基因工程和基因组学课件

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1、基因工程和基因组学第九章 基因工程和基因组学 基因工程和基因组学第一节 基因工程 遗传工程广义：细胞工程、染色体工程 细胞器工程、基因工程 狭义：基因工程 一、基因工程概述 基因工程是20世纪70年代初随着DNA重组技术的发展应运而生的一门新技术。 基因工程和基因组学1982年经美国食品及药物管理局批准 ，采用基因工程方法在细菌中表达生 产的人的胰岛素进入市场，成为基因 工程产品直接造福于人类的首例 1985年转基因植物获得成功1996年克隆羊诞生。现在，人类已利用这一技术改造和创 建新的生命形态、生产药品、疫苗、 牛奶和食品，诊断和治疗遗传疾病。 基因工程和基因组学1.1.从细胞和组织中分离

2、从细胞和组织中分离DNADNA。2.2.利用限制性内切核酸酶酶切利用限制性内切核酸酶酶切DNADNA分子，制备分子，制备 DNADNA片段。片段。3.3.将酶切的将酶切的DNADNA片段与载体片段与载体DNADNA连接，构建重组连接，构建重组 DNADNA分子。分子。4.4.将重组将重组DNADNA分子导入宿主细胞后，在细胞内分子导入宿主细胞后，在细胞内 复制，产生克隆复制，产生克隆(clones)(clones)。5.5.重组重组DNADNA能随宿主细胞的分裂而分配到子细能随宿主细胞的分裂而分配到子细 胞，使子代群体细胞均具有重组胞，使子代群体细胞均具有重组DNADNA分子。分子。6.6.能

3、从宿主细胞中回收、纯化和分析克隆的重能从宿主细胞中回收、纯化和分析克隆的重 组组DNADNA分子。分子。7.7.克隆的克隆的DNADNA能转录成能转录成mRNAmRNA、翻译成蛋白质。、翻译成蛋白质。 能分离、鉴定基因产物。能分离、鉴定基因产物。 基因工程和基因组学二、限制性内切核酸酶 限制酶：作用于特定（异）核苷 酸序列的磷酸二脂酶， 是遗传工程的工具酶目前已分离和鉴定出200多种不同的限制酶 基因工程和基因组学限制性酶据其作用特点可分为两类限制性酶据其作用特点可分为两类: :第第类类: : 每隔一段每隔一段DNADNA序列随机切割序列随机切割双链双链DNADNA分子，没有序列特异性。很分子

4、，没有序列特异性。很少在基因工程中应用。少在基因工程中应用。第第类类: : 能识别一段特异的能识别一段特异的DNADNA序列序列，准确地酶切双链，准确地酶切双链DNADNA的特异序列。的特异序列。基因工程中广泛应用。基因工程中广泛应用。 基因工程和基因组学图图 9 91 1 限制性内切酶限制性内切酶EcoRIEcoRI的酶切位点及酶切产物连接的酶切位点及酶切产物连接 GCTTAA53GAATTCCTTAAG5335GAATTCCTTAAG5335AATTC G53AATTCTTAAG53GC53ab回纹序列基因工程和基因组学图图 9 92 2 限制性内切酶限制性内切酶SmaISmaI的识别及酶

5、切位点的识别及酶切位点 CCCGGGGGGCCC5CCC GGGGGG CCC,3,3,5,5,5平齐末端基因工程和基因组学三、载体 经限制性酶酶切的DNA片段或基因，必需与适合的载体DNA连接构成重组DNA后，才可以高效率地进入宿主细胞，并在其中复制、扩增、克隆可作为DNA载体的有质粒、噬菌体、病毒、细菌或酵母菌人工染色体BAC、YAC等 基因工程和基因组学作为载体，需具备作为载体，需具备4 4个条件：个条件：1.1.具复制原点，在宿主细胞中能独立复制具复制原点，在宿主细胞中能独立复制 ，能带动携带的外源，能带动携带的外源DNADNA片段复制。片段复制。2.2.具有多克隆位点，即具有多种限制

6、酶切具有多克隆位点，即具有多种限制酶切 点，每一种酶的切点只有一个，用于克点，每一种酶的切点只有一个，用于克 隆外源隆外源DNADNA片段。片段。3.3.至少具有一个选择标记基因，这个基因至少具有一个选择标记基因，这个基因 是抗菌素的抗性基因或某种酶的基因，是抗菌素的抗性基因或某种酶的基因， 而宿主细胞则没有这种基因，使有或无而宿主细胞则没有这种基因，使有或无 载体的宿主细胞具有易鉴别的表型。载体的宿主细胞具有易鉴别的表型。4.4.易从宿主细胞中回收。易从宿主细胞中回收。 基因工程和基因组学 1 1、细菌质粒：广泛应用于基因工程、细菌质粒：广泛应用于基因工程 pUC182686 bpsLac

7、ZLac IoriAmprEcoR I Sac I Kpn I Sma I BamH IXba I Sal I Pst I Sph I Hind III基因工程和基因组学2、 噬菌体载噬菌体载体体1 1、 噬菌体；噬菌体； 2 2、 噬菌体噬菌体DNADNA； 3 3、 噬菌体噬菌体DNADNA中间中间基因簇；基因簇；4 4、将连接物、将连接物体外包装后感体外包装后感染细菌，制备染细菌，制备基因库基因库（用于（用于基因库构建）基因库构建）246135基因工程和基因组学3 3、柯斯质粒：、柯斯质粒：是利用部分是利用部分噬菌体噬菌体DNADNA与部分细菌质粒与部分细菌质粒DNADNA序列组建而成的

