血浆血清体液蛋白质组学完整版

《血浆血清体液蛋白质组学完整版》由会员分享，可在线阅读，更多相关《血浆血清体液蛋白质组学完整版（105页珍藏版）》请在装配图网上搜索。

1、血浆、血清、体液蛋白质组学血浆、血清、体液蛋白质组学研究及其应用研究及其应用1柳满然 Ph.DE-mail: mliu-Tel: 6848-5184蛋白组学基本知识蛋白组学基本知识2血浆、血清蛋白组学血浆、血清蛋白组学唾液蛋白组学唾液蛋白组学尿液蛋白组学尿液蛋白组学脑、脊液蛋白组学脑、脊液蛋白组学一、蛋白组学基本知识一、蛋白组学基本知识34蛋白质组蛋白质组(proteome = protein + genome):一种细胞、组织或生物体完整基因组所对应的一种细胞、组织或生物体完整基因组所对应的全套蛋白质全套蛋白质蛋白质组学（蛋白质组学（proteomics)研究细胞、组织或生物体蛋白质组成及其

2、变化研究细胞、组织或生物体蛋白质组成及其变化规律的科学规律的科学5Post-translational modificationProtein-protein interactionGenome-Transcriptome-ProteomeDisease marker-diagnosisDrug target-therapy Proteomics6蛋白质组研究的基本技术蛋白质组研究的基本技术分离分离Gel-basedLiquid-basedHPLCFFESCX, RP, SECSDS-PAGE, IEF2DE鉴定鉴定MSMALDI-TOF-MSESI-MSMS-MS2D-HPLCMALDI-T

3、OF-TOFMALDI-Q-TOFESI-MS-MSLC-ESI-MS-MS计算机计算机技术技术7IEF: isoelectric focusing (等电聚焦)2-DE：Two-dimensional gel electrophoresis第一向基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦分离；第二向则按分子量的不同用SDS-PAGE分离， 把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开HPLC：High-performance liquid chromatography or high-pressure liquid chromatography (高压液相色谱法)DIGE：2-D difference

4、Gel Electrophoresis基本缩略词基本缩略词iTRAQ: Isobaric tag for relative and absolute quantitation 同位素标记相对和绝对定量同位素标记相对和绝对定量8质谱仪分为进样系统、离子源、质量分析器和检测器四部分。离子源又分为：电子轰击源 (Electron Ionization，EI)化学电离源 (Chemical Ionization，CI)场致电离源 (FI)电喷雾电离源 (Electro Spray Ionization，ESI) 等MS是单级质谱，适用于样品不是特别复杂的样品分析。 对于复杂样品，单级质谱会出现很多干扰

5、峰，影响测定。MS：Mass Spectroscopy (质谱)MS/MS是串联四级杆质谱，通过两个质量分析器间的碰撞室进行 一定能量的碰撞，选择性的扫描碰撞后得到的子离子碎片，不符合 一定质量数的离子被抛弃，这就降低了背景噪音、大大提高了检测的 灵敏度和准确度。基本缩略词基本缩略词9ESI-MS：Electro Spray Ionization-Mass Spectroscopy， 电喷雾质谱MALDI-TOF-MS：Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization/ Time of Flight Mass Spectrometry 基质辅助激光解吸离子

6、化-飞行时间质谱， 是一种新型的软电离生物质谱LC-ESI-MS/MS: 高效液相色谱-电喷雾串联质谱MALDI-TOF-TOF：基质辅助激光解吸离子化-串联飞行时间质谱MALDI-Q-TOF：基质辅助激光解吸离子化-三级四级杆-飞行时间质谱基本缩略词基本缩略词10PMF： Peptide Mass Fingerprinting (肽质量指纹谱)， 是蛋白质被识别特异酶切位点的蛋白酶水解后得到的 肽片段的质量图谱蛋白质组学研究中，质谱测序一般采用两种方式： 一种是利用串联质谱 (MS/MS) 测序； 另一种是利用源后衰变 (PSD：post-source decay) 技术测序基本缩略词基本缩

7、略词IPG(EF)：Immoblized pH gradients isoelectric focusing (固相固相pH梯度等电聚焦梯度等电聚焦)11PMF常用软件常用软件Mascot: Profound: Prowl.rockefeller.eduPepIdent: www.expasy.ch/toolsProteinProspector: Prospector.ucsf.eduPepSea: 195.41.108.3812常用串联质谱检索工具常用串联质谱检索工具SEQUEST: Field.scripps.edu/sequestPepFrag: Prowl.rockefeller.ed

8、uProteinProspector: Prospector.ucsf.eduMascot: 13ESI-MS/MSMAIDI-TOF图像分析确定差异点差异蛋白质质谱分析数据处理与生物信息学分析数据搜寻蛋白质鉴定条件A:样品条件B:样品基于基于2DE的差异蛋白质组分析技术流程的差异蛋白质组分析技术流程14 Provides a hard-copy record of separation Allows facile quantitation Separation of up to 3000 different proteins Highly reproducible Gives info on

9、 Mw, pI and post-trans modifications Inexpensive Limited pI range (4-8) Proteins 150 kD not seen in 2D gels Difficult to see membrane proteins (30% of all proteins) Only detects high abundance proteins (top 30% typically) Time consuming 30% of spots with multiple proteins from pI 4-7 2DE:Advantages

10、& Disadvantages15传统的基于传统的基于2DE的的差异蛋白质组学分析技术差异蛋白质组学分析技术优点：优点：技术路线成熟技术路线成熟重现性和直观性好重现性和直观性好费用较低费用较低展示差异蛋白质的展示差异蛋白质的PI和和Mw缺点：缺点：蛋白质共迁移蛋白质共迁移(comigration)问题，不适合于很复杂的样品问题，不适合于很复杂的样品线性动态范围较窄线性动态范围较窄强疏水性，强硷性，分子量过大强疏水性，强硷性，分子量过大( 150kD）的）的 蛋白质受到限制蛋白质受到限制16Proteins quantificationQuantitative analysisSCX RP2D

