分子生物学课件4CH4.Gene Transcription and

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1、CH4.Gene Transcription and Posttranscriptional processes GENETIC INFORMATION 1. REPLICATION(DNA SYNTHESIS) 2. TRANSCRIPTION(RNA SYNTHESIS) 3. TRANSLATION(PROTEIN SYNTHESIS)DNARNAPROTEINRNA polynucleotide chain 2 -OH makes 3, 5 phosphodiester bond unstableDNA polynucleotide chain基因转录的特点：基因转录的特点： 1.基因

2、转录是基因表达的第一步，也是基因表基因转录是基因表达的第一步，也是基因表达调控中最重要的环节；达调控中最重要的环节； 2.部分遗传信息的传递，只有部分作为模板，部分遗传信息的传递，只有部分作为模板，基因的转录有时间和空间的差异；基因的转录有时间和空间的差异； 3.转录中存在链的选择、起点和终点的选择。转录中存在链的选择、起点和终点的选择。4.基因转录只利用基因转录只利用DNA双链中的一条链作为模双链中的一条链作为模板，而另一条链不参与合成过程。模板链为无意板，而另一条链不参与合成过程。模板链为无意义链，互补链为有意义链（编码链）。义链，互补链为有意义链（编码链）。有意义链有意义链无意义链无意义

3、链只针对已确定的某一基因而言只针对已确定的某一基因而言原核生物的基因转录原核生物的基因转录 1.转录调控因子转录调控因子 基因转录的控制关键基因转录的控制关键起始控制起始控制 控制转录起始的因素控制转录起始的因素 ： 起始调控序列（顺式调控元件）起始调控序列（顺式调控元件）启动子启动子 转录因子（反式调控元件）转录因子（反式调控元件）RNA聚合酶聚合酶顺式调控元件顺式调控元件cis acting elements 位于基因周围能与特异转录因子结合而影响位于基因周围能与特异转录因子结合而影响转录的转录的DNA序列，包括启动子、增强子等序列，包括启动子、增强子等反式调控元件反式调控元件trans

4、acting factors与与DNA上特异序列结合的蛋白因子，对转录上特异序列结合的蛋白因子，对转录起调控作用。如聚合酶起调控作用。如聚合酶RNA聚合酶聚合酶 E.coli中由一种中由一种RNA聚合酶催化聚合酶催化所有所有RNA的合的合成（成（mRNA、t RNA 、rRNA和其它小分子和其它小分子RNA ）E.coli的的RNA聚合酶全酶由核心酶聚合酶全酶由核心酶( 2、 、 、 亚基亚基)和和亚基组成；亚基组成； 核心酶的功能：转录合成核心酶的功能：转录合成RNA，与，与DNA结合结合（非特异性的、松弛的），在（非特异性的、松弛的），在 的帮助下识别起的帮助下识别起始序列。始序列。 E.

5、coli聚合酶亚基聚合酶亚基Prokaryotic RNA polymerase structureRNA polymerase of E. coli is a multisubunit proteinSubunitNumberRole 2uncertain 1forms phosphodiester bonds 1binds DNA template 1recognizes promoter and facilitates initiation 2 2 2 2 + holoenzyme core polymerase sigma factor 亚基亚基催化磷酸二酯键的合成催化磷酸二酯键的合成

6、 利福平利福平rifampicin和利福酶素和利福酶素rifamycin 能结合在能结合在 亚基上亚基上抑制抑制RNA链的合成的链的合成的 起始而不抑制链的延长起始而不抑制链的延长， 阻止第一个磷阻止第一个磷 酸二酯键的合成。酸二酯键的合成。 链酶溶菌素，结合在链酶溶菌素，结合在 亚基上，抑制链亚基上，抑制链 的延伸。的延伸。 亚基亚基碱性极强，与碱性极强，与DNA模板结合的亚基；模板结合的亚基；RNA转录的抑制剂转录的抑制剂 亚基亚基二聚体，可能与启动子的识别有关；二聚体，可能与启动子的识别有关； 亚基亚基不能独立存在，本身无催化活性，当不能独立存在，本身无催化活性，当与核心酶结合，引起与核

