培养基成分培养基成分l 此外，某些染菌发酵液，如染细菌，则粘度会增此外，某些染

4、菌发酵液，如染细菌，则粘度会增大大7三、常见的固液分离方法三、常见的固液分离方法 重力沉降重力沉降 gravitation settling 离心沉降离心沉降 Centrifugation settling 过滤过滤 filtration8 重力沉降重力沉降在重力的作用下使颗粒与流在重力的作用下使颗粒与流体之间产生相对运动，从而实现两者的分体之间产生相对运动，从而实现两者的分离。离。 在生物分离过程中，定义的颗粒为细在生物分离过程中，定义的颗粒为细胞、细胞碎片等有形物。胞、细胞碎片等有形物。（一）重力沉降（一）重力沉降 gravitation settling9gdvLLSpg182*重力沉降

5、速度：10 提高重力沉降的途径提高重力沉降的途径加入中性盐：加入中性盐：双电层排斥电位降低双电层排斥电位降低加入高分子絮凝剂：加入高分子絮凝剂：架桥作用形成大絮凝团架桥作用形成大絮凝团引入外力引入外力11理论假设理论假设 细胞或细胞碎片按照球形颗粒处理；细胞或细胞碎片按照球形颗粒处理； 颗粒在无限稀释的溶液中进行沉降，颗粒颗粒在无限稀释的溶液中进行沉降，颗粒之间无相互干扰之间无相互干扰 受力分析受力分析 球形颗粒重力球形颗粒重力fg 液体的浮力液体的浮力fb 颗粒运动方向相反的阻力颗粒运动方向相反的阻力 fs12gdfspg361gdfLpb3614222pgLSdvf重力：重力：浮力：浮力：

6、阻力：阻力：13 当球形颗粒自身的重力与其所受到浮力和当球形颗粒自身的重力与其所受到浮力和阻力达到平衡时，阻力达到平衡时， bSgfffgdvpLLSg342则则141Re103当球形颗粒处于滞流区（当球形颗粒处于滞流区（ ）时）时 Re24gdvLLSpg182Stokes公式公式当球形颗粒处于过渡区（当球形颗粒处于过渡区（ ）时）时 310Re15 . 0Re105 . 06 . 0Re27. 0LLSpggdvAllen公式公式当球形颗粒处于湍流区（当球形颗粒处于湍流区（ ）时）时53102Re1044. 05 . 074. 1LLSpggdvNewton公式公式15千姿百态的微生物世界

7、千姿百态的微生物世界Bacterial morphology diagramHigh-density cell culture球形颗粒？无限稀释溶液？无限稀释溶液？16 模型校正模型校正形态校正形态校正：颗粒的形状系数颗粒的形状系数速度校正速度校正：空隙率函数空隙率函数 提高重力沉降的途径提高重力沉降的途径加入中性盐：加入中性盐：双电层排斥电位降低双电层排斥电位降低加入高分子絮凝剂：加入高分子絮凝剂：架桥作用形成大絮凝团架桥作用形成大絮凝团引入外力引入外力PSAA)(1fvvgg17 离心沉降离心沉降 在离心力的作用下，由于颗粒和流在离心力的作用下，由于颗粒和流体间存在密度差产生相对运动，从而

8、使颗粒和流体间存在密度差产生相对运动，从而使颗粒和流体分离。体分离。（二）（二）*离心沉降离心沉降Centrifugation settling18应用应用 1878年年 瑞典瑞典 牛奶牛奶奶油奶油 1896年年 用于回收酵母用于回收酵母 离心分离技术在生工方面主要用于：分离心分离技术在生工方面主要用于：分离离DNA、大分子、菌体、动植物细胞、大分子、菌体、动植物细胞、胞内产物。胞内产物。19优点：优点：时间短，对于不稳定的产物可以首选时间短，对于不稳定的产物可以首选可连续操作可连续操作操作费用较低操作费用较低可用夹套控温可用夹套控温缺点：缺点：产品要及时移出产品要及时移出设备昂贵、维护费用高

9、设备昂贵、维护费用高连续生产应注意堵塞问题连续生产应注意堵塞问题1 1 * * * *离心分离的优缺点离心分离的优缺点202离离心心力力与与转转速速rrpmRCF(g)213 *提高离心沉降速度的主要措施提高离心沉降速度的主要措施d 颗粒直径；颗粒直径； S 固体颗粒密度；固体颗粒密度；L 液体介质密度；液体介质密度； L 液体介质粘度；液体介质粘度； 旋转角速度；旋转角速度； r 转轴中心到颗粒中心距离转轴中心到颗粒中心距离 增大增大dp增大增大S提高离心机转数提高离心机转数N提高离心半径提高离心半径r降低液体粘度降低液体粘度2L18)(2rdvLSPs22按速度和离心力：按速度和离心力：1

10、、常速离心机、常速离心机 最大转速最大转速8000rpm(r/min)，相对离心力，相对离心力(RCF)104g以下以下,用于细胞、菌体和培养基残渣等分离；用于细胞、菌体和培养基残渣等分离；2、高速（冷冻）离心机、高速（冷冻）离心机 1104-2.5104rpm，相对离，相对离心力心力104-105g，用于细胞碎片、较大细胞器、大分子沉，用于细胞碎片、较大细胞器、大分子沉淀物等分离；淀物等分离；3、超速离心机、超速离心机 转速转速2.5-8104rpm，相对离心力，相对离心力5105g；用于；用于DNA、RNA、蛋白质、细胞器、病毒分、蛋白质、细胞器、病毒分离纯化；检测纯度；沉降系数和相对分子

11、量测定等。离纯化；检测纯度；沉降系数和相对分子量测定等。4 离心机的种类与用途离心机的种类与用途23（1）差速离心分离差速离心分离法法24600g10min15,000g5min100,000g60min差速离心分差速离心分离应用实例离应用实例25（2）区带离心分离区带离心分离26差速区带离心差速区带离心特点特点 基于颗粒的大小、形状的分离基于颗粒的大小、形状的分离 梯度液的最大密度不能超过所分离颗粒的最梯度液的最大密度不能超过所分离颗粒的最大密度大密度 离心过程中，颗粒不断沉降至其浮力密度与离心过程中，颗粒不断沉降至其浮力密度与梯度液密度相等梯度液密度相等 动态离心分离方法动态离心分离方法2

