p53基因突变的检测方法及临床应用

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1、综述与进展 文章编号 : 1001 2764X ( 2008 ) 03 20224203中图分类号 : Q754文献标识码 : Ap53基因突变的检测方法及临床应用 3周卫平 1 综述 ,王惠民 2 ,贾春平 3 审校 ( 1. 通州市人民医院检验科 ,江苏南通 226300; 2. 南通大学附属医院检验科 ,江苏南 通 226001; 3. 中国科学院上海微系统与信息技术研究所 ,上海 200050 )关键词 : p53基因 ;基因突变 ;肿瘤p53 基因与通常的抑癌基因不同 ,突变后具有癌基因作用 1 。它是迄今为止发现的与人类肿瘤相关性最高的基因 。 最初的研究 发 现 , p53 突

2、变 后 其 表 达 的 核 蛋 白 功 能 丧 失 与L i2F raum en综i 合征 (L FS) 相关 。L FS是一种家族性疾病 , 以 高发多种新生物为特征 。此病在有横纹肌肉瘤家族史的儿 童中首次发现 ,家族其他成员也高发乳腺癌 、脑癌 、骨肉瘤和 淋巴瘤等疾病 。这些患者在基因种系第 17 号染色体上常丢 失一个 p53 等位基因 ,并且在存留的等位基因上仍有一个点 突变 。p53基因敲除小鼠在出生时基本正常 ,但经过短的潜 伏期后 ,易于发生各种各样的肿瘤 2 。现查明 , p53 基因的 缺失和突变与肿瘤的发生 、发展及预后等密切相关 。人类 p53位于 17 P13 ,全

3、长 1620 kb,含有 11个外显子 和 10个内含子 ,分为野生型 、突变型及介于两者之间的杂合 状态等 3种类型 3 。野生型 p53转录 2. 8 kb的 mRNA ,基因 编码 393个氨基酸和 1 个分子量 53 000 的核内磷质蛋白 。 p53以四聚体的形式存在体内 ,有 4个主要功能区 : N 端酸 性转录激活区 ; 序列特异性结合区 (核心区 ) ; 寡聚区 ; 羧基端区 。最常见的 p53突变为点突变 ,而点突变最常见的是单个 碱基替换 。p53 结 构 上 有 5 个 进 化 上 的 高 度 保 守 区 , 多 数p53基因突变是发生在这些保守区内的 5 8 外显子上

4、4 。 由于 p53 基因突变是人类多种恶性肿瘤最常见的基因改变 , 约有 50%以上的肿瘤患者发现有 p53突变 。因此如何准确 、 快速 、方便地检测 p53基因突变 ,对于确定肿瘤的病因 、判断 预后以及治疗方案的制定具有十分重要的意义 。1 p53基因未知点突变的检测1. 1 传统筛查法 核糖核酸酶切法 : 5 该法简单 ,但需要特 异性探针 ,且只能检测约 70 %的突变以及不能确定突变的准 确 位 置 。化 学 错 配 裂 解 法 ( chem ica l m ism a tch c leavage, CMC) : 6 理论上 ,当野生型和突变型同时被 标记时可检测100%的突变

5、,该法是目前检测 DNA 片段范围最大的方法 。 但不能确定突变的具体位置 及性质 , 加之所 用化学物质有 毒 ,以及对 1 /3的 T / G错配碱基缺乏修饰活性 ,限制了该法 应用 。变性梯度凝胶电泳 ( dena tu ring grad ien t ge l e lec trop ho2 ro sis, D GGE) 7 : D GGE同样只能确定突变的存在 ,不能进行 突变位置和性质的定量 。 PCR 2单链构象多态性分析法 ( sin2 gle2stranded confo rm a tion po lymo rp h ism , PCR 2SSCP ) : 适 合 基 层单位大

6、批量样本及未知的基因突变点检测 。但同样不能确定突变的具体位置及性质 。 PCR 产物在 150200 bp 片段最合适 ,检出率可达 90 % , 若超过 300 bp , 其敏感度随 PCR 产物的长度增加而下降 。毛细管电泳 ( cap lilla ry e lec trop ho re2 sis, CE) 8 :完成一次电泳仅需几十分钟 ,电泳过程可用检测 器自动采集数据 ,无须染色 、照相 ,且具进样量少等优点 ,但 该法不能进行突变位置和性质的测定 ,另外仪器投入费用和 耗材较贵 ,应用受到限制 。1. 2 变性高效液相色谱 ( dena tu ring h igh p e rfo