7、心酶结合，引起 2 2构象变化，改变核心构象变化，改变核心酶与酶与DNA结合的亲合性和特异性。结合的亲合性和特异性。（一旦起始识别后，（一旦起始识别后， 因子脱落，核心酶才能因子脱落，核心酶才能延伸）延伸）E.coli中有多种不同中有多种不同 亚基；亚基； 亚基在决定亚基在决定RNA聚聚合酶起始转录中起关键作用合酶起始转录中起关键作用 由含由含 70RNA多聚酶全酶识别的典型大肠杆菌启动子多聚酶全酶识别的典型大肠杆菌启动子 此外，此外，RNA聚合酶可能还有解旋酶和重新聚合酶可能还有解旋酶和重新螺旋化及校正的功能。螺旋化及校正的功能。 全功能酶（识别、解旋、螺旋、聚全功能酶（识别、解旋、螺旋、聚

8、合延伸、校正等功能）合延伸、校正等功能）2. 转录调控序列转录调控序列 启动子启动子promoter 操纵基因操纵基因 operator 启动子：启动子：RNA聚合酶全酶以很高的亲合性结合聚合酶全酶以很高的亲合性结合在基因调控区的特定位点。在基因调控区的特定位点。原核生物启动子序列原核生物启动子序列-10区和区和-35区区 必需序列必需序列启动子结构Promoter structure in prokaryotes5PuPuPuPuPuPuPuPuAUGPromoter+1+20-7-12-31-365mRNAmRNATTGACAAACTGT-30 regionTATAATATATTA-10

9、region84 7953 45%82T TG64AC A79T44T96%T95A59A51Aconsensus sequences-30-10transcription start sitePribnow box+1-10区：在区：在-6-13bp之间，共同序列为之间，共同序列为 TATAAT，又称，又称pribnow框，酶在框，酶在 此处与此处与DNA结合成稳定的复合物，在结合成稳定的复合物，在 转录方向上解开双链形成开放型起始转录方向上解开双链形成开放型起始 结构。结构。-35区：共同序列为区：共同序列为TTGACA，是，是RNA聚合酶聚合酶 起始识别区，这一识别过程与起始识别区，这一

10、识别过程与 因子有因子有关。关。 -10区和区和-35区相距约区相距约20bp，大致是双螺，大致是双螺旋绕两周的长度，两个结合区在分子的同一侧旋绕两周的长度，两个结合区在分子的同一侧面，能感觉到沟底碱基的特异形态。面，能感觉到沟底碱基的特异形态。上节回顾：上节回顾： 1. DNA损伤修复损伤修复 2. 基因转录基本概念基因转录基本概念, 特点特点 3. 原核生物原核生物RNA聚合酶聚合酶3.转录过程转录过程起始：起始：RNA聚合酶全酶识别聚合酶全酶识别-35区，再识别区，再识别-10区，区，形成形成封闭型起始复合物封闭型起始复合物转录起始位点处转录起始位点处DNA解链，形成解链，形成开放型起始

11、复合物开放型起始复合物第一个核苷酸结合上去（多数是第一个核苷酸结合上去（多数是G/A、C）合成合成7-8个核苷酸，起始过程完成个核苷酸，起始过程完成RNA polymerase holoenzyme (+ factor) closed promoter complex (moderately stable) the sigma subunit binds to the -10 region once initiation takes place, RNA polymerase does not need very high affinity for the promoter sigma fac

12、tor dissociates from the core polymerase after a few elongation reactions elongation takes place with the core RNA polymerase open promoter complex (highly stable) the holoenzyme has very high affinity for promoter regions because of sigma factor sigma can re-bind other core enzymesThe sigma cycle T

13、ranscriptionRNA polymeraseclosed promoter complexopen promoter complexinitiationelongationterminationRNA product延伸：延伸： 起始结束后，起始结束后， 因子脱落，由核心酶沿模板因子脱落，由核心酶沿模板链移动，完成延伸过程。链移动，完成延伸过程。 核心酶在核心酶在DNA链上覆盖大约链上覆盖大约80bp，其中解，其中解链部分只有链部分只有18bp，RNA-DNA杂交链长度约杂交链长度约12bp，当酶分子离开这一区域向前移动，当酶分子离开这一区域向前移动，DNA又形成双链，又形成双链，RN