12、7平平衡衡区区带带离离心心28平衡区带离心平衡区带离心特点特点 梯度液密度范围含盖全部待分离颗粒密度梯度液密度范围含盖全部待分离颗粒密度 离心过程中，颗粒不断沉降至其浮力密度与梯度离心过程中，颗粒不断沉降至其浮力密度与梯度液密度相等液密度相等 平衡离心分离方法平衡离心分离方法29*差速和平衡区带离心异同差速和平衡区带离心异同区带离心种类区带离心种类 差速区带离心差速区带离心 平衡区带离心平衡区带离心 共同点共同点事先在离心管内用低分子量溶质调配好密度梯度事先在离心管内用低分子量溶质调配好密度梯度 梯度介质梯度介质常用蔗糖常用蔗糖常用氯化铯常用氯化铯 密度梯度密度梯度最大的密度梯度低于最大的密度

13、梯度低于最大密度的沉降样品最大密度的沉降样品最大的密度梯度大于最大的密度梯度大于最大密度的沉降样品最大密度的沉降样品区带形成条件区带形成条件根据各个组分沉降系数的根据各个组分沉降系数的差别，形成各自的区带差别，形成各自的区带根据各组分密度差形根据各组分密度差形成区带成区带 离心条件离心条件在最前的沉降物质达到管底在最前的沉降物质达到管底前停止，短时间，低速度前停止，短时间，低速度使各组分沉降到其平衡的使各组分沉降到其平衡的密度区，长时间，高速度密度区，长时间，高速度 30细胞分离离心设备分类细胞分离离心设备分类分类方法分类方法名称名称处理量处理量实验室用离心机，工业用离心机实验室用离心机，工业

14、用离心机温度温度常温离心机、冷冻离心机常温离心机、冷冻离心机转速转速低速离心机、高速离心机、超速离心机低速离心机、高速离心机、超速离心机转子结构转子结构管式、碟式管式、碟式31按离心机的作用方式：按离心机的作用方式：斜角式斜角式平抛式平抛式管式管式蝶式蝶式螺旋式螺旋式32（1 1）斜角式离心机）斜角式离心机v是一类结构最简单的实验室常用离心机。是一类结构最简单的实验室常用离心机。33平抛式离心机转子平抛式离心机转子（2）平抛式离心机）平抛式离心机v一类结构简单的实验室常用的低中速离心机，转速一般一类结构简单的实验室常用的低中速离心机，转速一般在在 3000-6000rpm。34（3）管式离心机

15、）管式离心机（tubular-bowl centrifuge）3536*管式离心机特点：管式离心机特点： 结构简单。结构简单。 管状离心机可以安装冷却夹套，有利蛋管状离心机可以安装冷却夹套，有利蛋白质分离。白质分离。 固体挂壁多时，可采用多台交替操作。固体挂壁多时，可采用多台交替操作。 适用于于分离乳浊液及含细颗粒的稀悬适用于于分离乳浊液及含细颗粒的稀悬浮液，适用于固体含量低于浮液，适用于固体含量低于1%，颗粒度，颗粒度小于小于5微米，黏度大的悬浮液澄清或固液微米，黏度大的悬浮液澄清或固液两相密度差较小的分离。两相密度差较小的分离。37工作原理工作原理（4）碟片式离心机（）碟片式离心机（dis

16、k-bowl centrifuge）38（5）螺旋式离心机（螺旋式离心机（scroll-type centrifuge）连续操作的沉降设备。连续操作的沉降设备。转鼓内有可旋转的螺旋输送器，其转数比转鼓的转鼓内有可旋转的螺旋输送器，其转数比转鼓的转数稍低。转数稍低。有立式和卧式两种，卧螺机是一种全速旋转，连有立式和卧式两种，卧螺机是一种全速旋转，连续进料、分离和卸料的离心机，最大离心力可达续进料、分离和卸料的离心机，最大离心力可达6000，操作温度可达，操作温度可达300。用于用于分离含固量较多的悬浮液分离含固量较多的悬浮液，生产能力较大。，生产能力较大。39卧式螺旋式离心机卧式螺旋式离心机07

17、S0041-4440卧螺机卧螺机内部结构内部结构41螺旋式离心机工作原理螺旋式离心机工作原理42（6）多室式）多室式multichamber centrifuge 多室式离心机的转鼓内有若干同多室式离心机的转鼓内有若干同心圆筒组成的环状分离室，加长心圆筒组成的环状分离室，加长了被分离液体的流程，使液层减了被分离液体的流程，使液层减薄，增加了沉降面积，减少了沉薄，增加了沉降面积，减少了沉降距离。降距离。 同时还有粒度筛分的作用，悬浮同时还有粒度筛分的作用，悬浮液中的粗颗粒沉降到靠近内部的液中的粗颗粒沉降到靠近内部的分离室壁上，细颗粒则沉降到靠分离室壁上，细颗粒则沉降到靠近外部的室壁上，澄清的分离

18、液近外部的室壁上，澄清的分离液经溢流排出。经溢流排出。 常用于抗菌素液液萃取分离，常用于抗菌素液液萃取分离，果汁和酒类饮料的澄清等。果汁和酒类饮料的澄清等。43细胞分离常用离心设备细胞分离常用离心设备带有灭菌装置的排渣碟片式带有灭菌装置的排渣碟片式离心机离心机 加压喷嘴型碟片离心机，用于加压喷嘴型碟片离心机，用于酵母和细菌的分离酵母和细菌的分离445 *离心机的选用原则离心机的选用原则 颗粒的大小、形状及硬度颗粒的大小、形状及硬度 原料液的组成、密度及粘度原料液的组成、密度及粘度 产物热敏性产物热敏性45（三）（三） 过过 滤滤 filtration 过滤操作是借助于过滤介质，在一定的操作过滤