11、chromatographicseparation of peptides数据处理与数据处理与生物信息学分析生物信息学分析ICAT label cysteines heavy light Combine trypsinizeheavy light 基于基于Shotgun差异蛋白质组分析技术流程差异蛋白质组分析技术流程iTRAQ-LC-MS/MS17Protein mixtureProtein digestsSCX column fractionationReverse column separationAuto MS/MS detectionTandem MS spectraBioWorks

12、data base searchResults18 Alleviate some limitations of the 2-DE/MS method Generally high throughput Protein identification and quantification is straightforward process is simple Can be used to ID post-trans. modifications Requires more handling for sample isotopic labeling Low reproducibility Requ

13、ires high level expertise Showed biases for high Mr proteins and against certain types and classes of proteinsAdvantages DisadvantagesShotgun:Advantages & Disadvantages19Sensitivity and dynamic range of protein analysis methodsSensitivity Dynamic Range (Orders of Magnitude)Bio-Safe coomassieG-250 st

14、ain5-10ng2-3Coomassie BlueR-250 stain10-25ng 2-3Silver stain kit 0.5-1ng1-2SYPRO Ruby protein gel stain0.5-1ng3-4MALDI-TOF/TOF-MS 0.5-1pg3-4ESI-MS/MS (ion trap)0.5pg3-4 (0.05fmole-1pmole)20IPG(EF):Immoblized pH gradients isoelectric focusing(固相固相pH梯度等电聚焦梯度等电聚焦)21n使用宽pH范围的胶条（pH 3-10）可以在同一块凝胶上看到样品中绝大多

15、数的蛋白质。n将有重叠区域的窄pH梯度的胶条联合使用，也同样可以得到整个pH 3-10范围的结果。n因为绝大多数蛋白聚焦在pH 3-10的中间区域，所以研究人员有时选用非线性梯度的胶条，这种胶条将两端的pH梯度压得很窄，却可以使中间区域的蛋白质得到较好的分离。n将窄pH梯度的线性IPG胶条重叠使用，效果要比用非线性胶条好得多，它可以检测出样品中更多的蛋白质斑点。pH 梯度范围的选择梯度范围的选择22常用蛋白酶抑制剂常用蛋白酶抑制剂23优点优点: 样品和对照之间的差异蛋白质展现在同一胶上样品和对照之间的差异蛋白质展现在同一胶上,能直观可靠确定能直观可靠确定; 对对isoform 的定量较准确的定

16、量较准确; 比传统比传统2DE动态范围有所增加动态范围有所增加.缺点缺点: 标记效率低只标记效率低只Lys的氨基的的氨基的1%左右左右; 受限于受限于2DE的分离能力的分离能力; 受蛋白质在受蛋白质在2DE上共迁移现象的影响上共迁移现象的影响,可能对复杂样品的可能对复杂样品的isoform定量产生影响定量产生影响.Image analysis:differential quantitation Protein extract 1Label with fluor 1Protein extract 2Label with fluor 2Co-separate by 2D PAGEMix label

17、ed extractsImage gelExcitation wavelength 1Excitation wavelength 2Differential analysisImage analysis: Overlay images 24缺点缺点: 只标记只标记Cys，没有，没有Cys的蛋白质得不到鉴定。纯化含的蛋白质得不到鉴定。纯化含Cys肽段时，肽段时，有效肽段损有效肽段损 失巨大失巨大(达达90%)。ICAT 分子量大，对于较小肽段影响数据库的搜索。分子量大，对于较小肽段影响数据库的搜索。2H, 1H 标记的肽段在反相分离时表现出轻微的洗脱时间不标记的肽段在反相分离时表现出轻微的洗脱时

18、间不 一致现象，使得定量困难一致现象，使得定量困难.ICAT Workflow (技术流程技术流程) 补充补充优点优点: 克服了克服了2DE方法相应的缺点。方法相应的缺点。 只鉴定含只鉴定含cys的肽段的肽段,减少了质谱分析的复杂程度。减少了质谱分析的复杂程度。25优点优点: 全标记，范围广，灵敏度高于全标记，范围广，灵敏度高于ICAT。 可以做绝对定量。可以做绝对定量。缺点缺点: 需要需要MS/MS分折后才能定量分折后才能定量; 酶解后标记样品复杂程酶解后标记样品复杂程 度高度高; 只适合只适合LC-MALDI-TOF/TOF或或LC-MS/MS。iTRAQ Workflow (技术流程技术

19、流程) 补充补充26The mass difference between labelled (12C/13C) and unlabelled peptides are 105.0215Da/111.0419 Da for each m o d i f i e d a m i n o g r o u p : Lys + Protein N-term.D Dm = 6.0204 Da/mod Lys residue优点：优点： 蛋白水平标记，全标记蛋白水平标记，全标记NH2，范围广，灵敏度高，有利于兼容其它蛋白范围广，灵敏度高，有利于兼容其它蛋白 质的分离分法如质的分离分法如2DE，SDS-PA

20、GE等。所有的质谱都可以分析，包括离子阱。等。所有的质谱都可以分析，包括离子阱。缺点：需要用除缺点：需要用除Trypsin 以外的酶切，以提高蛋白质的鉴定率和定量率。以外的酶切，以提高蛋白质的鉴定率和定量率。ICPL Workflow (技术流程技术流程) 补充补充ICPL Reagent Structure27Acid Cleavable ICAT Reagents (ABI) 补充补充优点：移去了亲和基因使标记的肽段分子量整体减小，提高了质谱分析中的效率和优点：移去了亲和基因使标记的肽段分子量整体减小，提高了质谱分析中的效率和 降低了数据库搜索的复杂性。标记在降低了数据库搜索的复杂性。标记