14、A游离出来。游离出来。RNA转录延伸期转录泡模型转录延伸期转录泡模型终止：终止：终止序列终止序列DNA上转录到一定位置后，转录停上转录到一定位置后，转录停 止，又叫终止子。止，又叫终止子。 特征：使转录产物产生一个颈环（发夹结构），特征：使转录产物产生一个颈环（发夹结构），富含嘌呤，使富含嘌呤，使RNA聚合酶延伸速度减慢，甚至聚合酶延伸速度减慢，甚至停止。停止。终止子结构1.不需要不需要 因子的转录终止因子的转录终止强终止子强终止子 特点：特点：DNA序列有双重对称，形成末端发序列有双重对称，形成末端发 夹结构，模板夹结构，模板DNA上有一串上有一串A， RNA3端有端有UUUU，使新合成的，

15、使新合成的 RNA脱落。脱落。 不依赖Rho因子的转录终止2.需要需要 因子的转录终止因子的转录终止 终止子后无连续的终止子后无连续的A， 在在 因子作用下，因子作用下，ATP酶水解，释放能量，酶水解，释放能量，使新生使新生RNA与模板脱落。与模板脱落。依赖Rho因子的转录终止终止子：提供转录终止信号的一段终止子：提供转录终止信号的一段 DNA 序列。序列。 终止因子：协助终止因子：协助 RNA 聚合酶识别聚合酶识别 终止子的蛋白质辅助因子。终止子的蛋白质辅助因子。 转录调控转录调控 原核生物基因表达调控模型原核生物基因表达调控模型操纵子模型操纵子模型操纵子操纵子operon：由几个相关的结构

16、基因及其：由几个相关的结构基因及其控制区组成，是基因表达的协同单位。控制区组成，是基因表达的协同单位。 操纵子的两个类型：操纵子的两个类型：诱导型诱导型 阻遏型阻遏型诱导型：正常情况下基因不表达或表达水平低，诱导型：正常情况下基因不表达或表达水平低， 在环境改变或诱导物存在时，才开放在环境改变或诱导物存在时，才开放 转录。（乳糖操纵子、半乳糖操纵子）转录。（乳糖操纵子、半乳糖操纵子）阻遏型：正常情况下开放，当阻遏物出现时操阻遏型：正常情况下开放，当阻遏物出现时操 纵子关闭。（色氨酸操纵子、组氨酸纵子关闭。（色氨酸操纵子、组氨酸 操纵子操纵子组氨酸抑制了组氨酸操纵子组氨酸抑制了组氨酸操纵子 的表

17、达，避免把原料用于不必要的合的表达，避免把原料用于不必要的合 成。）成。）大肠杆菌乳糖操纵子大肠杆菌乳糖操纵子 由三个结构基因和一个调节基因构成。由三个结构基因和一个调节基因构成。 Z基因基因 编码编码 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶 Y基因基因 编码编码 -半乳糖苷透性酶半乳糖苷透性酶 A A基因基因 编码编码 -半乳糖苷乙酰化酶半乳糖苷乙酰化酶 调节基因调节基因I I 编码编码 阻遏蛋白阻遏蛋白操纵基因操纵基因lac IPOpromoter - operatorlac repressorlac Zlac Ylac AThe lactose operon in E. coli -galactosid

18、asepermeaseacetylaseLACTOSE GLUCOSE + GALACTOSE -galactosidasethe function of the lactose (lac) operon is to produce the enzymes required to metabolize lactose for energy when it is required by the cell promoter binds CAP and RNA polymerase operator binds the lac repressor诱导表达：诱导表达： 当培养基中无乳糖及其它诱导物时，