19、操作是借助于过滤介质，在一定的操作压力压力P作用下，使悬浮液中的液体通过介质的孔作用下，使悬浮液中的液体通过介质的孔道，而固体颗粒被截留在介质上，从而实现固液道，而固体颗粒被截留在介质上，从而实现固液分离的单元操作。分离的单元操作。过滤介质过滤介质filter medium : 过滤采用的多孔物质。过滤采用的多孔物质。46*（1）过滤推动力：）过滤推动力：悬浮液自身压强差、重力悬浮液自身压强差、重力悬浮液的悬浮液的外加压力外加压力过滤介质的过滤介质的抽真空抽真空离心力离心力*（2）过滤阻力：）过滤阻力：介质阻力介质阻力滤饼阻力滤饼阻力大多情况下，过滤阻力主要取决于滤饼大多情况下，过滤阻力主要取

20、决于滤饼阻力。阻力。47（3）过滤速率）过滤速率cmLRRpAdtdQRm表示介质的阻力；表示介质的阻力；Rc表示滤饼的阻力；表示滤饼的阻力；L为滤液的粘度为滤液的粘度 48（4）过滤速度的强化）过滤速度的强化a降低滤饼阻力降低滤饼阻力b降低滤液黏度降低滤液黏度 c降低悬浮液中悬浮固体的浓度降低悬浮液中悬浮固体的浓度 对发酵液进行预处理，改善滤液性对发酵液进行预处理，改善滤液性质。质。49典型过滤设备典型过滤设备：按操作方式分类：间歇过滤机、连续过滤机按操作方式分类：间歇过滤机、连续过滤机按操作压强差分类：压滤、吸滤和离心过滤按操作压强差分类：压滤、吸滤和离心过滤实验室用抽滤装置实验室用抽滤装

21、置板框压滤机（间歇操作）板框压滤机（间歇操作） 转筒真空过滤机（连续操作）转筒真空过滤机（连续操作） 过滤式离心机过滤式离心机（5）固液分离过滤设备）固液分离过滤设备50实验室用抽滤装置实验室用抽滤装置51板框压滤机板框压滤机 plate and frame filter 板框压滤机的过滤推动力来自泵产生的板框压滤机的过滤推动力来自泵产生的液压或进料贮槽中的气压。液压或进料贮槽中的气压。 广泛应用于培养基制备的过滤及霉菌、放广泛应用于培养基制备的过滤及霉菌、放线菌、酵母菌和细菌等多种发酵液的固液分离。线菌、酵母菌和细菌等多种发酵液的固液分离。适合于固体含量适合于固体含量1-10%1-10%的悬

22、浮液的分离。的悬浮液的分离。 52板框压滤机板框压滤机 plate and frame filter 53板框式压滤机在过滤时，悬浮液由离心泵或齿轮泵经滤板框式压滤机在过滤时，悬浮液由离心泵或齿轮泵经滤浆通道打人框内，滤液穿过滤框两侧滤布，沿相邻滤板沟浆通道打人框内，滤液穿过滤框两侧滤布，沿相邻滤板沟槽流至滤液出口，固体则被截留于框内形成滤饼。滤饼充槽流至滤液出口，固体则被截留于框内形成滤饼。滤饼充满滤框后停止过滤。满滤框后停止过滤。54*板框压滤机板框压滤机优点优点过滤面积大，结构简单，价格低，动力消耗少，过滤面积大，结构简单，价格低，动力消耗少，对不同过滤特性的发酵液适应性强。对不同过滤特

23、性的发酵液适应性强。缺点缺点不能连续操作，设备笨重，劳动强度大，不能连续操作，设备笨重，劳动强度大，卫生条件差，非过滤的辅助时间较长。卫生条件差，非过滤的辅助时间较长。55自动板框式压滤机自动板框式压滤机 自动板框压滤机在板框压紧；卸饼、清洗等操自动板框压滤机在板框压紧；卸饼、清洗等操作中可自动完成，劳动强度小，辅助操作时间作中可自动完成，劳动强度小，辅助操作时间短。短。 自动压滤机结构复杂，价格昂贵，在一定程度自动压滤机结构复杂，价格昂贵，在一定程度上限制了它的应用和发展。上限制了它的应用和发展。56真空转鼓过滤机真空转鼓过滤机（rotary-drum vacuum filter）57 1-

24、转鼓；转鼓；2-过滤室；过滤室；3-分配阀；分配阀；4-料液槽；料液槽；5-摇摇摆式搅拌器；摆式搅拌器；6-洗涤液喷嘴；洗涤液喷嘴；7-刮刀刮刀58优点：优点： 转鼓真空过滤机可吸滤、洗涤、卸饼、再生连转鼓真空过滤机可吸滤、洗涤、卸饼、再生连续化操作，生产能力大，劳动强度小。续化操作，生产能力大，劳动强度小。缺点：缺点： 辅助设备多，投资大，辅助设备多，投资大， 且由于真空过滤，推动力小（不超过且由于真空过滤，推动力小（不超过8104 Pa），滤饼湿度大（），滤饼湿度大（2030）。）。 主要适用霉菌发酵液，对菌体细小、黏度大铺主要适用霉菌发酵液，对菌体细小、黏度大铺助滤剂。对于滤饼阻力较大的

25、物料适应能力较助滤剂。对于滤饼阻力较大的物料适应能力较差。差。*转鼓真空过滤机转鼓真空过滤机59带式真空过滤机带式真空过滤机 带式真空过滤机（是自动连续运转、并能按工带式真空过滤机（是自动连续运转、并能按工艺要求进行无级调速以及操作方便和动力消耗艺要求进行无级调速以及操作方便和动力消耗低的一种新型高效的脱水设备。低的一种新型高效的脱水设备。60带式真空过滤机流程带式真空过滤机流程61结构结构：转鼓转鼓滤饼滤饼滤布滤布滤网滤网离心过滤机工作原理图离心过滤机工作原理图p转鼓转鼓( (上有小孔，亦称悬框上有小孔，亦称悬框) )； 滤网；滤网； 滤布；滤布； p机架。机架。 原理：原理： 由于离心力作