8、，它序列组建而成的，它可接受长达可接受长达50kb50kb的外源的外源DNADNA片段，片段，在克隆在克隆真核生物基因中十分有用真核生物基因中十分有用pWE158048 bpsAmpmcscosSV40 orineoorirrEcoR INot IT3BamH IT7 基因工程和基因组学4 4、穿梭质粒：、穿梭质粒：能在两种不同的生物中能在两种不同的生物中复制的载体。例如既能在原核生物复制的载体。例如既能在原核生物( (如如大肠杆菌大肠杆菌) )中复制，又能在真核细胞中复制，又能在真核细胞( (如酵母如酵母) )中复制的载中复制的载体。体。很多酵母菌的很多酵母菌的穿梭载体，用于功穿梭载体，用于

9、功能互补法分离、鉴能互补法分离、鉴定真定真核生物基因的核生物基因的研究研究 YEp247769 bps2 URA3TcoriAmprr 基因工程和基因组学5 5、细菌人工染色体：、细菌人工染色体：上述的几种载体都上述的几种载体都不能携带大于不能携带大于50kb50kb的外源的外源DNADNA片段，而很片段，而很多真核生物基因长度在多真核生物基因长度在50kb50kb以上。以上。细菌细菌人工染色体人工染色体(BAC)(BAC)载体就是为克隆更大的载体就是为克隆更大的外源外源DNADNA片段而设计构建的片段而设计构建的pBeloBAC117400 bpsoriSrepEparAparBparCCm

10、rSal IcosNloxPNot INot Ilac ZBam HI Hind IIIT7SP6基因工程和基因组学6 6、酵母菌人工染色体：、酵母菌人工染色体：YACYAC可接受可接受100-100-1000 kb1000 kb的外源的外源DNADNA片段，片段，这一特点使这一特点使YACYAC成为人类基因组计划及图位克隆分离基成为人类基因组计划及图位克隆分离基因的重要工具因的重要工具pYAC4CEN4Sup4URA3TELHis3TELoriAmpTRP1/ARS1His3oriAmprEcoR IBamH IBamH I11400 bps 基因工程和基因组学7 7、TiTi质粒及其衍生载

11、体质粒及其衍生载体TiTi质粒包括五个区域，质粒包括五个区域，1. LB1. LB与与RBRB之间的之间的T-DNAT-DNA，这段序列整合到植物基因组中；，这段序列整合到植物基因组中； 2. 2. 质粒转移区质粒转移区(PT)(PT)；3. 3. 冠瘿碱代谢区；冠瘿碱代谢区；4. 4. 复制原点；复制原点；5. 5. 毒性区。毒性区。 基因工程和基因组学T-DNAT-DNA区域内的所有基因与转移无区域内的所有基因与转移无关，所以将致瘤基因全部缺失即卸甲关，所以将致瘤基因全部缺失即卸甲(disarmed)(disarmed)后，将细菌抗生素的抗性后，将细菌抗生素的抗性基因或其它序列插入到这个区

12、域，形基因或其它序列插入到这个区域，形成的成的T-DNAT-DNA仍可将仍可将RBRB至至LBLB内的序列转内的序列转移并整合到植物基因组。移并整合到植物基因组。VirVir区的毒性基因是区的毒性基因是T-DNAT-DNA转移所必转移所必需的，毒性基因可以顺式及反式两种需的，毒性基因可以顺式及反式两种方式控制方式控制T-DNAT-DNA转移。转移。基因工程和基因组学TiTi质粒是约质粒是约200-500kb200-500kb的环状的环状DNADNA分子，分子，很难直接使用，故需对其加以改造，构很难直接使用，故需对其加以改造，构建出建出TiTi质粒的衍生载体系统，广泛用作质粒的衍生载体系统，广泛

13、用作植物基因工程中的载体：植物基因工程中的载体：（1 1）双元载体）双元载体(binary vectors(binary vectors）如如pBin19pBin19载体，具有原核生物的卡那霉载体，具有原核生物的卡那霉素抗性基因素抗性基因(Aph)(Aph)作为细菌选择标记，作为细菌选择标记，真核生物的卡那霉素抗性基因真核生物的卡那霉素抗性基因(nos-(nos-Npt)Npt)作为植物的选择标记，作为植物的选择标记，pUC19pUC19的多的多克隆位点及克隆位点及-互补显色标记互补显色标记（2 2）共整合载体）共整合载体(integrated vectors)(integrated vect

14、ors) 基因工程和基因组学四、基因的分离与鉴定 一个基因就是编码一条多肽链的一个DNA片段，包括启动子、终止子及内含子。 利用DNA重组技术，可从一个含有10万个基因的大基因组中，准确地分离出特异的单个目的基因。分离与鉴定基因是DNA重组中的关键步骤之一。 基因工程和基因组学1、从基因库中分离基因基因库(library)是一组DNA和cDNA序列克隆的集合体。从基因库中分离基因，首先要构建基因库。（1）构建基因库 根据克隆的核酸序列、来源，基因库可分为核基因库、染色体库、cDNA库、线粒体库等 基因工程和基因组学核基因库：核基因库：将某一生物的全部基将某一生物的全部基因组因组DNADNA酶切