21、在C上使得共流出时间一致。上使得共流出时间一致。缺点：同缺点：同ICAT试剂差不多。试剂差不多。28SILAC Workflow (技术流程技术流程) 补充补充(Stable isotope labeling with amino acids in cell culture)优点：优点： 省去了体外标记化学反应和分离纯化步骤，省去了体外标记化学反应和分离纯化步骤， 有利于低丰度蛋白质的检测定量。有利于低丰度蛋白质的检测定量。 完全兼容任何传统的蛋白分离手段。完全兼容任何传统的蛋白分离手段。缺点：缺点： 不能对组织样品进行分析定量。不能对组织样品进行分析定量。 培养细胞在富含稳定同位素介质中生长

22、，培养细胞在富含稳定同位素介质中生长， 可能会影响细胞的繁殖，由此改变蛋白质的可能会影响细胞的繁殖，由此改变蛋白质的 表达水平。表达水平。 昂贵。不适用于人体样品。昂贵。不适用于人体样品。29补充补充优点：优点： 方便对方便对MS/MS扫描时扫描时Y系列离子的识别。系列离子的识别。 简单，快速。简单，快速。 完全标记，不带倾向性。完全标记，不带倾向性。 不会丢失翻译后修饰信息。不会丢失翻译后修饰信息。缺点：缺点： 不稳定。不稳定。 完全标记后肽段只相差完全标记后肽段只相差4Da。30Label-free strategies:Extracted ion current (XIC)-based

23、quantification 补充补充优点：优点： 可准确定量。可准确定量。 不需标记，可对任何样品进行定量。不需标记，可对任何样品进行定量。 不丢失任何修饰信息。不丢失任何修饰信息。缺点：缺点： 在样品定量分析时，容易出错。在样品定量分析时，容易出错。 需做平行的两次实验，对仪器，环境等要求高。需做平行的两次实验，对仪器，环境等要求高。 不适合时，两个独立的样品进行多次纯化。不适合时，两个独立的样品进行多次纯化。31Peptide ions from more abundant proteins would be selected more frequently in MS spectrum

24、.LC-MS/MS Spectral counts OR number of peptides identified for each protein根据根据spectral counts 的数目直接估计丰的数目直接估计丰度或根据公式计算出一个丰度值度或根据公式计算出一个丰度值例子: emPAI =10PAI-1 where PAI is the number of observed peptides divided by the number of theoretically observable peptides. M.Mann et al MCP 4.9 1265-1272Semiqua

25、ntification: Spectral counts 补充补充优点优点: 简单，直接，多用于单个复杂样本内蛋白质之间的相对定量简单，直接，多用于单个复杂样本内蛋白质之间的相对定量.缺点缺点: 尚无报道用于两个样本之间蛋白质的定量；不同样本、不同尚无报道用于两个样本之间蛋白质的定量；不同样本、不同LC-MS/MS之间的比较不太准确之间的比较不太准确.二、血浆二、血浆/血清蛋白组学血清蛋白组学32(Human Plasma Proteome Project，HUPO PPP)33HUPO PPP2001.10. 国际人类蛋白质组组织(Human Proteome Organization, H

26、UPO)，在美国成立。启动人类蛋白质组计划(HumanProteome Project, HPP). HPP的主要研究目的：鉴定人类基因组编码的全部蛋白质及其功能；揭示：u 构成各种人类组织不同细胞类型的蛋白质表达谱；u 蛋白质组翻译后修饰谱；u 蛋白质组亚细胞定位图；u 蛋白质-蛋白质相互作用关系图；u 蛋白质结构与功能联系图34HPP首批执行计划：人血浆蛋白质组计划 (Human Plasma Proteome Project，HUPO PPP)人肝脏蛋白质组计划 (Human Liver Proteome Project，HLPP )HUPO PPP由美国科学家Gilbert Omenn

27、牵头十多个国家/地区、57个实验室参与HUPO PPP35HUPOPPP的先期(pilot phase)目标：l 比较不同样本收集、处理和储存过程对蛋白质分析的影响；l 通过分析血浆蛋白质组，比较不同蛋白质组分析技术平台的 敏感性和局限性；l 比较不同高丰度蛋白去除(depletion)方法，以及去除与否 对蛋白鉴定的影响；l 数据提取、整理和储存的标准化目的：l 全面认识人类正常血浆/血清中的全部表达蛋白l 全部表达蛋白在不同生理条件下的变异度 HUPO PPP36人血浆人血浆/血清蛋白质组学研究的特别意义血清蛋白质组学研究的特别意义Gilbert Omenn，2006.12人血浆蛋白质学的

28、专著人血浆蛋白质学的专著37人血浆人血浆/血清蛋白质组学研究的独特地位血清蛋白质组学研究的独特地位机体中的机体中的 每一个细胞都可能将反映其生理状态的记录，以排泄物或信号分子的每一个细胞都可能将反映其生理状态的记录，以排泄物或信号分子的 形式释放到血液中形式释放到血液中常规的血液检查仅仅能反映血液所携带信息中的很少的部分；常规的血液检查仅仅能反映血液所携带信息中的很少的部分；在疾病的早期诊断方面，迫切需要发现更有效的疾病标志物，在疾病的早期诊断方面，迫切需要发现更有效的疾病标志物， 但迄今为止，公认的新的疾病标志物的数量极少。但迄今为止，公认的新的疾病标志物的数量极少。38人血浆蛋白质总况人血