26、用，液体产生径向压差，通过滤饼、滤由于离心力作用，液体产生径向压差，通过滤饼、滤布及滤网而流出。布及滤网而流出。离心过滤机离心过滤机（centrifugal filter）62设备设备主要结构主要结构过程过程特点特点适用性适用性板框压板框压滤机滤机滤板滤板/ /滤框滤框/ /夹紧机构夹紧机构/ /机机架架装合装合过滤过滤洗涤洗涤卸渣卸渣整理整理加压过滤，推动力较大；加压过滤，推动力较大； 结构简单，造价低；结构简单，造价低； 过滤面积大，能耗少；过滤面积大，能耗少； 间歇操作；间歇操作； 洗涤时间长，生产效率低。洗涤时间长，生产效率低。应用广泛。对应用广泛。对原料的适应性原料的适应性强强转鼓真

27、转鼓真空过滤空过滤机机转鼓转鼓( (滤网、滤网、滤布滤布)/)/分配分配头、滤浆槽头、滤浆槽过滤过滤洗涤洗涤吹干吹干卸渣卸渣连续化生产，自动化程度高；连续化生产，自动化程度高；真空过滤，推动力较小；真空过滤，推动力较小；滤饼湿度大，设备投资高。滤饼湿度大，设备投资高。适于粒度中等，适于粒度中等，粘度不太大的粘度不太大的物料物料离心过离心过滤机滤机转鼓转鼓( (滤网、滤网、滤布滤布)/)/机架机架过滤过滤洗涤洗涤卸渣卸渣离心过滤，推动力最大；离心过滤，推动力最大； 滤液湿度小，设备成本高。滤液湿度小，设备成本高。应用广泛，过应用广泛，过滤面积小。滤面积小。*几种过滤设备的比较几种过滤设备的比较6

28、3第四章第四章 细胞破碎细胞破碎 掌握掌握：各种细胞破碎方法、原理、优缺各种细胞破碎方法、原理、优缺点及其适用范围。点及其适用范围。 应用：应用：采用不同的细胞破碎方法对细胞采用不同的细胞破碎方法对细胞进行不同程度的破碎。进行不同程度的破碎。 64一、概述一、概述(大多数情况下，抗生素，胞外酶，一些多糖，大多数情况下，抗生素，胞外酶，一些多糖，及氨基酸等目标产物存在于发酵液中。及氨基酸等目标产物存在于发酵液中。(有些目标产物存在于生物体中。有些目标产物存在于生物体中。l尤其是由基因工程菌产生的大多数蛋白质是尤其是由基因工程菌产生的大多数蛋白质是在细胞内沉积。在细胞内沉积。l脂类物质和一些有用酶

29、包含在生物体中。脂类物质和一些有用酶包含在生物体中。65细胞破碎（细胞破碎（cell rupture）技术是指利用）技术是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内物外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内物质包括目的产物成分释放出来的技术。质包括目的产物成分释放出来的技术。66二、常见细胞壁的结构二、常见细胞壁的结构细菌细菌酵母酵母霉菌霉菌葡聚糖糖蛋白蛋白质几丁质67三、细胞破碎技术三、细胞破碎技术压缩/撞击作用剪切作用撞击法68机械破碎机械破碎捣碎法捣碎法研磨法研磨法匀浆法匀浆法超声法超声法 物理破碎物理破碎温度差破碎法温度差破碎法压力差破碎法压力差破碎法化学破碎化学破碎有机溶剂有机溶剂表面活性剂表面

30、活性剂酸碱酸碱酶促破碎酶促破碎自溶法自溶法外加酶制剂法外加酶制剂法通过机械运动产生的撞击通过机械运动产生的撞击力、剪切力使组织、细胞力、剪切力使组织、细胞破碎。破碎。通过各种物理因素的作用，通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。破坏，而使细胞破碎。通过各种化学试剂对细通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞胞膜的作用，而使细胞破碎破碎通过细胞本身的酶系或外通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使加酶制剂的催化作用，使细胞壁结构受到破坏，而细胞壁结构受到破坏，而达到细胞破碎达到细胞破碎三、三、*细胞破碎方法及其原理细胞破碎方法及其原理69（一

31、）机械法（一）机械法机械破碎法又可分为机械破碎法又可分为高压匀浆破碎法（高压匀浆破碎法（homogenization）高速珠磨破碎法（高速珠磨破碎法（bead grinding）超声波破碎法（超声波破碎法（ultrasonication）70采用高压匀浆器（由高压泵和匀浆阀组成）。采用高压匀浆器（由高压泵和匀浆阀组成）。1 高压匀浆法高压匀浆法（High-pressure homogenization） （1 1）工作原理）工作原理71高压匀浆机高压匀浆机72（2）*高压匀浆法适用的范围高压匀浆法适用的范围大规模细胞破碎的常用方法大规模细胞破碎的常用方法高压匀浆法适用的范围高压匀浆法适用的范围

32、酵母和大多数细菌细胞的破碎；酵母和大多数细菌细胞的破碎；料液细胞浓度可以很高，料液细胞浓度可以很高，20%20%左右。左右。不宜使用高压匀浆法不宜使用高压匀浆法 易造成堵塞的团状或丝状真菌；易造成堵塞的团状或丝状真菌； 较小的革兰氏阳性菌；较小的革兰氏阳性菌； 含有包含体的基因工程菌（因包含体坚硬，易损伤匀含有包含体的基因工程菌（因包含体坚硬，易损伤匀浆阀）。浆阀）。73(3) *影响高压匀浆器细胞破碎因素影响高压匀浆器细胞破碎因素被破碎的细胞分率符合如下公式：被破碎的细胞分率符合如下公式： ln1/(1-S)=kPNb 式中式中 S 破碎率；破碎率； N 循环次数；循环次数； P 操作压力，