15、后与载体连接构建而酶切后与载体连接构建而成的。成的。方法是：尽量提取大分子量的核方法是：尽量提取大分子量的核DNADNA，用限制性酶酶切后，分离选择，用限制性酶酶切后，分离选择具有一定长度具有一定长度( (大于大于15kb)15kb)的的DNADNA片片段，段，与适宜的载体连接构成重组与适宜的载体连接构成重组DNADNA分子分子, ,根据所用的载体，选择根据所用的载体，选择相应的宿主细胞用于克隆。相应的宿主细胞用于克隆。 基因工程和基因组学染色体基因库：染色体基因库：将基因组的一部分将基因组的一部分（如一根染色体）用来构建基因库，（如一根染色体）用来构建基因库，对于选择特异基因及分析染色体结构

16、对于选择特异基因及分析染色体结构和组织十分有价值。和组织十分有价值。例如果蝇例如果蝇X X染色体上的一个片段，具染色体上的一个片段，具有有5050多个多线染色体带，利用微切割多个多线染色体带，利用微切割技术将这一段染色体切割，抽提技术将这一段染色体切割，抽提DNADNA用限制性酶酶切后，克隆到噬菌体上用限制性酶酶切后，克隆到噬菌体上构建成染色体片段基因库。构建成染色体片段基因库。 基因工程和基因组学 cDNA cDNA库库cDNAcDNA库是以库是以mRNAmRNA为模板，经反转为模板，经反转录酶合成互补录酶合成互补DNADNA（cDNA)cDNA)构建构建的基因库。的基因库。 TTTTTTT

17、TTTAAAAAAAAAA53Poly-A tailAAAAATTTTTTTTTTAAAAATTTTTTTTTT3TTTTTAAAAA123456AAAAA基因工程和基因组学图图 9 910 cDNA10 cDNA合成示合成示意图意图1. poly-T1. poly-T引物和引物和poly-A mRNApoly-A mRNA分子分子复性；复性；2. 2. 在在 poly-Tpoly-T引导下引导下开始形成互补开始形成互补DNA(cDNA)DNA(cDNA)；3. 3. 完整第一链完整第一链cDNAcDNA合合成，形成成，形成RNA-RNA-cDNAcDNA杂合双链；杂合双链；4. cDNA4.

18、 cDNA链在链在3 3 端形成端形成发夹结构；发夹结构；5. 5. 发夹结构引导合成发夹结构引导合成第二链第二链( (或用或用RNase HRNase H处理处理) )；6. 6. 用用S S1 1酶将单链降解酶将单链降解得到双链得到双链cDNAcDNA TTTTTTTTTTAAAAAAAAAA53Poly-A tailAAAAATTTTTTTTTTAAAAATTTTTTTTTT3TTTTTAAAAA123456AAAAA基因工程和基因组学 得到的双链得到的双链DNADNA分子经两端补齐后，与带分子经两端补齐后，与带有限制性酶切点的人工接头连接，酶切后有限制性酶切点的人工接头连接，酶切后与载

19、体与载体( (通常是通常是噬菌体噬菌体) )连接，再用类似连接，再用类似核基因库中介绍的方法，制备核基因库中介绍的方法，制备cDNAcDNA库。库。 cDNAcDNA库与核库与核DNADNA库不同，库不同，cDNAcDNA库仅具有用库仅具有用于分离于分离mRNAmRNA的细胞或组织内表达的基因的的细胞或组织内表达的基因的mRNAmRNA序列，所以它仅包括基因组的部分基序列，所以它仅包括基因组的部分基因序列。因序列。 cDNAcDNA库对于研究基因的表达模式、分离库对于研究基因的表达模式、分离某一特定基因是十分有用的。某一特定基因是十分有用的。 基因工程和基因组学（2 2）筛选基因库）筛选基因库

20、大多数方法是利用一段核苷酸序列大多数方法是利用一段核苷酸序列(DNA(DNA，cDNAcDNA或寡核苷酸或寡核苷酸) )作探针作探针(probe)(probe)，用，用放射性同位素或非放射性同位素标记探放射性同位素或非放射性同位素标记探针，也可用抗体作探针，筛选基因库。针，也可用抗体作探针，筛选基因库。如：筛选如：筛选噬菌体构建的库常利用噬菌体构建的库常利用菌斑菌斑杂交法杂交法：将经重组噬菌体将经重组噬菌体( (来自基因库来自基因库) )感染的宿主细菌细胞与培养基混合后，感染的宿主细菌细胞与培养基混合后，倒在培养皿中，培养过夜，形成噬菌斑倒在培养皿中，培养过夜，形成噬菌斑 ( (图图9 911

21、)11)。 基因工程和基因组学 图图 9 911 11 筛选基因库筛选基因库1 1、培养基因库，将噬菌斑、培养基因库，将噬菌斑 转移到硝酸纤维素膜上转移到硝酸纤维素膜上2 2、将膜上的、将膜上的DNADNA变性成变性成 单链单链3 3、用标记的探针与膜一起、用标记的探针与膜一起 保温，进行分子杂交保温，进行分子杂交4 4、将膜洗后，用、将膜洗后，用X-X-光片光片 放射自显影，箭头处表放射自显影，箭头处表 示有示有杂交信号的斑点杂交信号的斑点5 5、挑出阳性克隆，用于进、挑出阳性克隆，用于进 一步分析一步分析12345probe基因工程和基因组学（3 3）阳性克隆的分析与鉴定）阳性克隆的分析与