29、浆蛋白质总况血浆中总蛋白量的血浆中总蛋白量的99% 由为数不多的由为数不多的22种高丰度蛋白所占有种高丰度蛋白所占有39人血浆蛋白质组的组成人血浆蛋白质组的组成a. 组成性蛋白 主要指肝脏和小肠的分泌蛋白，它们在血浆中发挥作用， 如白蛋白，纤维蛋白原等b. 免疫球蛋白 血浆中大约含有数百万种抗体血浆蛋白根据其来源和功能可分为：高丰度蛋白和低丰度蛋白高丰度蛋白：高丰度蛋白：40低高丰度蛋白低高丰度蛋白c. 组织渗漏蛋白组织渗漏蛋白：组织新陈代谢或发生病理改变导致细胞损伤、 死亡而进入血液的蛋白质，可用于疾病的诊断及愈后评价 如心肌钙蛋白(cardiac troponins)，或心肌球蛋白(myo

30、globin) 用于诊断心肌梗塞d. “远距离远距离”受体和配体：受体和配体：肽类及蛋白质类激素，如胰岛素等 生长因子；临时信使，如非激素类的蛋白e. “局部局部”作用的受体和配体：作用的受体和配体：细胞因子及细胞反应调节因子， 如IL-8f. 一过性通过蛋白：一过性通过蛋白：如脂蛋白、溶酶体蛋白酶g. 异常分泌蛋白：异常分泌蛋白：如前列腺特异性抗原（PSA）等肿瘤 相关蛋白41意义：认识疾病演变过程，分离疾病特征标志和药物靶标如：细胞死亡或损伤后被释放到血浆中的组织渗漏蛋白， 肿瘤或其他病变器官释放到血浆中的异常分泌蛋白等特点：种类繁多，性质各异，作用重要，分离和鉴定相当困难h. 外来蛋白：

31、外来蛋白：如异常微生物、寄生虫、病毒的病原蛋白 及其释放的蛋白i. 小分子量的蛋白及多肽组份：小分子量的蛋白及多肽组份：主要是细胞因子、 多肽类激素及较大蛋白的酶解片断42A. 人血浆中十种丰度最高的蛋白质，人血浆中十种丰度最高的蛋白质，它们占有总蛋白质量的大约它们占有总蛋白质量的大约90%。B. 人血浆中十二种丰度较高的蛋白质，人血浆中十二种丰度较高的蛋白质，它们占有总蛋白质量的大约它们占有总蛋白质量的大约9%。 占总量的占总量的1%，其数量多、其数量多、含量低，但含量低，但最受最受关注。关注。54.31%16.61%3.32%3.64%3.83%1.98%3.45%2.94%1.12%43

32、血浆蛋白组成复杂，蛋白丰度水平差异巨大血浆蛋白组成复杂，蛋白丰度水平差异巨大4445从相对分子质量的分布看，从相对分子质量的分布看，10100 kDa的蛋白质占的蛋白质占有相当大的比例，其中：有相当大的比例，其中： 18% 20 k Da 69% 60 k Da 289种血浆蛋白的分子量大小分布46l 人血浆蛋白是血浆中的所有蛋白质统称，来源广、 组成复杂、种类与数量多人血浆人血浆/血清蛋白质组学研究的特殊性血清蛋白质组学研究的特殊性l 人血浆蛋白质性质的动态范围广，对定量检测要求高l 人血浆蛋白中的高丰度蛋白对与疾病关系更密切的 低丰度蛋白研究的干扰大l 人血浆蛋白质受取材方式的影响较大l

33、血浆蛋白的不稳定性l 数据间的可比性差471、样品的选择、样品的选择2、样品的收集与贮存、样品的收集与贮存3、去除高丰度蛋白和分级技术、去除高丰度蛋白和分级技术4、多维策略的运用、多维策略的运用48蛋白质组学研究中，选用血清或血浆的结果差异很大蛋白质组学研究中，选用血清或血浆的结果差异很大样品的选择样品的选择血浆和血清的形成方式不同，所含蛋白的种类与数量不同血清：纤维蛋白被凝结去除，与纤维蛋白结合的蛋白被损失； 凝结过程中血细胞元素释放大量肽段血浆：抗凝剂 (EDTA、枸橼酸、肝素) 的选择影响研究结果， 尤其是对细胞因子的影响大分析低分子量的蛋白质时：分析低分子量的蛋白质时： 适于选用去除血

34、小板的EDTA血浆或枸橼酸血浆样品肽组学研究时：肽组学研究时： 最好选用去除血小板的血浆49样品的收集与样品的收集与存存收集管：收集管：抗凝剂种类，血清凝集时间，血浆孵育时间和温度抗凝剂种类，血清凝集时间，血浆孵育时间和温度贮存：贮存： 室温室温4小时或小时或6小时，血样品变化很小小时，血样品变化很小 8小时后、特别是小时后、特别是24小时后小时后质谱分析结果有明显变化质谱分析结果有明显变化 4下下的结果与室温下结果差不多，时间推移到的结果与室温下结果差不多，时间推移到48小时或小时或96小时，小时， 变化非常显著；变化非常显著；长期存放在长期存放在-20，-80，或液氮中，或液氮中没有太大的

35、变化没有太大的变化反复冻融反复冻融次数增加却有很大影响次数增加却有很大影响50样品的样品的存与结果存与结果Marshall et al., 2006 3 0 0 04 0 0 05 0 0 06 0 0 07 0 0 03 0 0 04 0 0 05 0 0 06 0 0 07 0 0 0025507530004000500060007000025507530004000500060007000025507530004000500060007000FreshPlasma4 hours8 HoursQualitative and quantitative changes to protein p