33、操作压力，MPa； 74l升高压力有利于破碎升高压力有利于破碎减少细胞的循环次数，甚至一次通过匀浆阀就可达到几减少细胞的循环次数，甚至一次通过匀浆阀就可达到几乎完全的破碎，这样就可避免细胞碎片不至过小。乎完全的破碎，这样就可避免细胞碎片不至过小。但但p大到一定值时对匀浆器的磨损增加。大到一定值时对匀浆器的磨损增加。在工业生产中，通常采用的压力为在工业生产中，通常采用的压力为5070Mpa。l破碎性能还随菌体种类和生长环境的不同而不同破碎性能还随菌体种类和生长环境的不同而不同大肠杆菌的细胞比酵母细胞容易破碎。大肠杆菌的细胞比酵母细胞容易破碎。生长在简单的合成培养基上的大肠杆菌比生长在复杂培养生长

34、在简单的合成培养基上的大肠杆菌比生长在复杂培养基上容易破碎。基上容易破碎。破碎率随比生长速率降低而降低。破碎率随比生长速率降低而降低。752 珠磨法珠磨法 bead millWSKWSK卧式高效全能珠磨机卧式高效全能珠磨机76（1）高速珠磨机工作原理）高速珠磨机工作原理77Netzsch LM-20型珠磨机l 圆盘以两种位置交错地安装在轴上，l 一种处于径向，一种与轴倾斜，l 径向盘使磨料沿径向运动，倾斜盘则产生轴向运动。l 由于交错的运动，提高了破碎效率。78（2）*影响珠磨机破碎的因素影响珠磨机破碎的因素u破碎作用符合下列公式：破碎作用符合下列公式： ln1/(1-S)=ktS 破碎率；破

35、碎率；k破碎速率常数；破碎速率常数；t 停留时间。停留时间。k与搅拌转速、细胞悬浮液浓度、玻璃小珠装量与搅拌转速、细胞悬浮液浓度、玻璃小珠装量和珠体直径，以及温度等相关。和珠体直径，以及温度等相关。79 圆盘外缘的速度，圆盘外缘的速度，5-15m/s； 细胞悬浮液浓度，细菌细胞悬浮液浓度，细菌60-120g/L，酵母，酵母140-180g/L； 磨珠直径，磨珠直径，0.2mm左右，工业不小于左右，工业不小于0.4mm； 磨珠装量，一般磨珠装量，一般80-90%； 在破碎室的停留时间；在破碎室的停留时间； 珠磨法的破碎率一般控制在珠磨法的破碎率一般控制在80%以下：可降低能耗、以下：可降低能耗、

36、减少大分子目的产物的失活、减少由于高破碎率产生的减少大分子目的产物的失活、减少由于高破碎率产生的细胞小碎片不易分离而给后续操作带来的困难。细胞小碎片不易分离而给后续操作带来的困难。80喷雾撞击破碎撞击破碎原理：撞击破碎原理： 细胞悬浮液以喷雾状高速冻结（冻结速度为细胞悬浮液以喷雾状高速冻结（冻结速度为数千数千/min），形成粒径小于），形成粒径小于50 微米的微粒微米的微粒子，高速载气（如氮气，流速为子，高速载气（如氮气，流速为300m/s）将冻）将冻结的微粒子送入破碎室，高速撞击撞击板，使结的微粒子送入破碎室，高速撞击撞击板，使冻结的细胞发生破碎。冻结的细胞发生破碎。 813 超声波破碎超声

37、波破碎 Ultrasonicationl 超声波破碎法（超声波破碎法（Ultrasonication)利用超声波振利用超声波振荡器发射的荡器发射的15-25kHz的超声波探头处理细胞悬的超声波探头处理细胞悬浮液。浮液。l 超声波振荡器以可分为槽式和探头直接插入介超声波振荡器以可分为槽式和探头直接插入介质两种型式，一般破碎效果后者比前者好。质两种型式，一般破碎效果后者比前者好。l 超声波的细胞破碎效率与细胞种类、浓度和超超声波的细胞破碎效率与细胞种类、浓度和超声波的声频、声能有关。声波的声频、声能有关。82机理机理JY92-II D超声波超声波细胞破碎机细胞破碎机(一般认为在超声波作用下液体发生

38、空化作用一般认为在超声波作用下液体发生空化作用（cavitation)。3 超声波破碎超声波破碎 Ultrasonication83（2）*超声波破碎的适用范围超声波破碎的适用范围超声波破碎适用于多数微生物的破碎。超声波破碎适用于多数微生物的破碎。一般杆菌比球菌易破碎，一般杆菌比球菌易破碎，G-细菌比细菌比G+细菌易细菌易破碎，对酵母菌的效果较差。破碎，对酵母菌的效果较差。但超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性但超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质失活。活性物质失活。超声波破碎的有效能量利用率极低。超声波破碎的有效能量利用率极低。由于对冷却的要求相当苛刻，所以不易放大，由于对冷却的

39、要求相当苛刻，所以不易放大，但但实验室小规模细胞破碎中常用。实验室小规模细胞破碎中常用。84技术技术原理原理效果效果成本成本破碎率破碎率举例举例高压匀浆法高压匀浆法(孔型孔型)高速撞击、剪切、高速撞击、剪切、压力骤降压力骤降剧烈剧烈适中适中50%酵母、细菌酵母、细菌细胞悬浮液细胞悬浮液大规模处理大规模处理珠磨破碎法珠磨破碎法玻璃珠或铁珠剪切玻璃珠或铁珠剪切碰撞碰撞剧烈剧烈便宜便宜90%多种菌体、多种菌体、细胞的大规细胞的大规模处理模处理超声波法超声波法 超声波的空穴作用超声波的空穴作用 适中适中昂贵昂贵30%形成包含体形成包含体 -内酰胺酶内酰胺酶形成包含体形成包含体106外源基因表达产物在原