22、鉴定 从基因库中筛选出的阳性克隆，还需进从基因库中筛选出的阳性克隆，还需进一步分析、鉴定，才能得到目的基因。一步分析、鉴定，才能得到目的基因。 限制性酶图谱限制性酶图谱 采用类似的方法，将不同采用类似的方法，将不同DNADNA用限制酶消化，根据其产生用限制酶消化，根据其产生的多型性即的多型性即RFLPRFLP，来分析，来分析DNADNA水平的变异程度，以水平的变异程度，以RFLPRFLP作为作为分子标记进行基因组图谱分析分子标记进行基因组图谱分析此外，上述经此外，上述经NotNot或或SalSal消消化的片段，可以亚克隆到化的片段，可以亚克隆到pUC18pUC18等质粒上，用于限制性等质粒上，

23、用于限制性图谱分析或序列测定。图谱分析或序列测定。 23kb9.4kb6.6kb4.4kb2.3kb2.0kb0.6kb15kb12.2kb2.8kb10.2kb4.8kb10.2kb2.8kb2.0kbMckNot ISal I Not I + Sal INot ISal I2.8kb7.4kb4.8kbIIINot ISal I2.8kb2.0kb10.2kbAB基因工程和基因组学 核酸分子杂交核酸分子杂交 Southern杂交杂交:a.a.将将DNA用限制性酶酶切；用限制性酶酶切；b.b.将酶切的将酶切的DNA进行进行琼脂糖凝胶电泳；琼脂糖凝胶电泳；c.c.经过变性处理后，将凝胶上经过变

24、性处理后，将凝胶上的的DNA转移到膜上；转移到膜上；d.d.用经过放射性同位素或非用经过放射性同位素或非放射性同位素标记的放射性同位素标记的DNA探针与膜上的探针与膜上的DNA片段片段杂交；杂交；e.e.洗去膜上非特异性结合的探针后，用洗去膜上非特异性结合的探针后，用X-光片放射自显影检测杂交信号；光片放射自显影检测杂交信号；f. 如果转移的膜如果转移的膜上具有与杂交探针上具有与杂交探针相同或部分同源的相同或部分同源的序列，放射自显影序列，放射自显影后就会检测到杂交后就会检测到杂交带信号带信号 weightpaper towelsgel nylone membranewickbuffer基因工

25、程和基因组学NorthernNorthern杂交杂交: :采用与采用与SouthernSouthern杂交相同的原理及程序，不杂交相同的原理及程序，不同的是用同的是用RNARNA进行琼脂糖凝胶电泳。进行琼脂糖凝胶电泳。基本程序基本程序:a.:a.提取总提取总RNARNA，经过琼脂糖凝胶电，经过琼脂糖凝胶电泳泳;b.;b.转移并进行分子杂交转移并进行分子杂交, ,杂交的探针来自杂交的探针来自克隆的基因克隆的基因;c.;c.如果膜上有与探针互补的如果膜上有与探针互补的RNARNA分子，则在分子，则在X-X-光片上可见到杂交信号带。光片上可见到杂交信号带。NorthernNorthern杂交广泛用于

26、研究基因在不同细胞杂交广泛用于研究基因在不同细胞、组织或器官的表达模式，检测、组织或器官的表达模式，检测mRNAmRNA分子量分子量大小以及大小以及mRNAmRNA加工过程中可能存在的不同方加工过程中可能存在的不同方式，定量分析式，定量分析mRNAmRNA等。等。基因工程和基因组学WesternWestern杂交杂交: :用蛋白质电泳后转移到膜上进行分析用蛋白质电泳后转移到膜上进行分析 核酸序列测定核酸序列测定 Sanger(1977)Sanger(1977)发明双脱氧核糖核酸链终发明双脱氧核糖核酸链终止法止法: :将序列反应分为将序列反应分为A A，C C，G G和和T T四管，每管四管，每

27、管中含有变性的中含有变性的DNADNA模板、模板、DNADNA聚合酶、标记的聚合酶、标记的引物、四种脱氧核苷酸，再掺入一种一定比引物、四种脱氧核苷酸，再掺入一种一定比例的双脱氧核苷酸例的双脱氧核苷酸( (如如A A管中，即是腺嘌呤管中，即是腺嘌呤A A双双脱氧核苷酸，以此类推脱氧核苷酸，以此类推) )。在。在DNADNA合成过程中合成过程中，双脱氧核苷酸与互补序列配对被整合到正，双脱氧核苷酸与互补序列配对被整合到正在延长的在延长的DNADNA链中，在不同链中，在不同DNADNA链上随机地整链上随机地整合在不同位置。由于双脱氧核苷酸在第三位合在不同位置。由于双脱氧核苷酸在第三位基因工程和基因组学

