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1、实验三 普通光学显微镜的使用及细菌的简单染色、革兰氏染色法生科15.2 周罡 201500181104【实验目的】1. 复习光学显微镜的结构、各部分的功能和使用方法。2. 学习并掌握油镜的原理和使用方法。3. 掌握利用显微镜观察不同微生物的基本技能，了解球菌、杆菌、放线菌、酵母、真菌在光学显微镜下的基本形态特征。4. 学习并掌握微生物的制片及简单染色的基本要求。5. 学习并掌握革兰氏染色法。6. 了解革兰氏染色原理。7. 巩固显微镜操作技术及无菌操作技术。【实验原理】（一） 普通显微镜的基本原理 1.基本原理 现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来昂达成像，故又称为复式显微镜。它们包括
2、机械部分和光学部分两部分。机械部分包括镜座、镜臂、镜筒、载物台、物镜转换器、粗调节螺旋、细调节螺旋、标本夹等。光学部分包括接目镜、接物镜、反光镜、光圈（虹采）、聚光镜（集光器）等。显微镜的放大效能（分辨率）是由所用光波长短和物镜数值口径决定，缩短使用的光波波长或增加数值口径可以提高分辨率，可见光的光波幅度比较窄，紫外光波长短可以提高分辨率，但不能用肉眼直接观察。所以利用减小光波长来提高光学显微镜分辨率是有限的，提高数值口径是提高分辨率的理想措施。要增加数值口径，可以提高介质折射率，当空气为介质时折射率为1，而香柏油的折射 率为1.51，和载片玻璃的折射率（1.52）相近，这样光线可以不发生折射
3、而直接通过载片、香柏油进入物镜，从而提高分辨率。显微镜总的放大倍数是目镜和物镜放大倍数的乘积，而物镜的放大倍数越高，分辨率越高。2.油镜 微生物学使用的显微镜的物镜通常有低倍镜（10）、高倍镜（40）和油镜（100），油镜是三者中放大倍数最大的，油镜的焦距和工作距离最短，油镜与其他物镜不同的是载玻片与物镜之间隔的不是一层空气（干燥系），而是一层油脂，称为“油浸系”。由于香柏油与玻璃的折光率相似（香柏油为1.515，玻璃为1.52）。镜检时，滴加香柏油的作用是使光源尽可能多的进入物镜中，避免光线通过折光率低的空气（折光率为1.0）而散失，因而能提高物镜的分辨率，使物像明亮清晰（见下图）图2 介质
4、为空气（A）与介质为香柏油（B）时光线通过的比较（二） 简单染色的原理细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。细菌的细胞小而透明，在普通的光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色。利用单一染料对菌体进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构的方法叫做简单染色。此法操作简便，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。常用碱性染料进行简单染色，这是因为在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。常
5、用作简单染色的染料有美蓝、结晶紫、碱性复红等。当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，此时可用伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料染色。染色前必须固定细菌，其目的有二：一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上；二是增加其对染料的亲和力。常用的有加热和化学固定两种方法。固定时尽量维持细胞原有的形态。（三） 革兰氏染色法的原理革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。革兰氏染色法不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和
6、结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。 革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料初染液；媒染剂；脱色剂和复染液。碱性染料初染液的作用象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫。媒染剂的作用是增加染
7、料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘是常用的媒染剂。脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95的酒精。复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分成G 和G-两大类群，常用的复染液是番红。 经此法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；细胞中初染剂被脱色剂洗脱而染上复染剂的颜色（红色）的细菌为革兰氏阴性菌。1）G菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩
8、小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上。呈紫色。2）G菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，沙黄复染后呈红色。【实验器材】1. 菌种枯草芽孢杆菌牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物，金黄色葡萄球菌牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物，大肠杆菌牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物，自选菌种两种。2. 溶液和试剂草酸铵结晶紫染液，卢戈氏（Lugol）碘液，95%乙醇，番红复染液，无菌水，香柏油，二甲苯3. 仪器和其他用品普通光学显微镜，擦镜纸，酒精灯，载玻片，双层瓶（内装香柏油和二甲苯），接种环，滴管【实验步骤】（一） 显微镜的使用方法1. 观察前的准
9、备（1） 显微镜的安置：置显微镜于平整的实验台上，镜座距试验台边缘约10cm。镜检时姿势要端正。（2） 光源调节：调节安装在镜座内的光源灯的电压获得适当的照明强度。（3） 根据使用者的个人情况，调节双筒显微镜的目镜2. 显微观察（1） 低倍镜观察：将要观察的玻片标本置于载物台上，用标本夹夹住，移动推进器使观察对象处在物镜的正下方，下降10物镜，使其接近标本，用粗调节器慢慢升起镜筒，使标本在视野中初步聚焦，再使用细调节器调节至图像清晰。通过玻片夹推进器慢慢移动玻片，认真观察标本各部位，找到合适的目的物，仔细观察并记录所观察到的结果。（2） 高倍镜观察：在低倍镜下找到合适的观察目标并将其移至视野中
10、心后，轻轻转动物镜转换器将高倍镜移至工作位置。对聚光器光圈及视野亮度进行适当调节后微调细调节器使物像清晰，利用推进器移动标本仔细观察并记录所观察到的结果。（3） 油镜观察：在高倍镜下找到合适的观察目标并将其移至视野中心，将高倍镜转离工作位置，在待观察的样品区域上滴上一滴香柏油，将油镜转到工作位置，油镜镜头此时应正好浸泡在镜油中。调节照明使视野的亮度合适，微调细调节器使物像清晰，利用推进器移动标本仔细观察并记录所观察到的结果。3. 显微镜用毕后的处理（1） 上升镜筒，取下载玻片。（2） 用擦镜纸拭去镜头上的镜油，然后用擦镜纸蘸少许二甲苯（香柏油溶于二甲苯）擦去镜头上残留的油迹，最后再用干净的擦镜
11、纸擦去残留的二甲苯。（3） 用擦镜纸清洁其他物镜及目镜，用绸布清洁显微镜的金属部件。（4） 将各部分还原，将光源灯亮度调至最低后关闭，将最低放大倍数物镜转到工作位置，同时将载物台降至最低位置。（二） 细菌制片及简单染色1. 涂片取一块载玻片，在玻片的一面用记号笔做好标记，在标记的一面上边用胶头滴管加一小滴无菌水，用接种环无菌操作分别由枯草芽孢杆菌营养琼脂斜面和金黄色葡萄球菌营养琼脂斜面挑取适量菌苔，将沾有菌苔的接种环置于载玻片上的无菌水种涂抹，待看到微弱的浑浊即可。2. 干燥与固定涂菌面朝上，通过火焰以干燥并固定菌物，固定过程应使载玻片通过火焰2-3次，注意温度的控制，过热的温度会将细菌杀死，
12、温度以手背感觉微微发烫为标准。3. 染色将载玻片平放于载波片支架上，滴加结晶紫染液覆盖涂菌部位即可，染色1.5min。4. 水洗倾去染液，将载玻片的涂菌面朝下，自来水冲洗，水流不宜太急、太大，至洗出水无色为止。5. 干燥用吸水纸吸去多余水分后自然干燥，或将载玻片通过火焰2-3次。6. 镜检将制备好的样片置于显微镜下进行观察，先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油，用油镜观察细菌的形态。（三） 革兰氏染色1. 涂片取一块载玻片，在玻片的一面用记号笔做好标记，在标记的一面上边用胶头滴管加几小滴无菌水，分别取5种活跃生长期菌种（金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，枯草芽孢杆
13、菌，自选菌（1），自选菌（2）按常规方法涂片（不宜过厚）。2. 干燥与固定涂菌面朝上，通过火焰以干燥并固定菌物，固定过程应使载玻片通过火焰2-3次，注意温度的控制，过热的温度会将细菌杀死，温度以手背感觉微微发烫为标准。3. 初染滴加草酸铵结晶紫染液覆盖涂菌部位，染色1.5min后倾去染液，水洗至流出水无色。4. 媒染先用卢戈氏碘液冲去残留水迹，再用碘液覆盖1min，倾去碘液，水洗至流出水无色。5. 脱色先用乙醇冲去水迹，然后用95%乙醇覆盖脱去色素，脱色约30s，立即用水冲洗。6. 复染将载玻片上残留水用吸水纸吸去，用番红复染液染色1.52min，水洗，吸去残水晾干。7. 镜检将制备好的样片置于显微镜下进行观察，先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油，用油镜观察细菌。分别以大肠杆菌与金黄色葡萄球菌所染颜色作为对照，来判断枯草杆菌以及两种自选菌的染色结果。【实验结果】
实验三普通光学显微镜的使用方法及细菌的革兰氏染色法