36、rofile51n1)血浆或血清参考样本收集处理血浆或血清参考样本收集处理必必须在须在2h小时内完成小时内完成；n2)血浆采用用加入血浆采用用加入1.0ml枸橼酸钠枸橼酸钠(0.105mol/L)抗凝剂抗凝剂(与血的比例为与血的比例为1:9)或者采用喷雾干燥的或者采用喷雾干燥的EDTA为为抗凝剂抗凝剂；血清在室温下；血清在室温下30min内用内用微粉硅胶促凝微粉硅胶促凝后分离。分别收集后分离。分别收集10ml。n3) 分离在分离在2-6下操作下操作(枸橼酸血浆，枸橼酸血浆，血小板计数要小于血小板计数要小于130/ul) 。离心离心后混合即分装到后混合即分装到250ul硅烷化硅烷化EP管管中，中

37、，-70保存。保存。n4) 无无HIV、HBV、HCV、HTLV-1 (人类人类T细胞亲淋巴病毒细胞亲淋巴病毒1型型)、 梅毒，无任何肝损伤。梅毒，无任何肝损伤。n5)整个过程整个过程不加不加cocktail等蛋白酶等蛋白酶抑制剂。抑制剂。n6)所有所有供血者应清晨空腹取血；供血者应清晨空腹取血；24h内无服药和酒。内无服药和酒。n此后的血浆蛋白质组学研究大多此后的血浆蛋白质组学研究大多 采用了这一套程序。采用了这一套程序。Tirumalai R.S., Chan K.C., Prieto D.A.,et al. Mol Cell Proteomics.2003,2: 1096-110352n

38、4下处理血液标本，下处理血液标本，2h内尽快分离血清及细胞；内尽快分离血清及细胞；n用用U9缓冲液缓冲液 (9mol Urea, 2%CHAPS, 1%DTT) 稀释血清稀释血清后，可以后，可以24h内在室温下运送或对血清及内在室温下运送或对血清及WCX（弱阳离（弱阳离子交换）磁珠结合过程进行操作；子交换）磁珠结合过程进行操作；n血清应分装并长期储存在血清应分装并长期储存在-80或液氮，但限冻融或液氮，但限冻融1次；次；n溶血标本应弃用，建议重新取血。溶血标本应弃用，建议重新取血。刘建栋 等。基础医学与临床, 2007, 27(2)193-197CHAPS: 3-(3-胆酰胺丙基)-二乙胺-丙

39、磺酸, 两性离子表面活性剂DTT: 二硫苏糖醇(dithiothreitol), 还原剂用于蛋白质质谱分析的血液标本的处理、用于蛋白质质谱分析的血液标本的处理、运送、操作及储存的标准建议条件运送、操作及储存的标准建议条件53高丰度蛋白的去除和分级技术高丰度蛋白的去除和分级技术54高丰度蛋白严重干扰了低丰度蛋白的检测高丰度蛋白严重干扰了低丰度蛋白的检测A: AlbuminB: TransferrinC: Apo A-I lipoproteinD: Haptoglobin b-chainE: a1-AntitrypsinPPI Website Oct 2002，Plasma Proteome In

40、stitute55IPG4-7A:原血B:低丰度蛋白IPG4-7未去除高丰度蛋白的肝癌患者血浆的2-DE分离结果去除高丰度蛋白的肝癌患者血浆的2-DE分离结果高丰度蛋白严重干扰了低丰度蛋白的检测高丰度蛋白严重干扰了低丰度蛋白的检测-肝癌患者血浆去除高丰度蛋白前后肝癌患者血浆去除高丰度蛋白前后2-D分离结果分离结果56高丰度蛋白的去除策略高丰度蛋白的去除策略57正常人血浆正常人血浆MARSMARS亲合柱亲合柱（结合组分（结合组分-BF-BF、流出组分流出组分-FF-FF）结合组分、流出组分蛋白结合组分、流出组分蛋白的胰蛋白酶切的胰蛋白酶切肽段的阳离子交换色谱分离肽段的阳离子交换色谱分离反相色谱分

41、离离子阱质谱鉴定反相色谱分离离子阱质谱鉴定SequestSequest软件数据检索软件数据检索SepproTM MIXED12SepproTM MIXED12亲合柱亲合柱（结合组分（结合组分-BF-BF、流出组分流出组分-FF-FF ）数据整合与分析数据整合与分析去除血浆高丰度蛋白的技术路线去除血浆高丰度蛋白的技术路线58MechanismMethodsShortcomingMeritbiochemical biophysicalmolecular weight, density, hydrophobicity, surface charge and isoelectric point. no

42、t protein-specific, variable capacities, limited reproducibility simple, convenientaffinity capturedye affinityonly deplete albumin, nonspecificcheapImmuno-affinity capture antibody-based systemexpensivedeplete multi-high abundant proteinsHPPPAttempts for the depletion of high abundant proteins59多重亲

43、和去除系统进行免疫去除前后的猴血浆多重亲和去除系统进行免疫去除前后的猴血浆2DGE图谱图谱安捷伦高丰度蛋白去除柱安捷伦高丰度蛋白去除柱 (MARC)60商业化的多重亲和去除血浆高丰度蛋白的分离系统商业化的多重亲和去除血浆高丰度蛋白的分离系统ProteomeLab IgY蛋白质组分组分离系统蛋白质组分组分离系统(Beckman Coulter 公司公司)ProteoExtract Albumin/IgG高丰度蛋白去除试剂盒高丰度蛋白去除试剂盒 (MERCK公司公司)AurumSerum高丰度蛋白去除试剂盒高丰度蛋白去除试剂盒(Bio-Rad公司公司) Agilent Multiple Affin