28、没有游离的羟基没有游离的羟基(-OH)(-OH)，无，无法再连接另一个核苷酸，导法再连接另一个核苷酸，导致致DNADNA链合成在这里终止。链合成在这里终止。结果每一个反应管中都合成结果每一个反应管中都合成一系列不同大小的一系列不同大小的DNADNA分子分子。将四个反应产物并排点在。将四个反应产物并排点在聚丙烯酰胺凝胶上的四个孔聚丙烯酰胺凝胶上的四个孔中，电泳后每个孔中形成一中，电泳后每个孔中形成一条梯状条梯状DNADNA带，带，从底部往上从底部往上阅读，即是阅读，即是55到到33端的序端的序列列: :CGCTCAGCTGGTGATTGTGTCGCTCAGCTGGTGATTGTGT 基因工程和基

29、因组学 核酸序列分析核酸序列分析 测定的核酸序列是不是所需要的基因，或具有测定的核酸序列是不是所需要的基因，或具有 什么功能，还要用计算机软件或生物学实验进什么功能，还要用计算机软件或生物学实验进 一步分析，才能最后得出结论。一步分析，才能最后得出结论。同源性比较是常用的方法之一。同源性比较是常用的方法之一。可从核酸及蛋可从核酸及蛋 白质两种水平比较基因间的同源性。白质两种水平比较基因间的同源性。首先可将首先可将 测出的核酸序列同杂交的探针序列进行比较，测出的核酸序列同杂交的探针序列进行比较， 或将得到的序列发到或将得到的序列发到BLASTBLAST等等DNA DataDNA Data库的网址

30、库的网址 上比较，很快就可知道测得的序列与所有的已上比较，很快就可知道测得的序列与所有的已 知序列之间的同源程度。知序列之间的同源程度。另一种方法是分析核酸序列的阅读框架。另一种方法是分析核酸序列的阅读框架。一个一个 ORFORF就是一段能编码一条多肽链，并通常具有翻就是一段能编码一条多肽链，并通常具有翻 译起始信号以及一种终止信号的核苷酸序列。译起始信号以及一种终止信号的核苷酸序列。 基因工程和基因组学2 2、聚合酶链式反应、聚合酶链式反应(PCR)(PCR)扩增基因扩增基因 PCRPCR是体外快速扩增是体外快速扩增DNADNA的方法的方法, ,由美国的由美国的Mullis(1986)Mul

31、lis(1986)发明发明, ,可在几小时内使目的基可在几小时内使目的基因片段扩增到数百万个拷贝。因片段扩增到数百万个拷贝。方法方法: :首先根据待扩增基因序列合成两个引首先根据待扩增基因序列合成两个引物，分别与待扩增基因二条链的两端互补，物，分别与待扩增基因二条链的两端互补，从从55到到33的方向向待扩增基因的中间延伸的方向向待扩增基因的中间延伸。在。在DNADNA模板变性成单链后，两个引物分别模板变性成单链后，两个引物分别与单链与单链DNADNA复性，在耐热复性，在耐热DNADNA聚合酶聚合酶(Taq(Taq酶酶) )及四种脱氧核苷酸存在下，由引物引导合成及四种脱氧核苷酸存在下，由引物引导

32、合成DNADNA新链。新链。 基因工程和基因组学PCR反应包括三个步骤：反应包括三个步骤：(1)变性：变性： 94-95，使模板，使模板 DNA DNA的双链变性成单链的双链变性成单链(2)复性：复性：50-70，两个引，两个引 物分别与单链物分别与单链DNADNA互补复互补复 性性(3)延伸：延伸：72，引物引导、，引物引导、 Taq酶、酶、4dNTPs，合成，合成 模板模板DNA的互补的互补链链DNA123123III基因工程和基因组学这三个步骤称为一个循环，这三个步骤称为一个循环，PCRPCR反应常有反应常有 25-3525-35个循环。个循环。一个循环完成后，待扩增一个循环完成后，待扩

33、增 的基因扩增了一倍，新增加的基因又可作的基因扩增了一倍，新增加的基因又可作 为模板用于下一步的扩增，所以，为模板用于下一步的扩增，所以，PCRPCR反应反应 中扩增的基因是成指数级增长的。因此仅中扩增的基因是成指数级增长的。因此仅 用少量的模板用少量的模板DNADNA分子，经分子，经PCRPCR后可以得到后可以得到 大量扩增基因产物。大量扩增基因产物。 PCRPCR扩增的基因经过核酸序列测定分析后，扩增的基因经过核酸序列测定分析后， 可作为基因工程的目的基因。可作为基因工程的目的基因。 根据根据PCRPCR方法及原理，现已发展衍生出很多方法及原理，现已发展衍生出很多 新方法，如新方法，如RA

34、PD, AFLPRAPD, AFLP等，广泛用于基因等，广泛用于基因 分子标记等研究中。分子标记等研究中。 基因工程和基因组学3 3、人工合成基因、人工合成基因 （1）化学合成多个含有80-100个核苷酸的寡核苷酸，每个寡核苷酸之间具有19-24个核苷酸的重叠序列 （2）将各个寡核苷酸等量混合，在DNA聚合酶(或Taq酶)作用下，各寡核苷酸又作为引物合成新链，使单链部分补齐成为双链，再用两个PCR引物，经PCR扩增出DNA片段。 （3）若将两个DNA片段放在一起，经SOE-PCR扩增出完整的基因片段，或直接测序，或克隆到质粒上再测序后加以利用。12345SOESOESOEPCRPCRPCR基因