40、核细胞中易于形外源基因表达产物在原核细胞中易于形成包含体，用于蛋白质药物开发。成包含体，用于蛋白质药物开发。蛋白质在体内的错误折叠和聚集可能与蛋白质在体内的错误折叠和聚集可能与许多疾病有关，如帕金森症、疯牛病、许多疾病有关，如帕金森症、疯牛病、老年性痴呆症、亨廷顿舞蹈症等。老年性痴呆症、亨廷顿舞蹈症等。107蛋白质蛋白质“折叠病折叠病” l疯牛病，它是由一种称为疯牛病，它是由一种称为Prion蛋白质的感染引起的，蛋白质的感染引起的，致病致病Prion蛋白与正常蛋白与正常Prion蛋白的一级结构完全相同，蛋白的一级结构完全相同，只是空间结构不同。只是空间结构不同。 正常的正常的Prion蛋白蛋白

41、病变的病变的Prion蛋白蛋白108收集菌体细胞收集菌体细胞细胞破碎细胞破碎包含体包含体的洗涤的洗涤包含体的变性溶解包含体的变性溶解目标蛋白的复性目标蛋白的复性包含体包含体的提取的提取*获得目的蛋白的方法获得目的蛋白的方法109包包含含体体纯纯化化工工艺艺路路线线( (一一) )机械破碎机械破碎( (高压匀浆）高压匀浆）离心提取包含体离心提取包含体粗包含体洗涤粗包含体洗涤离心沉降回收包含体离心沉降回收包含体二二 包含体的纯化和溶解包含体的纯化和溶解110包含体纯化工艺路线（二）包含体纯化工艺路线（二）离心回收细胞离心回收细胞酶法和机械法破碎细胞酶法和机械法破碎细胞核酸水解核酸水解包含体洗涤包含

42、体洗涤离心回收包含体离心回收包含体111l洗涤剂：洗涤剂：螯合剂（螯合剂（EDTA）、温和的表面活）、温和的表面活性剂（性剂（Triton X-100）、低浓度的变性剂（尿）、低浓度的变性剂（尿素或盐酸胍）等。能溶解除去部分膜蛋白和素或盐酸胍）等。能溶解除去部分膜蛋白和脂质类杂质。脂质类杂质。l洗涤剂浓度：洗涤剂浓度：以溶解杂质，不溶解包含体中以溶解杂质，不溶解包含体中表达产物为原则。表达产物为原则。包含体的洗涤包含体的洗涤112l常用变性剂：常用变性剂： 6-8 mol/L盐酸胍和盐酸胍和8 mol/L尿素；尿素； 表面活性剂，如表面活性剂，如1-2 SDS、CTAB； -巯基乙醇巯基乙醇

43、1-200mmol/L 螯合剂，如螯合剂，如2 mmol/LEDTAl影响变性因素：时间、影响变性因素：时间、pH、离子强度、变性剂、离子强度、变性剂 种类和浓度。种类和浓度。包含体的溶解包含体的溶解113折叠状态折叠状态尿素、尿素、-巯巯基乙醇基乙醇去除尿素、去除尿素、-巯基乙醇巯基乙醇非折叠状态，无活性非折叠状态，无活性114二、二、 蛋白质复性蛋白质复性115Off-pathwayUINAkIkkAUINAUINAkNOn-pathwayl 分子内折叠和分子间聚集的动力学竞争过程。分子内折叠和分子间聚集的动力学竞争过程。蛋白质复性过蛋白质复性过程程116蛋白质复性：动力学竞争过程蛋白质复

44、性：动力学竞争过程l分子内折叠：分子内折叠：1级反应级反应l分子间聚集：分子间聚集：2级反应（或级反应（或2级以上）级以上）蛋白质体外复性的主要挑战：蛋白质体外复性的主要挑战： 创造适宜的复性创造适宜的复性操作条件操作条件，促进正确折叠、，促进正确折叠、抑制聚集体生成，提高复性收率。抑制聚集体生成，提高复性收率。117主要影响因素主要影响因素l 变性剂浓度（脲、盐酸胍）变性剂浓度（脲、盐酸胍）l 氧化还原剂浓度、比例氧化还原剂浓度、比例l pHl 蛋白质稳定剂（甘油、海藻糖蛋白质稳定剂（甘油、海藻糖）l 蛋白质浓度蛋白质浓度l 杂质种类和含量杂质种类和含量l 变性剂浓度（脲、盐酸胍）变性剂浓度

45、（脲、盐酸胍）l 蛋白质聚集抑制剂（聚乙二醇、表面活性剂蛋白质聚集抑制剂（聚乙二醇、表面活性剂）l 盐的种类、浓度盐的种类、浓度l 混合效率混合效率l 温度温度1181、模仿体内蛋白质折叠过程：、模仿体内蛋白质折叠过程：构建适于蛋白质正确折叠的环境，设计能够促进蛋构建适于蛋白质正确折叠的环境，设计能够促进蛋白质正确折叠、抑制折叠中间体聚集的折叠助剂白质正确折叠、抑制折叠中间体聚集的折叠助剂（Folding aids，folding modulators）。）。2、发挥体外折叠的独特优势：、发挥体外折叠的独特优势：构建体内不可能存在的独特环境，实现高效复性和构建体内不可能存在的独特环境，实现高效

46、复性和分离纯化：分离纯化： 色谱、反胶团、膜、双水相系统、沉淀色谱、反胶团、膜、双水相系统、沉淀体外复性研究的核心问题：体外复性研究的核心问题：119降低变性蛋白质溶液中变性剂的浓度，创造适宜降低变性蛋白质溶液中变性剂的浓度，创造适宜的氧化还原环境，可引发蛋白质折叠复性；的氧化还原环境，可引发蛋白质折叠复性；操作模式：操作模式：直接稀释、透析、流加直接稀释、透析、流加1 1 * * *稀释复性稀释复性120直接稀释（直接稀释（Direct dilutionDirect dilution）u将少量变性蛋白质溶液直接加入到较大体积的复将少量变性蛋白质溶液直接加入到较大体积的复性缓冲液中，变性剂浓度