19、抑制基当培养基中无乳糖及其它诱导物时，抑制基因表达产生阻遏蛋白，与操纵基因结合，阻止结因表达产生阻遏蛋白，与操纵基因结合，阻止结合在启动子上的合在启动子上的RNA聚合酶向前移动，转录不聚合酶向前移动，转录不能进行；能进行； 当培养基中有乳糖及其它诱导物时，诱导物当培养基中有乳糖及其它诱导物时，诱导物与阻遏蛋白结合而不能与操纵基因结合，基因转与阻遏蛋白结合而不能与操纵基因结合，基因转录。录。葡萄糖效应：当细菌在含有葡萄糖和乳糖葡萄糖效应：当细菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基中生长时，通常优先利用葡萄糖而不的培养基中生长时，通常优先利用葡萄糖而不利用乳糖；只有当葡萄糖耗尽后，经一段停滞利用乳糖；只有当

20、葡萄糖耗尽后，经一段停滞期，在乳糖诱导下期，在乳糖诱导下-半乳糖苷酶开始合成，细半乳糖苷酶开始合成，细菌才能充分利用乳糖的现象。菌才能充分利用乳糖的现象。 大肠杆菌生长在含葡萄糖的培养基上时，大肠杆菌生长在含葡萄糖的培养基上时， -半乳糖苷酶等分解代谢的活性很低，研究发半乳糖苷酶等分解代谢的活性很低，研究发现现cAMPcAMP能解除葡萄糖的阻遏作用。能解除葡萄糖的阻遏作用。CAP-CAP-环腺苷酸受体蛋白环腺苷酸受体蛋白 cAMPcAMP- -环腺苷酸环化酶环腺苷酸环化酶当当CAPCAP与与cAMPcAMP结合后酶被活化，作用于启动子结合后酶被活化，作用于启动子前的前的CAPCAP结合位点上，

21、使结合位点上，使RNARNA聚合酶容易结合到聚合酶容易结合到启动子上，促进转录的进行。启动子上，促进转录的进行。Regulation of the lactose operon - negative controllac IPOpromoter - operatorlac repressorlac IPlac Zlac Ylac A the repressor tetramer binds to the operator and prevents RNA polymerase from binding to the promoterlac Zlac Ylac ANO TRANSCRIPTION

22、RNA pol RNA polymerase is blocked from the promoterNO TRANSCRIPTION when lactose becomes available, it is taken up by the cell allolactose (an intermediate in the hydrolysis of lactose) is produced one molecule of allolactose binds to each of the repressor subunits binding of allolactose results in

23、a conformational change in the repressor the conformational change results in decreased affinity of the repressor for the operator and dissociation of the repressor from the DNAAlleviation of negative control - action of the inducer of the lac operonallolactoselac IPlac Zlac Ylac Alac IPlac Zlac Yla

24、c A IPTG (isopropyl thiogalactoside) is also used as a (non-physiological) inducerlac IPlac Zlac Ylac ANO TRANSCRIPTIONRNA polO repressor (with bound allolactose) dissociates from the operator negative control (repression) is alleviated, however. RNA polymerase cannot form a stable complex with the

25、promoterlac IPOlac Zlac Ylac ARegulation of the lactose operon - positive control in the presence of both lactose and glucose it is not necessary for the cell to metabolize lactose for energy in the absence of glucose and in the presence of lactose it becomes advantageous to make use of the availabl

26、e lactose for energy in the absence of glucose cells synthesize cyclic AMP (cAMP) cAMP1 serves as a positive regulator of catabolite operons (lac operon) cAMP binds the dimeric cAMP binding protein (CAP)2 binding of cAMP increases the affinity of CAP for the promoter binding of CAP to the promoter f

27、acilitates the binding of RNA polymerase 1 cAMP = 3, 5 cyclic adenosine monophosphateactive CAPinactive CAPcAMP+NO TRANSCRIPTION 2 also termed catabolite activator proteinlac Ilac repressorlac Zlac Ylac A -galactosidasepermeaseacetylaseRNA polTRANSCRIPTION AND TRANSLATION OCCURinactive repressorActi