35、工程和基因组学五、重组DNA分子基因工程和基因组学基因工程和基因组学六、将目的基因导入受体细胞（植物、六、将目的基因导入受体细胞（植物、 动物等），获得表达个动物等），获得表达个 体体转基因个体转基因个体1 1、农杆菌介导法、农杆菌介导法 主要用于双子叶植物主要用于双子叶植物2 2、基因枪法、基因枪法 主要用于单子叶植物主要用于单子叶植物3 3、电击法、聚乙二醇法、电击法、聚乙二醇法、 花粉管通道法、显微花粉管通道法、显微 注射法、超声波法、注射法、超声波法、 激光微束法等激光微束法等基因工程和基因组学七、转基因生物的鉴定七、转基因生物的鉴定 PCR PCR Southern blotting

36、Southern blottingNorthern blottingNorthern blottingWestern blottingWestern blotting特性（表型）鉴定特性（表型）鉴定基因工程和基因组学图图9 918 18 抗除草剂转抗除草剂转 基因植物产生的方法基因植物产生的方法1 1、将抗除草剂基因与、将抗除草剂基因与 CaMV 35SCaMV 35S启动子连接启动子连接 成重组成重组DNADNA分子；分子；2 2、将重组、将重组DNADNA分子与载分子与载 体连接；体连接；3 3、将重组质粒导入土壤、将重组质粒导入土壤 农杆菌；农杆菌；4 4、在土壤农杆菌介导下、在土壤农杆

37、菌介导下 ，部分质粒及目的基，部分质粒及目的基 因整合到植物染色体因整合到植物染色体 上；上；5 5、在选择培养基上选择、在选择培养基上选择 、培养、再生；、培养、再生；6 6、抗除草剂转基因植株、抗除草剂转基因植株123456基因工程和基因组学八、基因工程的应用八、基因工程的应用 1 1、基因工程工业、基因工程工业 生产胰岛素等生产胰岛素等lac ZB chainBBBAAPlac ZA chainABA12345PAB 在细菌中产生胰岛素的方法基因工程和基因组学2 2、转基因植物、转基因植物 抗除草剂、抗虫、抗病、抗逆的优抗除草剂、抗虫、抗病、抗逆的优 良品系或品种，很多良品系或品种，很多

38、已经大面积种植推广。已经大面积种植推广。20022002年年50005000万公顷：万公顷：大豆、玉米、棉花、大豆、玉米、棉花、水稻、马铃薯、番茄、水稻、马铃薯、番茄、小麦等小麦等基因工程和基因组学3 3、转基因动物：羊、牛、转基因动物：羊、牛基因工程和基因组学4 4、遗传疾病诊断、遗传疾病诊断 （1 1） RFLPRFLP法（镰刀性贫血病）法（镰刀性贫血病） 35GTG35GAG123IIIprobeAS基因工程和基因组学（2 2）等位基因特异寡核苷酸法）等位基因特异寡核苷酸法当已知突变基因当已知突变基因的核苷酸序列时，的核苷酸序列时，就可以用人工合就可以用人工合成的寡核苷酸进成的寡核苷酸进

39、行行PCRPCR反应，将反应，将PCRPCR产物用作点产物用作点杂交分析，鉴定杂交分析，鉴定基因型基因型 AAASSSSSASAAASO: 5-CTCCTGAGGAGAAGTCTGC-3ASO: 5-CTCCTGTGGAGAAGTCTGC-353probeAB基因工程和基因组学5 5、基因治疗、基因治疗 利用基因工程技术，将特异基因导入并利用基因工程技术，将特异基因导入并整合到具有遗传缺陷的患者的基因组中整合到具有遗传缺陷的患者的基因组中，以治疗遗传疾病，以治疗遗传疾病 gagpolenvSV40hADALTR5,LTR5,neorLTR3,LTR3,AB基因治疗的载体和重组基因治疗的载体和重

40、组DNADNA分子分子 基因工程和基因组学6 6、DNADNA芯片芯片 DNADNA芯片芯片(DNA chips)(DNA chips)是将核酸分子杂交是将核酸分子杂交的原理和方法的原理和方法, ,与半导体技术结合而发与半导体技术结合而发展形成的一门新技术展形成的一门新技术 labeled DNA123hybridization signal基因工程和基因组学九、安全问题九、安全问题 1 1、转基因植物成为杂草、转基因植物成为杂草2 2、导致新的病虫害，威胁生物、导致新的病虫害，威胁生物 多样性多样性3 3、食品安全性、食品安全性基因工程和基因组学第二节 基因组学 基因组学基因组学(genom

41、ics)(genomics)是遗传学研究进入分子是遗传学研究进入分子水平后发展起来的一个分支，主要研究生物水平后发展起来的一个分支，主要研究生物体全基因组体全基因组(genome)(genome)的分子特征。的分子特征。基因组学强调的是以基因组为单位，而不是基因组学强调的是以基因组为单位，而不是以单个基因为单位作为研究对象，因此，基以单个基因为单位作为研究对象，因此，基因组学的研究目标是认识基因组的结构、功因组学的研究目标是认识基因组的结构、功能及进化，弄清基因组包含的遗传物质的全能及进化，弄清基因组包含的遗传物质的全部信息及相互关系，为最终充分合理地利用部信息及相互关系，为最终充分合理地利用