47、降低，蛋白质开始复性。性缓冲液中，变性剂浓度降低，蛋白质开始复性。121蛋白质浓度对收率和浊度的影响蛋白质浓度对收率和浊度的影响 0.5 mol/L盐酸胍，盐酸胍，5 mmol/L GSSG，2 mmol/L DTT，1 mmol/L EDTA，50 mmol/L Tris，pH 8，22oC；复性时间：；复性时间：3h 122Refolding bufferDenatured proteinPump Magnetic stirrer37 oC流加稀释复性（流加稀释复性（Fed-batch dilutionFed-batch dilution） 复性液中蛋白质初始浓度复性液中蛋白质初始浓度0。

48、边流加、边复性。边流加、边复性。故变性蛋白质浓度始终保持在较低水平，有利于故变性蛋白质浓度始终保持在较低水平，有利于提高复性收率，且终浓度较高。提高复性收率，且终浓度较高。123透析复性（透析复性（Dilution by dialysisDilution by dialysis）变性蛋白质溶液中，变性剂浓度降低（小分子折叠变性蛋白质溶液中，变性剂浓度降低（小分子折叠助剂浓度增大），蛋白质开始复性。助剂浓度增大），蛋白质开始复性。复性缓冲液复性缓冲液变性液变性液蛋白质蛋白质变性剂变性剂水、助剂水、助剂124* * * *蛋白质复性特点稀释复性小结蛋白质复性特点稀释复性小结低浓度下进行复性操作有利

49、于提高复性收率；低浓度下进行复性操作有利于提高复性收率；浓度提高则聚集体生产速度加快，复性收率下降浓度提高则聚集体生产速度加快，复性收率下降; ;流加复性有利于实现高浓度下的高收率复性流加复性有利于实现高浓度下的高收率复性; ;抑制聚集体的生成，是提高复性收率的关键！抑制聚集体的生成，是提高复性收率的关键！125 折叠中间体之间的疏水性相互作用是聚集的主要折叠中间体之间的疏水性相互作用是聚集的主要原因。原因。可利用可利用小分子添加剂小分子添加剂抑制此疏水性相互作用。抑制此疏水性相互作用。也可利用也可利用折叠助剂折叠助剂抑制聚集体生成和抑制聚集体生成和/或促进折叠，或促进折叠，提高复性收率。提高

50、复性收率。2 2 辅助复性辅助复性126具有辅助蛋白质复性作用的稀释添加剂（具有辅助蛋白质复性作用的稀释添加剂（1 1）低浓度变性剂低浓度变性剂: 盐酸胍盐酸胍 (0.52 mol/L)尿素尿素 (14 mol/L)L-精氨酸精氨酸 (0.51 mol/L)、氨基酸乙脂、氨基酸乙脂表面活性剂表面活性剂:聚乙二醇聚乙二醇 (polyethylene glycol, Mr 3550)Triton X-100十二烷基磺酸钠（十二烷基磺酸钠（SDS）十六烷基三甲基溴化胺（十六烷基三甲基溴化胺（CTAB）月桂醇麦芽糖苷月桂醇麦芽糖苷 (lauryl maltoside)Tween磷脂磷脂 (phosph

51、olipids)127糖类糖类:海藻糖、蔗糖、葡萄糖海藻糖、蔗糖、葡萄糖-环糊精环糊精 (-cyclodextrin, -CD)乙酰葡萄糖胺乙酰葡萄糖胺 (N-acetyl glucosamine)醇类醇类:甘油甘油 (glycerol)正戊醇正戊醇 (n-pentanol)正己醇正己醇 (n-hexanol)环己醇环己醇(cyclohexanol)具有辅助蛋白质复性作用的稀释添加剂（具有辅助蛋白质复性作用的稀释添加剂（2 2）其他有机小分子化合物其他有机小分子化合物:三羟甲基氨基甲烷三羟甲基氨基甲烷 (Tris)丙酮丙酮acetone乙酰胺乙酰胺 (acetamide)肌氨酸肌氨酸 (sar

52、cosine)硫脲硫脲 (thiourea)硫化甜菜碱硫化甜菜碱 (sulfobetaines)无机盐无机盐:(NH4)2SO4, NaCl, Na2SO41281、稳定天然蛋白质结构，促进正确折叠产物的生成。、稳定天然蛋白质结构，促进正确折叠产物的生成。 甘油、海藻糖、蔗糖甘油、海藻糖、蔗糖2、抑制分子间作用，降低聚集体生成速度。、抑制分子间作用，降低聚集体生成速度。 变性剂、表面活性剂、精氨酸、丙酮变性剂、表面活性剂、精氨酸、丙酮 添加剂的两种作用添加剂的两种作用129l蛋白质体内折叠是在各种折叠调解因子蛋白质体内折叠是在各种折叠调解因子（modulators）和蛋白酶的共同作用下完成的；

53、）和蛋白酶的共同作用下完成的；l调解因子：分子伴侣（调解因子：分子伴侣（chaperones)和折叠酶和折叠酶（foldases）折叠助剂（折叠助剂（Folding aidsFolding aids）130In vivo protein folding体内折叠：体内折叠：是在一系列是在一系列折叠酶、分折叠酶、分子伴侣和水子伴侣和水解酶的辅助解酶的辅助下完成的。下完成的。F. Baneyx, M. Mujacic: Nature Biotechnology, 2004, 22: 1399131（1）分子伴侣）分子伴侣/折叠酶辅助蛋白质体外复性折叠酶辅助蛋白质体外复性利用纯化的分子伴侣和利用纯化的

54、分子伴侣和/或折叠酶（单独或折叠酶（单独/共同）共同）作用，辅助蛋白质体外复性。作用，辅助蛋白质体外复性。直接模拟直接模拟in vivo folding的复性方法。的复性方法。体外蛋白质复性的策略体外蛋白质复性的策略1321. 顶端区顶端区 2. 中间区中间区 3. 赤道区赤道区4. GroES 5. 底物蛋白质底物蛋白质应用于体外复性的分子伴侣应用于体外复性的分子伴侣GroELGroEL/ES/ES的结构和作用的结构和作用作用：作用：GroEL结合伸展的肽链或折叠中间态，在结合伸展的肽链或折叠中间态，在ATP和和GroES的存在下，水解的存在下，水解ATP释放蛋白和能量，促进蛋白释放蛋白和能

