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1、SDS-PAGE 电泳测定蛋白质相对分子质量 实验目的 了解 SDS-PAGE 垂直板型电泳法的基本原理及操作技术。 学习并掌握 SDS PAGE 法测定蛋白质相对分子量的技术。 实验原理 SDS-PAGE 电泳法，即十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳法，。 1在蛋白质混合样品中各蛋白质组分的迁移率主要取决于分子大小和形状以及所带电荷多 少。 2在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十二烷基硫酸钠（ SDS ），SDS 是一种阴离子 表面活性剂， 加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开， 并结合到蛋白质分子上 （在 一定条件下， 大多数蛋白质与 SDS 的结合比为 1.4gSDS/1g 蛋
2、白质） ，使各种蛋白质 SDS 复合物都带上相同密度的负电荷， 其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量， 从而掩盖了 不同种类蛋白质间原有的电荷差别。 此时， 蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量 大小，而其它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。 3.当蛋白质的分子量在 15000200000之间时，电泳迁移率与分子量的对数值呈直线关 系，符合下列方程： 1gMr =K bmR 式中：Mr为蛋白质的分子量； K为常数；b为斜率；mR为相对迁移率。在条件一定时， b 和K均为常数。 若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图， 可获得一条标准曲线。 未知蛋白质在相同条件下进行
3、电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。 (b) SDS-PAGR电泳分离蛋白 仪器、原料和试剂 仪器：垂直板型电泳槽；直流稳压电源； 50或100卩1微量注射器、玻璃板、水浴锅，染色 槽；烧杯；吸量管；常头滴管等。 原料：低分子量标准蛋白质按照每种蛋白 0.51mg - ml-1样品溶解液配制。可配制成单一蛋 白质标准液，也可配成混合蛋白质标准液。 试剂： (1) 分离胶缓冲液(Tris-HCI缓冲液 PH8.9 ):取1mol/L盐酸48mL , Tris 36.3g,用无离子 水溶解后定容至100mL。 (2) 浓缩胶缓冲液(Tris-HCI缓冲液 PH6.7 ):取1moI
4、/L盐酸48mL, Tris 5.98g,用无离子 水溶解后定容至(c) :山处丿 I (a) SMS餐电貂辺肪 夬程滞玻隅片之间 电理怡汽 100mL。 (3) 30%分离胶贮液：配制方法与连续体系相同，称丙烯酰胺( Acr) 30g及N , N-甲叉 双丙烯酰胺(Bis)0.8g，溶于重蒸水中，最后定容至 100ml，过滤后置棕色试剂瓶中， 4 C 保存。 (4) 10%浓缩胶贮液：称 Acr 10g及Bis 0.5g，溶于重蒸水中，最后定容至 100mL ,过滤 后置棕色试剂瓶中，4 C贮存。 (5) 10%SDS溶液：SDS在低温易析出结晶，用前微热，使其完全溶解。 (6) 1%TEM
5、ED ; (7) 10%过硫酸铵(AP ):现用现配。 (8) 电泳缓冲液(Tris-甘氨酸缓冲液 PH8.3 ):称取Tris 6.0g,甘氨酸28.8g, SDS 1.0g, 用 无离子水溶解后定容至 1L。 (9 )样品溶解液：取 SDS 100mg，巯基乙醇0.1mL，甘油1mL，溴酚蓝2mg , 0.2mol/L , pH7.2磷酸缓冲液0.5mL，加重蒸水至10mL (遇液体样品浓度增加一倍配制)。用来溶解 标准蛋白质及待测固体。 (10 )染色液：0.25g考马斯亮蓝 G-250 ,加入454mL 50%甲醇溶液和46mL冰乙酸即可。 (11 )脱色液：75mL冰乙酸，875mL
6、重蒸水与50mL甲醇混匀。 实验步骤 1 .安装夹心式垂直板电泳槽： 目前，夹心式垂直板电泳槽有很多型号， 虽然设置略有不同， 但主要结构相同，且操作简单， 不易泄漏。同学们可根据具体不同型号要求进行操作。 主要 注意：安装前，胶条、玻板、槽子都要洁净干燥；勿用手接触灌胶面的玻璃。 2 配胶：根据所测蛋白质分子量范围，选择适宜的分离胶浓度。本实验采用 SDS-PAGE 不连续系统，按下表的配制分离胶和浓缩胶。 试剂名称 配制 20ml 不同浓度分离胶所需各种试剂用量 /ml 配制 10ml 浓缩胶所需试剂用 量 5% 7.5% 10% 15% 3% 分离胶贮液 (30%Acr-0.8%Bis)