42、各种有效资源，为预防和治疗人类遗传疾病各种有效资源，为预防和治疗人类遗传疾病提供科学依据。提供科学依据。 基因工程和基因组学基因组学的重要组成部分是基因基因组学的重要组成部分是基因组计划，组计划，如人类、水稻基因组计如人类、水稻基因组计划，划，大体可分为：大体可分为：1 1、构建基因组的遗传图谱、构建基因组的遗传图谱2 2、构建基因组的物理图谱、构建基因组的物理图谱3 3、测定基因组、测定基因组DNADNA的全部序列的全部序列4 4、构建基因组的转录本图谱、构建基因组的转录本图谱5 5、分析基因组的功能、分析基因组的功能基因工程和基因组学 基因组计划研究开始于基因组计划研究开始于1990199

43、0年，美国国年，美国国立卫生研究院立卫生研究院( (NIH)NIH)和能源部和能源部( (DOE)DOE)联合启动联合启动了被誉为了被誉为“人体阿波罗计划人体阿波罗计划”的的“人类基因人类基因组计划组计划”(”(human genome projecthuman genome project，HGP) HGP) 。 在美国提出人类基因组计划后，英、法在美国提出人类基因组计划后，英、法、日、前苏联、中等，也相继启动了类似的、日、前苏联、中等，也相继启动了类似的研究项目。研究项目。 20002000年年6 6月月2626日，各国科学家公布了人日，各国科学家公布了人类基因组工作草图，类基因组工作草图

44、，20012001年年8 8月月2626日，人类日，人类基因组计划中国部分测序项目汇报及联合验基因组计划中国部分测序项目汇报及联合验收会在京召开，标志人类基因组收会在京召开，标志人类基因组“中国卷中国卷”通过验收通过验收 基因工程和基因组学 19921992年年8 8月，中国根据国情正式月，中国根据国情正式宣布实施自己的宣布实施自己的“水稻基因组研究水稻基因组研究计划计划”，已完成水稻基因组物理图，已完成水稻基因组物理图谱的构建谱的构建 。 20022002年年4 4月月5 5日，日，ScienceScience以以1414页的篇幅刊登和宣布中国科学家页的篇幅刊登和宣布中国科学家独立绘制完成的

45、水稻基因组草图序独立绘制完成的水稻基因组草图序列（列（4.64.6亿）亿）基因工程和基因组学一、基因组图谱的构建 在进行大规模序列测定之前，构建基因在进行大规模序列测定之前，构建基因组图谱是测定大基因组全部核苷酸序列组图谱是测定大基因组全部核苷酸序列的重要一环。基因组图谱可作为序列测的重要一环。基因组图谱可作为序列测定中制定测序方案的依据，以便先重后定中制定测序方案的依据，以便先重后轻地分析基因，锚定测知的核酸序列在轻地分析基因，锚定测知的核酸序列在染色体上的位置。染色体上的位置。因此，在人类基因组因此，在人类基因组计划实施过程中，首先用了六年时间构计划实施过程中，首先用了六年时间构建高密度的

46、基因组图谱，然后才进入测建高密度的基因组图谱，然后才进入测序工作。序工作。 基因工程和基因组学1、遗传图谱遗传图谱 （1 1）图谱标记）图谱标记 图谱构建中需要可以鉴别的标记图谱构建中需要可以鉴别的标记(marker)(marker)，在构建遗传图谱中，可用基，在构建遗传图谱中，可用基因和因和DNADNA作为标记。作为标记。 基因标记：基因标记：用基因作为标记，分析各基用基因作为标记，分析各基因间的连锁关系及遗传距离，绘制出连因间的连锁关系及遗传距离，绘制出连锁遗传图谱锁遗传图谱DNADNA标记：标记：限制性内切酶多型性限制性内切酶多型性(RFLP)(RFLP)、简单序列长度多型性、简单序列长

47、度多型性(SSLP)(SSLP)、单核苷、单核苷酸多型性酸多型性(SNPs)(SNPs) 基因工程和基因组学（2 2）遗传图谱的构建）遗传图谱的构建 人类基因组遗传图谱的构建：人类基因组遗传图谱的构建： 人类的遗传图谱是利用家系分析法，在对人类的遗传图谱是利用家系分析法，在对8 8个家系的个家系的134134个成员的分析中，主要根据个成员的分析中，主要根据52645264个个STRSTR标记绘制而成的。利用这些家系标记绘制而成的。利用这些家系的资料绘制第的资料绘制第1 1至至2222号染色体图谱。对于号染色体图谱。对于X X染染色体图谱，还利用了来自另外色体图谱，还利用了来自另外1212个家系

48、，个家系，170170个成员的资料绘制而成。个成员的资料绘制而成。 将将52645264个标记定位在个标记定位在23352335个位点，据此个位点，据此构建的人类基因组遗传图谱的密度为每个标构建的人类基因组遗传图谱的密度为每个标记记599 Kb599 Kb。基因工程和基因组学植物基因组遗传图谱的构建植物基因组遗传图谱的构建：选择亲本选择亲本 产生构图群体产生构图群体 遗传标记的染色体定位遗传标记的染色体定位标记间的连锁分析标记间的连锁分析 P1 P2P3 F1回回交交群群体体单单倍倍体体DH三三交交群群体体F2RIL连连续续回回交交连连续续自自交交染染色色体体加加倍倍组组织织培培养养基因工程和