44、ity Removal Column (MARC)安捷伦高丰度蛋白去除柱安捷伦高丰度蛋白去除柱 (安捷伦公司安捷伦公司)ProteoPrep 20 Plasma Immunodepletion Kit (PROT-20)去除血浆中去除血浆中20种高丰度蛋白种高丰度蛋白 (Sigma-Aldrich公司公司)61LH6 6种高丰度蛋白种高丰度蛋白同时清除同时清除HHLLLLLLLLLLHHHHHHHLLLL人体血清人体血清 样本样本低丰度蛋白低丰度蛋白低丰度蛋白低丰度蛋白高丰度蛋白高丰度蛋白血清血清/血浆高丰度蛋白清除柱血浆高丰度蛋白清除柱抗抗-白蛋白白蛋白-树脂树脂抗抗-转铁蛋白转铁蛋白-树脂

45、树脂抗抗-结合珠蛋白结合珠蛋白-树脂树脂抗抗-a a1-抗胰蛋白酶抗胰蛋白酶-树脂树脂抗抗-免疫球蛋白免疫球蛋白A-树脂树脂抗抗-免疫球蛋白免疫球蛋白G-树脂树脂AB问题：清除柱是否仅去除特异的高丰度血浆蛋白？问题：清除柱是否仅去除特异的高丰度血浆蛋白？各抗体以特定比率混合装填成色谱柱各抗体以特定比率混合装填成色谱柱62血浆蛋白组成复杂，蛋白质组学研究技术各有利弊，单一技术平台不能达到最佳分离效果。血清血清/血浆蛋白组学研究的多维策略血浆蛋白组学研究的多维策略联合使用不同技术平台并加以适当改进是目前最通用的手段主要包括：去除高丰度蛋白样本预分离系统分离系统质谱鉴定系统63血清血清/血浆蛋白组学

46、研究的多维策略血浆蛋白组学研究的多维策略获得了325个完整的蛋白质 u 高丰度蛋白去除高丰度蛋白去除+色谱分离色谱分离+2-DE+联合质谱鉴定联合质谱鉴定两名健康男性血清免疫亲和吸附法去除血清8种主要的高丰度蛋白色谱预分离(pre-fractionation)， 离子交换色谱(anion-exchange chromatography，AEC) 分子筛色谱(size-exclusion chromatography，SEC)2-DE分离富集的低丰度蛋白组分(fractions)近3700个蛋白质点MALDI-TOF质谱鉴定LC-MS/MS串联质谱进一步分析未能鉴定的蛋白质点Pieper R.

47、et al. 2003, Proteomics, 3(4):422-43264血清血清/血浆蛋白组学研究的多维策略血浆蛋白组学研究的多维策略u 鸟枪测序法(Shotgun sequencing)，即高丰度蛋白去除 + 全蛋白酶解 + 二维液相色谱(阳离子/阴离子交换色谱 + 反相色谱)分离 + 质谱鉴定(离子阱或Q-TOF串联质谱)Adkins JN. et al. 2002, Mol Cell Proteomics, 1(12):947-955女性志愿者血清protein A/G吸附去除免疫球蛋白胰蛋白酶对血浆全蛋白酶解强阳离子交换(strong cation exchange, SCX)反

48、相(reversed phase)色谱分离电喷雾液相离子阱质谱(LCQ Ion Trap)鉴定490种不同血浆蛋白 蛋白质鉴定效率提高了3-5倍操作繁杂，自动化程度比较低影响因素较多稳定性有待提高65血清血清/血浆蛋白组学研究的多维策略血浆蛋白组学研究的多维策略u 血浆全蛋白预分离(色谱聚集+反相高压液相色谱) + 组分胰蛋白酶酶解 + 串联质谱鉴定 (LC-ESI-MS-MS或2D-micro-LC+MALDI-TOF-TOF-MS )Beckman Coulter公司于2003年下旬推出ProteomeLab PF 2D system完整血浆蛋白预分离系统血浆蛋白先经多维色谱分离分离组分经

49、胰蛋白酶酶解质谱鉴定克服了2-DE的缺点，操作简单，自动化程度高，简化了信息处理提高了低丰度蛋白质、膜蛋白、分子量特别大和特别小的蛋白质的分离检测能力回收率高，能保持蛋白质的完整性和活力。66血清血清/血浆蛋白组学研究的多维策略血浆蛋白组学研究的多维策略u 多重窄pH范围2-DE+联合质谱鉴定(MALDI-TOF+LC-MS/MS)Starita Geribaldi M et al. 2003, Proteomics, 3(8):1611-19使用相差1个pH范围的多重固相pH梯度干胶条，大大提高了传统2-DE的分离效率MALDI-TOF + LC-MS/MS联合质谱分析蛋白质鉴定的效率增长两

50、倍，极酸和极碱性蛋白质的分离和鉴定效果67血清血清/血浆蛋白组学研究的多维策略血浆蛋白组学研究的多维策略u 非变性等电聚焦预分离 + 变性等电聚焦预分离 + 1D分离 + 质谱鉴定(LC/MS/MS )Giometti在非变性条件下(不破坏蛋白质的三级结构)进行二维电泳分离分离到的蛋白质仍然保持原始状态使蛋白质生物功能和蛋白质之间相互作用的检测成为可能克服了传统2-DE (采用变性条件)的缺陷Manabe等通过采用非变性二维电泳与变性二维电泳相结合的方法血浆中分离，鉴定出多个IgG结合蛋白68血清血清/血浆蛋白组学研究的多维策略血浆蛋白组学研究的多维策略u SELDI-TOF分离 + Q-TO