7、 rm ance liqu id ch rom a tograp hy, DH PLC) 原理是基于解链的和部分解链的 双链 DNA 在部分失活条件下具有不同的性质 。由于杂合子 个体的 DNA 经扩增产生异源双链 ,与完全匹配的同源双链 的解链特征不同 ,在部分加热变性下 ,异源双链 DNA 分子更 容易解链形成 Y形结构 ,与固定相的结合能力下降 。当流动 相中浓度加大时 ,异源双链将先于同源双链被洗脱下来 ,带 有突变序列的样品呈现出异源双链与同源双链混合的峰形 特征 ,而不含突变序列样品只有同源双链的峰形 。由此可检 测出含有单个碱基的置换 、插入或缺失等突变 9 。 Eva等依 据此

8、方法利用 WAV ETM DNA 分析系统 ,对乳腺癌 、卵巢癌等 p53突变进行了检测 10 。DH PLC 是一种快 速 、准确的检测方法 。但该法只能提供个体有无突变的信息 ,无法得出突变类型 。当有多个片段需要检测时 ,由于有多个解链温度 ,需 要多步检测 ,从而增加了工作强度 。1. 3 酵母中分离的等位基因功能分析技术 ( func tiona l ana ly2 sis of sep a ra ted a lle le s in yea st , FA SA Y) 其原理主要是基于 绝大多数的 p53 突变都会造成 P53 蛋白转录激活功能的丧 失 ,是一种在 RNA 水平上检测

9、 p53 突变的酵母基因工程技 术 。 FA SA Y使用一个内源 A de2 基因缺陷的酿酒酵母菌株 Yig397,在它的染色体上整合了一个含有 P53 蛋白的结合位 点 ( R GC序 列 ) , R GC 启 动 控 制 了 下 游 一 个 可 以 表 达 正 常 AD E2的报告 基 因 , 当 转 入 从 肿 瘤 组 织 样 本 中 得 到 的 p53 cDNA R T2PCR 产物和带有缺口的酵母表达载体时 ,因为线 性表达载体含有 p53 cDNA 上编码 67 到 346 位氨基酸的缺 口 ,留有 p53 cDNA 上编码 1 266 和 347 2393 位氨基酸的同源 区

10、,从而 可以与 R T2PCR 产物的两端同源序列发生同源 重 组 ,产生缺口修复的表达载体 。若该表达载体表达转录功能 正常的 P53蛋白 ,就会与宿主菌株染色体上的特异性序列结 合 ,激活下游报告基团 AD E2 的表达 , 从而在选择性培养基 平板上形成白色大菌落 ,反之形成红色小菌落 。通过红色 /3基金项目 :国家 863 课题 ( 2006AA03 Z334 ) ,南通市社会发展计划 (指导性 )项目 ( S7926 ) 。作者简介 :周卫平 , 1973 年生 ,男 ,主管技师 ,在职硕士研究生 ,主要从事分子生物学方面的研究 。通讯作者 :王惠民 ,男 ,主任技师 , E2m

11、a il: n tfyjyykp ub. n t. jsinfo. ne t。225临床检验杂志 2008年第 26卷第 3期 Ch ine se Jou rna l of C lin ica l L abo ra to ry Sc ience, 2008 , Vo l126, No13白色菌落的比例判断 p53 基因的状况 11212 。 FA SA Y优点是既能检测 p53突变又能评价 p53 的转录激活功能 ,但亦存在 操作繁琐 ,有时测定存在一定的红色背景 。限制了其广泛应用 。2. 3 DNA 直接测序法 ( d irec t sequenc ing , D S) 指用不对称PCR

12、直接获得测序单链 ,进行直接的序列分析而无须克隆到 测序载体上 ,一般采用 Sange r的末端终止法 。由于四色荧光标记的自动化测序仪的研制成功和运用 ,使得测序效率大大提高 ,同时也克服了同位素危害人体的缺点 。能确定突变的 部位及性质 ,是所有检测方法中最灵敏的一种 。可作为突变检测和诊断的参考方法 。但相比而言该法依然存在繁琐 、费用高 、不能大批量筛查 、不适合临床等缺点 。3 表达产物 ( p53蛋白 )检测人体各种正常细胞中都有低含量的 p53 蛋白 ,这些低含 量的 p53蛋白容易水解 ,并且半衰期很短 ,仅 10 20 m in左右 ,一般难以检测 。在生长旺盛的细胞中其含量

13、可增加 4 倍以上 ,而在转化细胞或肿瘤细胞中 ,其含量可增加 100 倍以 上 ,且由于 p53基因突变导致的 p53 蛋白氨基酸序列或构型发生变化 ,以及其他未知因素 ,导致 p53 蛋白不易水解 ,半衰期较长 ,在肿瘤细胞中堆积 。因此可以通过对 p53 蛋白的检 测进行肿瘤的诊断和个体化治疗方案的制定 。3. 1 免疫组织化学法 ( imm unoh ischem ica l sta in ing) 该法原理是应用特异性抗体与 p53 蛋白产生抗原抗体反应 ,通过 一定的显色方法后 ,根据显色斑点的有无和强弱判断 p53 蛋白的存在 ,从而间接判断 p53基因点突变是否存在 。该法传