7、 3.33 5.00 6.66 10.00 - 分离胶缓冲液 (pH8.9Tris-HCI ) 2.50 2.50 2.50 2.50 - 浓缩胶贮液 (10%Acr-0.5%Bis ) - - - - 3.0 浓缩胶缓冲液 (pH6.7 Tris-HCl ) - P - - 1.25 10% SDS 0.20 0.20 0.20 0.20 0.10 1%TEMED 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 重蒸馏水 11.87 10.20 8.54 5.20 4.60 混匀后， 置真空干燥器中， 抽气 10min 10%AP 0.10 0.10 0.10 0.10 0.05 3 制备
8、凝胶板： （1 ）分离胶制备：按表配制 20ml 10%分离胶，混匀后用细长头滴管将凝胶液加至长、短 玻璃板间的缝隙内，约 8cm高，用1ml注射器取少许蒸馏水，沿长玻璃板板壁缓慢注入， 约3 4mm高，以进行水封。约 30min后，凝胶与水封层间出现折射率不同的界线，则表 示凝胶完全聚合。倾去水封层的蒸馏水，再用滤纸条吸去多余水分。 （2）浓缩胶的制备：按表配制 10ml 3%浓缩胶，混匀后用细长头滴管将浓缩胶加到已聚合 的分离胶上方，直至距离短玻璃板上缘约 0.5cm处，轻轻将样品槽模板插入浓缩胶内，避 免带入气泡。约 30min后凝胶聚合，再放置 20 30min。待凝胶凝固，小心拔去样
9、品槽模 板，用窄条滤纸吸去样品凹槽中多余的水分，将 pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液倒入上、下贮槽 中，应没过短板约 0.5cm以上，即可准备加样。 4 .样品处理及加样 各标准蛋白及待测蛋白都用样品溶解液溶解，使浓度为 0.51mg/mL，沸水浴加热3分钟, 冷却至室温备用。处理好的样品液如经长期存放，使用前应在沸水浴中加热 1分钟，以消 除亚稳态聚合。 一般加样体积为10 - 15讥（即2 10进蛋白质）。如样品较稀，可增加加样体积。用微 量注射器小心将样品通过缓冲液加到凝胶凹形样品槽底部，待所有凹形样品槽内都加了样 品，即可开始电泳。 5 .电泳 将直流稳压电泳仪开关打开，开始时将电流
10、调至 10mA。待样品进入分离较时，将电流调 至20 - 30 mA。当蓝色染料迁移至底部时，将电流调回到零，关闭电源。拔掉固定板，取 出玻璃板，用刀片轻轻将一块玻璃撬开移去， 在胶板一端切除一角作为标记， 将胶板移至大 培养皿中染色。 6染色及脱色 将染色液倒入培养皿中，染色 1h 左右，用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白区 带清晰，即用直尺分别量取各条带与凝胶顶端的距离。 计算 1.相对迁移率 mR = 样品迁移距离（ cm ） /染料迁移距离（ cm ） 2. 以标准蛋白质分子量的对数对相对迁移率作图， 得到标准曲线， 根据待测样品相对迁移率， 从标准曲线上查出其分子量。 注意事
11、项 1. 不是所有的蛋白质都能用 SDS- 凝胶电泳法测定其分子量，已发现有些蛋白质用这种方 法测出的分子量是不可靠的。 包括： 电荷异常或构象异常的蛋白质， 带有较大辅基的蛋白质 （如某些糖蛋白）以及一些结构蛋白如胶原蛋白等。例如组蛋白 F1 ，它本身带有大量正电 荷，因此，尽管结合了正常比例的 SDS ，仍不能完全掩盖其原有正电荷的影响，它的分子 量是21,000，但SDS-凝胶电泳测定的结果却是 35,000。因此，最好至少用两种方法来测 定未知样品的分子量，互相验证。 2 .有许多蛋白质，是由亚基（如血红蛋白） 或两条以上肽链（如 a胰凝乳蛋白酶） 组成的， 它们在 SDS 和巯基乙醇的作用下， 解离成亚基或单条肽链。 因此，对于这一类蛋白质， SDS- 凝胶电泳测定的只是它们的亚基或单条肽链的分子量， 而不是完整分子的分子量。 为了得到 更全面的资料，还必须用其它方法测定其分子量及分子中肽链的数目等，与 SDS-凝胶电泳 的结果互相参照。 思考题 1 . SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳与聚丙烯酰胺凝胶电泳原理上有何不同？ 2.用SDS-凝胶电泳法测定蛋白质分子量时为什么要用巯基乙醇？ 3用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量，为什么有时和凝胶层析法所得结果 有所不同？是否所有的蛋白质都能用 SDS-凝胶电泳法测定其分子量？为什么？
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