51、F质谱鉴定表面增强激光解吸/离子化 -飞行时间质谱(surfaceenhanced laser desorption/ionization-time of flight,SELDI-TOF)是一种以固相表面亲和为基础的质谱分离技术完整血浆蛋白先经过与不同亲和表面(化学表面芯片和生物表面芯片)结合纯化SELDI质谱分离Q-TOF质谱鉴定差异蛋白质，尤其是小分子蛋白血浆蛋白的分离和鉴定中与上述其他技术具有很大的互补性用于疾病相关的血浆蛋白质组研究69血清血清/血浆蛋白组学研究的多维策略血浆蛋白组学研究的多维策略进行OGE之前用免疫方法去除6个血浆中的主要蛋白质，用1.5 mg分离组分，顺利获得81

52、种蛋白质，其中仍有1个免疫球蛋白u 脱离凝胶电泳(Off-gel electrophoresis，OGE)技术Heller M. et al, 2005, Electrophoresis, 26(6):1174-88应用OGE技术经2个步骤将完整的蛋白质和肽段分解成散在的液态片段LC-MS/MS分析肽片段用1.5 mg人血浆蛋白获得了53个蛋白质，其中10个为不同的免疫球蛋白12 mg人血浆蛋白，获得73个蛋白，其中15个与免疫球蛋白相关处于试验阶段处于试验阶段70血清血清/血浆蛋白组学研究中多维策略的优势血浆蛋白组学研究中多维策略的优势2D1D3D4DPlasm/SerumPlasm/Ser

53、umPlasm/SerumPlasm/Serum1 LC-MS/MSrun20-40 LC-MS/MS runs100-150 LC-MS/MS runs100-150 LC-MS/MS runs1D SDSPAGEMicroSol-IEF1D SDSPAGE1D SDSPAGEMicroSol-IEFMajor ProteinDepletion100 800-10002000+2800+UniqueProteinsMicroSol-IEF：microscale solution IEF 微量等电聚焦电泳71血清血清/血浆蛋白组学研究的临床应用血浆蛋白组学研究的临床应用生物标志物的识别淀粉样变

54、和沉积疾病遗传性疾病免疫蛋白质组学脂质组学降解组学和多肽组学72血清血清/血浆蛋白组学研究的临床应用血浆蛋白组学研究的临床应用淀粉样变和沉积疾病淀粉样变和沉积疾病遗传性疾病遗传性疾病免疫蛋白质组学免疫蛋白质组学脂质组学脂质组学淀粉样变病(amyloidosis)是指一些以折叠结构的纤维蛋白(鉴定成分)为主的淀粉样物质在器官组织细胞外沉积所引起的疾病如先天性糖代谢缺乏综合征识别组织相容复合物(MHC)、特异抗体的抗原、外源病毒或疾病产生的蛋白识别脂蛋白及结合蛋白73血清血清/血浆蛋白组学研究的临床应用血浆蛋白组学研究的临床应用降解组学和多肽组学降解组学和多肽组学识别与鉴定与疾病、生物过程中蛋白代

55、谢特异相关的多肽生物标志物生物标志物 (Biomarkers)生物标志物现特指疾病或机体状态的信息指标，如基因序列或突变、mRNA 表达谱或组织蛋白等。主要指正常生物学过程、致病过程或正常生物学过程、致病过程或干预疗法的药理反应等过程的一种生物指标干预疗法的药理反应等过程的一种生物指标FDA在“药物基因组学“提出”有效生物标志物“有效生物标志物有效生物标志物”是一种得到广泛认可的，具有生理学、毒理学、是一种得到广泛认可的，具有生理学、毒理学、药理学或者临床意义的指标药理学或者临床意义的指标”74血清血清/血浆蛋白组学研究的临床应用血浆蛋白组学研究的临床应用理想的生物标志物具有的特点与疾病发生、

56、发展机制紧密相关：与疾病发生、发展机制紧密相关：具有较好的诊断、危险性分类具有较好的诊断、危险性分类 和预后评估的价值和预后评估的价值真实性真实性 具有良好的灵敏度和特异性具有良好的灵敏度和特异性具有可预测性具有可预测性 常用预测值常用预测值 (predictive value，PV) 表示，包括阳性预测值表示，包括阳性预测值(PPV) 和阴性预测值和阴性预测值 (NPV)能有效地用于临床疾病的分型能有效地用于临床疾病的分型检测方法可实现标准化检测方法可实现标准化 易于掌握和推广应用，具有非创伤性，适合于高通量分析，费用适当易于掌握和推广应用，具有非创伤性，适合于高通量分析，费用适当75Pet

57、ricoin等用疏水型芯片结合并分离了卵巢癌患者血浆相关蛋白，在肿瘤和健康血清之间发现了5个差异明显的蛋白质峰，它们共同构成卵巢癌诊断模型用该模型对肿瘤和健康人血浆进行盲筛，该模型诊断肿瘤的敏感性为100%，特异性为95%血清血清/血浆蛋白组学研究的实例血浆蛋白组学研究的实例76Li等选用金属离子鳌合芯片结合并分离乳腺癌血浆蛋白，发现3个乳腺癌特异的差异蛋白峰。用这3个特异蛋白标志盲筛一组乳腺癌和健康人血浆蛋白，乳腺癌检出的敏感性为93%，特异性为91%血清血清/血浆蛋白组学研究的实例血浆蛋白组学研究的实例77三、尿蛋白质组学三、尿蛋白质组学Urinary Proteomics78尿蛋白质组学