14、统 ,应用较广 ,但存在不同切片中组织块的抗原修复 、抗体浓 度 、孵育温度及时间等不同 ,造成不同批次染色的差异 ,进而导致判读的不便 ,尚可能导致假阳性和假阴性的错误发生 。 另外不能大批量筛查样本和术后动态观察 。3. 2 组织微阵列技术 ( tissue m ic roa rray) 又称组织芯片 是随着芯片技术发展而来的一种方法 。可在一张玻片上用不 同的方法一次性完成几百乃至几千的临床组织样本的基因表达产物的分析 ,可快捷 、经济 、大规模地筛查组织中基因结 构的改变和表达的异常 。具有高通量 、微型化 、自动化 、成本 低 、防污染并可节约宝贵的病理标本资源 。但组织芯片中的 少

15、量组织能否代表肿瘤全貌是仍需考虑的主要问题 。3. 3 流式细胞术 ( flow cytom e try techn ique, FCM ) 首先将新 鲜肿瘤组织制成细胞数为 1 106 /m l的悬液 ,然后用抗 p53单克隆抗体对细胞进行免疫荧光染色 ,再通过流式细胞仪检 测荧光 ,荧光强弱间接反映 p53 蛋白的浓度 。因需要昂贵的流式细胞仪 ,应用受到限制 。3. 4 酶联免疫吸附试验 ( EL ISA ) 双抗体夹心 EL ISA 法检 测血清 p53 蛋白的基本原理是抗原抗体的特异性反应 ,洗脱掉未结合的部分 ,再通过最后的显色来定性或半定量 p53 蛋 白 。具有较好的敏感性 、

16、重复性和稳定性 ,但部分非癌症患 者存在高滴度的抗 p53 抗体干扰 ,有特异性差 、容易出现假阳性和操作繁琐等缺点 。4 p53检测的临床应用4. 1 通过对基因及表达产物的检测 ,可以对肿瘤作出早期 诊断和预测 。因为有的肿瘤患者在肿瘤发生时 、甚至肿瘤发 生之前就可能检测到 p53 基因突变 。另外单独以及联合检测其他标志物可对肿瘤的发生 、发展 、预后及转移作出预测 和判断 。4. 2 近年来的研究表明 , p53基因的表达也影响肿瘤对放化( h igh re so lu tion m e lt, HRM ) 是国外1. 4 高分辨率熔解新近发展起来的 SN P及突变检测工具 。此法不

17、受突变碱基位点和类型的限制 。其原理为不同的 DNA 分子具有不同的 解链温度 。根据解链温度曲线与标准曲线的对照 ,判断是否存在突变 。其方法为在作 PCR 前加入荧光染料 (一般为 LCGreen ) , 与 反 应 buffe r、引 物 、dN TP、酶 、模 板 等 混 合 。 LC Green染料饱和加入且对 PCR 不会有任何抑制作用 ,扩增过 程中 LC Green嵌入到 DNA 双链中 , PCR 结束后根据仪器的不同 ,选择直接运行高分辨率熔解或转入专作高分辨率熔解 的仪器 。随着 DNA 的解链 , LC Green不断释放出来 ,此时仪器的光学检测系统采集密集的荧光信号

18、变化并绘制熔解曲 线 ,根据曲线准确区分野生型 、杂合突变 、纯和突变 。M ichae l 等 13 采用此法通过 Ro to r2Gene6000仪对卵巢癌 、乳腺癌组织p53的外显子 58进行了测定 ,并对可疑曲线样本进行了测 序 ,证实了突变的存在 。显示此法是一种简单和快速的筛查 p53突变的高效技术 。该技术对仪器的要求较高 ,要求每个点在 0. 10. 3的温度密度 ,很少有仪器能达到 ,限制了其应 用 。另外此法只能检测出突变 ,不能测出具体位置和类型 。2 已知点突变的 p53基因检测2. 1 PCR 2限制性片段长度多态性分析法 ( re stric ted fragm e

19、n t length po lymo rp h ism , R FL P) 基本原理是特定的限制性核酸内切酶具有识别并剪切特定的 DNA 序列位点的能力 ,因此 特定的 DNA 被限制性内切酶水解后的片段长度发生变化 , 通过琼脂糖凝胶电泳可反映 DNA 特定区域的结构改变 ,如点突变 、缺失 、插入和重排等 。 PCR 与 R FL P的联合应用 ,简 化和加快了分析的过程 ,促进了该法的广泛使用 。其优点是操作简便 ,仅为 PCR 加上限制酶 ;复现性良好 ,可检出 1个碱 基之突变 。缺点是不能检出 1 个碱基以外的突变 ,如需检测 几个碱基 ,则要由几个检测系统分别检测 。另外相邻并同