55、量，促进蛋白质折叠复性。质折叠复性。133模仿模仿GroEL/ES的作用机理，即变性蛋白质的作用机理，即变性蛋白质/折叠中间体的折叠中间体的捕获释放机理辅助蛋白质折叠复性。捕获释放机理辅助蛋白质折叠复性。*人工伴侣系统：人工伴侣系统：CTAB/-CD（2 2）人工分子伴侣）人工分子伴侣134 在色谱柱内进行的复性过程在色谱柱内进行的复性过程 复性和分离（部分纯化）同时进行复性和分离（部分纯化）同时进行3 3 复性色谱复性色谱135l凝胶过滤色谱凝胶过滤色谱136l凝胶过滤色谱凝胶过滤色谱l吸附色谱吸附色谱 离子交换色谱离子交换色谱 金属螯合色谱金属螯合色谱 疏水性相互作用色谱疏水性相互作用色谱

56、l固定化辅助因子色谱（分子伴侣）固定化辅助因子色谱（分子伴侣）137反胶团介导复性与稀释复性的比较反胶团介导复性与稀释复性的比较4 4 反胶团中的蛋白质复性反胶团中的蛋白质复性138肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体蛋白在肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体蛋白在E.coli中的高密度发酵中的高密度发酵过程中以两种形式表达：过程中以两种形式表达： 细胞内有活性的可溶性蛋白形式（约占目标蛋白的细胞内有活性的可溶性蛋白形式（约占目标蛋白的30%） 无活性的包涵体形式（约占目标蛋白的无活性的包涵体形式（约占目标蛋白的70%）。）。 悬浮破壁悬浮破壁PBS洗涤洗涤离心离心硫铵沉淀硫铵沉淀 亲和层析亲和层析阳离子交换

57、层析阳离子交换层析溶解溶解复性复性亲和层析亲和层析湿菌体湿菌体发酵液发酵液干净菌体干净菌体上清液上清液包涵体包涵体纯品纯品活性检测活性检测破壁液破壁液离心离心离心液离心液洗涤洗涤举例：举例：TRAIL的分离纯化的分离纯化139包含体产物分离工艺（牛生长激素分离提取）包含体产物分离工艺（牛生长激素分离提取）140p 蛋白质复性是基因重组蛋白类生物大分子药物分蛋白质复性是基因重组蛋白类生物大分子药物分离纯化过程的重要单元操作；离纯化过程的重要单元操作；p 蛋白质复性的发展方向蛋白质复性的发展方向 (1) 折叠助剂的分子设计；折叠助剂的分子设计； (2) 折叠助剂与色谱复性的耦合利用；折叠助剂与色谱

58、复性的耦合利用； (3) 新型亲和反胶团系统的开发和应用；新型亲和反胶团系统的开发和应用； (4) 包含体溶解分离复性过程的集成。包含体溶解分离复性过程的集成。结结 语语141具有国际先进水平重组蛋白药物项目启动具有国际先进水平重组蛋白药物项目启动 n被列入国家被列入国家“863”计划，被专家鉴定为计划，被专家鉴定为“国际首创国际首创”和和“国际领先国际领先”水平的水平的重组蛋白药物生产线及关键设备的开发生产项目重组蛋白药物生产线及关键设备的开发生产项目，日前日前在陕西在陕西省西安高新技术产业开发区大学生物医药园启动。省西安高新技术产业开发区大学生物医药园启动。 据介绍，这一国家重大产业化示范

59、项目总投资据介绍，这一国家重大产业化示范项目总投资2.2亿元，占地亿元，占地1.8万平方米，将在万平方米，将在3年内分两期建成。一期将投资年内分两期建成。一期将投资9200万元，建设一条万元，建设一条符合符合GMP标准适合多种重组蛋白药物的示范生产线和两条标准适合多种重组蛋白药物的示范生产线和两条“蛋白复蛋白复性及纯化装置（实验型、装备型）生产线；二期投资性及纯化装置（实验型、装备型）生产线；二期投资1.3亿元，扩建亿元，扩建一条年产一条年产500克重组蛋白药物生产线，并建成生物医药研发中心和动克重组蛋白药物生产线，并建成生物医药研发中心和动物实验中心各一个，这两个中心除完成配套功能外，同时面

60、向国内、物实验中心各一个，这两个中心除完成配套功能外，同时面向国内、国际开放。国际开放。 项目负责人、陕西九州科技股份有限公司董事长聂苏秦项目负责人、陕西九州科技股份有限公司董事长聂苏秦说，说，这一这一项目解决了生物工程生产蛋白药物过程中传统技术不能完全除去变性项目解决了生物工程生产蛋白药物过程中传统技术不能完全除去变性剂、蛋白纯度低、复性时间长、活性回收率低等重要工艺技术问题。剂、蛋白纯度低、复性时间长、活性回收率低等重要工艺技术问题。使蛋白复性时间由使蛋白复性时间由24小时减少到半小时，纯度达到小时减少到半小时，纯度达到99以上，活性回以上，活性回收率提高收率提高2至至3倍，并实现了除变性剂、变性蛋白复性、分离杂质耗时倍，并实现了除变性剂、变性蛋白复性、分离杂质耗时两天三步骤的操作合并为在两天三步骤的操作合并为在30至至40分钟内完成的一步操作，生产成本分钟内完成的一步操作，生产成本降低降低3050。 项目建成后，不仅可以改变我国生产基因蛋白药物下游技术落项目建成后，不仅可以改变我国生产基因蛋白药物下游技术落后国际水平后国际水平15年以上的局面，而且为带动我国基因蛋白药物下游生产年以上的局面，而且为带动我国基因蛋白药物下游生产技术上升到世界先进水平、提高国际市场竞争能力起到示范作用。技术上升到世界先进水平、提高国际市场竞争能力起到示范作用。