58、研究的独特地位标本获得上：方便、无害、量大保存上：相对稳定可溶性蛋白固相成分正常人的尿液中存在1500种以上的蛋白质来源于大蛋白质分子裂解的大量多肽片段79尿蛋白质的来源：可溶性蛋白尿蛋白质的来源：可溶性蛋白近端肾小管近端肾小管80尿蛋白质的来源：固相成分尿蛋白质的来源：固相成分急性肾小管坏死时的急性肾小管坏死时的肾小球疾病时的足突状细胞脱落肾小球疾病时的足突状细胞脱落Exosomes又称外泌体又称外泌体注注1：上皮细胞包括尿足细胞（：上皮细胞包括尿足细胞（urinary podocytes）、尿道上皮细胞在内的各种泌尿器管道的）、尿道上皮细胞在内的各种泌尿器管道的 上皮细胞上皮细胞81尿蛋白

59、质组学的研究意义尿蛋白质组学的研究意义nin the early diagnosis of disease nin classification of disease with regard to likely therapeutic responses nin assessment of prognosis nin monitoring response to therapy nThese approaches have potential value, not only in diseases of the kidney and urinary tract, but also in sys

60、temic diseases that are associated with circulating small-protein and peptide markers that can pass the glomerular (血管小球的) filter.82一个经典流程一个经典流程尿蛋白质组学的研究范例尿蛋白质组学的研究范例1D：one-dimensional; HPLC：high-performance liquid chromatography HAS： human serum albumin MW：molecular weight LC：liquid chromatography

61、MS：mass spectrometry SDS：sodium dodecyl sulfate83以1D SDS 和 RP HPLC对尿蛋白质组进行分离和分级对分离和分级后的蛋白质组成份进行胶上或溶液内酶解，以LTQ-FT 和 LTQ-Orbitrap两种质谱仪进行MS、MS-MS分析从十名健康受试者的尿中鉴定出了1543种蛋白尿蛋白质组学的研究范例尿蛋白质组学的研究范例Gene Ontology (GO)分析表明, 几乎有一半是膜蛋白几乎有一半是膜蛋白细胞外蛋白、溶酶体和细胞质膜蛋白均在尿中得到富集细胞外蛋白、溶酶体和细胞质膜蛋白均在尿中得到富集尿中的细胞质膜蛋白可能来自尿中的细胞质膜蛋白可

62、能来自exosomes的分泌的分泌Gene Ontology（GO）包含了基因参与的生物过程，所处的细胞位置，发挥的分子功能三方面功能信息，并将概念粗细不同的功能概念组织成DAG（有向无环图）的结构。GO表示各物种的基因功能分类体系，较全面地概括了基因的功能信息。在基因表达谱分析中，GO常用于提供基因功能分类标签和基因功能研究的背景知识。利用GO的知识体系和结构特点，可发掘与基因差异表达现象关联的单个特征基因功能类或多个特征功能类的组合。84acetone precipitation（丙酮沉淀）（丙酮沉淀）Ultracentrifugation（超速离心）（超速离心）The urine sam

63、ples were fractionated by two different methods. The proteins were separated by 2D-PAGE. 尿蛋白的分离852-DE comparing the urine of septic（败血症） rats without ARF to septic rats with ARF86激素敏感型与激素耐药型先天性肾病综合征的SELDI-TOF-MS研究尿蛋白组学研究举例分别以CM10， IMAC 30，H50和Q10蛋白质芯片对8788四、唾液蛋白质组学四、唾液蛋白质组学Salivary Proteomics89概念90n

64、唾液（Saliva）主要是腮腺、舌下腺、下颌下腺的分泌产物 n唾液与血液、尿液一样，在疾病的临床筛查、诊断中具有重要意义的诊断样品。n人体的多种疾病、影响唾液成份，唾液蛋白成分可提供局部或全身性病症的线索和状况。 唾液(Saliva)及对疾病的诊断意义 下颌下腺下颌下腺(submandibular, SM) 舌下腺舌下腺 (sublingual, SL)腮腺腮腺( (parotid) )三叉神经三叉神经面神经面神经91水分水分(99%)酶酶酶阻滞物酶阻滞物生长因子生长因子细胞因子细胞因子免疫球蛋白免疫球蛋白粘液素粘液素糖蛋白糖蛋白少量无机盐等少量无机盐等唾液的成分唾液的成分92na：血清成分的

65、选择性主动转运nb：脂溶性成分的被动扩散nc：选择性成分的简单过滤nd：腺泡细胞活化泵将水合Na+转运至 唾液腺导管ne：唾液腺导管细胞将低渗唾液中的 Na+泵回血液。n图中，f为细胞膜，g为细胞膜孔，h为细胞间隙，i为腺泡细胞。唾液成分与血清成分是有密切的关系 93唾液中的主要功能蛋白质SalivaryFamiliesAnti-BacterialBufferingDigestionMineral-izationLubrication & ViscoelasticityTissueCoatingAnti-FungalAnti-ViralCarbonic anhydrases(脱水酶),Hist

66、atins(富组蛋白)Amylases(淀粉酶),Mucins(粘蛋白), Lipase(脂酶)Cystatins(胱蛋白),Histatins,Proline-rich proteins,StatherinsMucins, StatherinsAmylases,Cystatins, Mucins, Proline-rich proteins, StatherinsHistatinsCystatins,MucinsAmylases, Cystatins,Histatins, Mucins,Peroxidases蛋白类94唾液蛋白质组学的主要研究内容唾液蛋白质组学的主要研究内容95国外研究进展国外研究进展96全唾液蛋白质谱研究全唾液蛋白质谱研究嗜中性白细胞分离纯化出的3种阳离子小肽（HNP-1、HNP-2与 HNP-3）中的一种，具有抑制艾滋病病毒复制的功能n相对分子质量最大的蛋白质是粘蛋白97五、脑脊液蛋白质组学五、脑脊液蛋白质组学Cerebrospinal fluid Proteomics98n 脑脊液中的蛋白质组的变化被认为是与许多中枢神经 系统疾病有关n 脑脊液：无色透明，充满在