20、时 发生的点突变无法用此法检测 。2. 2 寡核苷酸芯片技术 ( o ligonuc leo tide m ic roa rray, OM )是基因芯片技术的一种 14 。OM 技术用于检测基因突变的 基本原理是在玻璃 、硅等载体上 ,根据检测需要 ,设计 、固定多个特异的寡核苷酸探针 。而后将大量经 PCR 扩增 , 体外转录等技术掺入荧光标记分子的待测 DNA 与之杂交 ,若两 者存在至少一个碱基的差异时 ,即可产生杂交结果即荧光信 号值的差异 。以此来判断待测样品与芯片上的哪一个探针完全配对 。即可得出待测样品特定位点的碱基序列 。从而 判断是否存在突变及突变位点和 类型 。该法具 有

21、准 确 、快速 、高效 和 高 通 量 地 分 析 生 物 基 因 信 息 的 优 点 。M e red ith 等 15 利用 A ffym e trix公司的商品化的基因芯片对乳腺癌患 者的 p53 的外显子 5 8 成功地进行了检测 ,并发现了以前文献未报道的新的 179、195、196 213、217、249、254、278、281 和 298突变位点 。A rthe r等 16 在对马兜铃酸和巴尔干肾病 的研究中采用 Amp lich ip p53芯片对其外显子 2 11 进行检测 ,发现 19个碱 基 置 换 , 突 变 有 89%是 发 生 在 A T对 上 。78 %是 A T

22、TA 颠换 。该检测需要昂贵的激光或 CCD 摄 像头扫描仪读取数据 ,计算机图像处理系统进行数据分析 ,疗的敏感性 。p53基因可通过促进凋亡基因 bax和抑制凋亡基因 bc l22的转录 , 以增强肿瘤细胞对放化疗的敏感性 17 。 p53除了具有抑制细胞周期进展 ,促进凋亡多种功能 ,甚至还 可能抑制 血 管 形 成 。而 多 种 抗 癌 化 疗 药 物 都 是 通 过 损 伤 DNA 进而促发凋亡来达到治疗效应的 。故而 p53 功能灭活 不仅提示预后不良 ,还可导致对凋亡的抵抗 18219 。因此 ,对 p53的研究和检测对临床肿瘤个体化治疗具有指导作用 。4. 3 通过对 p53

23、的研究 , 产生肿瘤治疗新思路 在肿瘤 治疗中诱导凋亡 。其方法为 导入野生型 p53,抑制肿瘤增 生 。脂质体转染 p53基因动物模型已构建成功 ,重组腺病毒 介导的 p53基因治疗恶性肿瘤已广泛开展 。 下调突变型p53、bc1 22的活性与表达 ,减弱其对细胞凋亡的抑制 。 抑癌基因引入瘤细胞 ,降低致瘤性 , 使肿瘤细胞逆转为正常细 胞 。 引入某些细胞因子 ,抑制肿瘤恶性表型 ,使细胞丧失 致瘤性 。 应用点突变技术 ,使异常表达癌基因失活或修复 突变基因 。p53除了与肿瘤检测和治疗关系密切外 ,现已发现其与 衰老亦有关系 。p53过度表达会引起细胞衰老 ,但具体分子 信号途径尚不

24、清楚 。相信随着科学技术的发展和对 p53 更 深入的研究 ,人类对 p53会有一个更为全新的认识 。 参考文献 : 1 E liyahu D , Dm icha lovitz D , E liyahu S, et a l. W ild2typ e p53 can inh ib it oncogene2m ed ia ted focu s fo rm a tion J . P roc N a t I A cad Sc i U SA ,1989 , 86 ( 22 ) : 8763 28767. 2 Donehowe r L A , H a rvey M , Slagle B , et a l.

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36、实验动物管理条例 和卫生部 1998 年颁布的医学实验动物管理实施细则 ,本刊对论文中有关实验动物的描述 ,根据实验内容的不同 ,分别要求写清楚以下事项 : ( 1 )品种 、品系及亚系的确切名称 ; ( 2 )遗传背景或其来源 ; ( 3 )微生物检测状况 ; ( 4 )性别 、年龄 、体重 ; ( 5 )质量等级及合格证书编号 ; ( 6 )饲养环境和实验环境 ; ( 7 )健康状况 ; ( 8 )对动物实验的处理方式 。医学实验动物分为四级 :一级为普通级 ;二级为清洁级 ; 三级为无特定病原体 ( SPF )级 ; 四级为无菌级 。部级以上课题及研究生毕业论文等科研实验必须用二级以上的实验动物 。