49、基因组学2、物理图谱物理图谱 由于遗传图谱的分辨率有限、精确性不由于遗传图谱的分辨率有限、精确性不高，所以还要构建物理图谱。高，所以还要构建物理图谱。 基因组物理图谱的构建主要有三种途径：基因组物理图谱的构建主要有三种途径：限制性酶图谱限制性酶图谱荧光原位杂交技术荧光原位杂交技术(FISH) (FISH) 序列标签位点序列标签位点(STS)(STS) 如表达的序列标签如表达的序列标签(EST)(EST)， 来自来自cDNAcDNA 基因工程和基因组学图图 9 927 27 酵母菌第酵母菌第IIIIII染色体遗传图谱染色体遗传图谱(A)(A)与物理图谱与物理图谱(B)(B)的的比较比较 chaI

50、glkIhis4leu2SUP53CentromerepgkIpet18cryIMATthr4SUP61ABP1chaIglkIhis4SUP53leu2CentromerepgkIpet18cryIMATthr4SUP61ABP1AB基因工程和基因组学二、基因组图谱的应用：二、基因组图谱的应用：1 1、基因组序列测定、基因组序列测定2 2、基因定位、基因定位 3 3、基因组比较分析、基因组比较分析4 4、分子标记辅助选择、分子标记辅助选择5 5、基因的克隆与分离、基因的克隆与分离 基因工程和基因组学三、后基因组学三、后基因组学 后基因组学后基因组学(post-genomics)(post-g

51、enomics)是在完成是在完成基因组图谱构建以及全部序列测定的基因组图谱构建以及全部序列测定的基础上，进一步研究全基因组的基因基础上，进一步研究全基因组的基因功能、基因之间的相互关系和调控机功能、基因之间的相互关系和调控机制为主要内容的学科。制为主要内容的学科。后基因组学主要利用后基因组学主要利用DNADNA微列阵技术、微列阵技术、蛋白质组学、酵母菌双杂交系统以及蛋白质组学、酵母菌双杂交系统以及生物信息学等技术相结合，对已知的生物信息学等技术相结合，对已知的基因组序列进行研究。基因组序列进行研究。 基因工程和基因组学1 1、DNADNA微列阵微列阵 DNADNA微列阵微列阵(DNA micr

52、oarrays)(DNA microarrays)就是就是利用利用DNADNA芯片技术，同时进行大量分子芯片技术，同时进行大量分子杂交，以分析比较不同组织或器官的杂交，以分析比较不同组织或器官的基因表达水平，筛选突变基因，从核基因表达水平，筛选突变基因，从核酸水平分析基因表达模式。酸水平分析基因表达模式。 2 2、蛋白质组学、蛋白质组学 蛋白质组学蛋白质组学(proteomics)(proteomics)是从蛋白是从蛋白质水平来研究基因组的基因表达，分质水平来研究基因组的基因表达，分析基因组的蛋白质类型、数量、空间析基因组的蛋白质类型、数量、空间结构变异以及相互作用的机制。结构变异以及相互作用

53、的机制。基因工程和基因组学3 3、酵母菌双杂交系统、酵母菌双杂交系统 酵母菌双杂交系统酵母菌双杂交系统(two hybrid-(two hybrid-systems)systems)是利用在酵母菌的同一个细胞中是利用在酵母菌的同一个细胞中共同表达不同蛋白质，以鉴定蛋白质之间共同表达不同蛋白质，以鉴定蛋白质之间互作的一种分析方法。互作的一种分析方法。 4 4、生物信息学、生物信息学 生物信息学生物信息学(bioinformatics)(bioinformatics)是利用是利用计算机贮存原始资料，分析生物信息，将计算机贮存原始资料，分析生物信息，将DNADNA芯片以及蛋白质双向电泳结果转变成为芯

54、片以及蛋白质双向电泳结果转变成为可读的遗传学信息的学科。生物信息学是可读的遗传学信息的学科。生物信息学是将现代生物技术与计算机科学结合，收集将现代生物技术与计算机科学结合，收集、加工和处理生物资料。、加工和处理生物资料。 基因工程和基因组学图图 8 8 29 29 酵母菌双杂交系统酵母菌双杂交系统A A、双杂交系统组成、双杂交系统组成 B B、将、将A A中的构建体混合，转化酵母菌中的构建体混合，转化酵母菌基因工程和基因组学自从自从19961996年酵母菌基因组全序列测年酵母菌基因组全序列测定以来，在定以来，在4 4年多时间里，全世界年多时间里，全世界已有已有10001000多个实验室，多个实验室，50005000多名多名科学家从事酵母菌后基因组学的研科学家从事酵母菌后基因组学的研究，共发表论文究，共发表论文70007000多篇，鉴定多篇，鉴定10601060个新基因的功能，但仍然还有个新基因的功能，但仍然还有约约16001600个阅读框架的功能不清楚。个阅读框架的功能不清楚。这些结果充分说明后基因组学研究这些结果充分说明后基因组学研究的复杂性。的复杂性。 基因工程和基因组学酵母酵母 1.5 107拟南芥拟南芥 1.0 107水稻水稻 4.3 108人类人类 3.3 109玉米玉米 5.4 109 基因工程和基因组学