28、vation of lac operon transcription the function of the lactose (lac) operon is to produce the enzymes required to metabolize lactose for energy when it is required by the cell半乳糖苷酶基因表达的条件：半乳糖苷酶基因表达的条件： CAP结合位点结合位点 CAP与与cAMP结合，使结合，使 RNA聚合酶识别聚合酶识别-35和和-10区；区； 启动子识别启动子识别 RNA聚合酶识别启动子序列；聚合酶识别启动子序列； 操纵基因操

29、纵基因 阻遏蛋白结合乳糖或类似物阻遏蛋白结合乳糖或类似物结构基因转录的调控方式：结构基因转录的调控方式： 负调控负调控没有调节蛋白时操纵子内结构基因没有调节蛋白时操纵子内结构基因表达，加入调节蛋白后操纵子内结构基因的活性表达，加入调节蛋白后操纵子内结构基因的活性被关闭。（阻遏蛋白对乳糖操纵子的负调控）被关闭。（阻遏蛋白对乳糖操纵子的负调控） 正调控正调控没有调节蛋白时结构基因的活性没有调节蛋白时结构基因的活性关闭，加入调节蛋白后结构基因的活性被开启。关闭，加入调节蛋白后结构基因的活性被开启。（cAMP-CAP是一个正调节因子）是一个正调节因子）调控序列：调控序列： 转录调控因子：转录调控因子：

30、启动子：启动子：-10、-35区区 RNA聚合酶（聚合酶（ ）操纵基因操纵基因 阻遏蛋白阻遏蛋白CAP结合位点结合位点 CAP+cAMP 终止序列终止序列 因子因子真核生物基因转录真核生物基因转录特点：特点： 1.转录启动子结构复杂，不同类型的转录启动子结构复杂，不同类型的RNA有有不同的启动序列；不同的启动序列； 2.多种多种RNA聚合酶转录不同的聚合酶转录不同的RNA产物；产物； 3.多个调节因子参与转录调节；多个调节因子参与转录调节； 4.转录和翻译在时间和空间上分隔，转录后存转录和翻译在时间和空间上分隔，转录后存在广泛的加工。在广泛的加工。RNA聚合酶聚合酶.种类种类 真核生物中有三种

31、真核生物中有三种RNA聚合酶聚合酶 (RNA聚合酶聚合酶I、II、III), 每一种每一种RNA聚合酶转录不同的聚合酶转录不同的RNA产物。产物。酶酶酶活产 物RNA聚合酶I 50-70%rRANRNA聚合酶II20-40%hnRNA（mRNA的前体）RNA聚合酶III 10%tRNA和snRNA真核生物三种RNA聚合酶的比较.聚合酶没有全能性，必需有转录因子聚合酶没有全能性，必需有转录因子参与才有活性。参与才有活性。.特异性特异性不同的聚合酶所识别的启动子结构不不同的聚合酶所识别的启动子结构不同。同。 RNA聚合酶聚合酶 I 类型类型I RNA聚合酶聚合酶 II 类型类型II RNA聚合酶聚

32、合酶 III 类型类型III RNA聚合酶聚合酶I：由个亚基组成，其中最大的亚基由个亚基组成，其中最大的亚基约个氨基酸组成，具有结合模板约个氨基酸组成，具有结合模板链和转录延伸的作用，位于核仁，转录链和转录延伸的作用，位于核仁，转录, 对抗生素鹅膏蕈碱不敏感。对抗生素鹅膏蕈碱不敏感。RNA聚合酶聚合酶II：约，个亚基，约，个亚基，对低浓度的鹅膏蕈碱敏感。对低浓度的鹅膏蕈碱敏感。 RNA聚合酶聚合酶III：含锌蛋白质，由种亚基组成。含锌蛋白质，由种亚基组成。真核生物基因转录调控区真核生物基因转录调控区 1.类型类型 I 基因的调控区基因的调控区 RNA聚合酶聚合酶 I 作用的区域，产物作用的区域

33、，产物rRNA RNA聚合酶聚合酶 I 只合成一种产物（只合成一种产物（40sRNA未未经加工的经加工的rRNA初始转录产物），只识别一种启初始转录产物），只识别一种启动子区和一种终止信号，能有效的转录有活性的动子区和一种终止信号，能有效的转录有活性的rRNA基因，其活性是三种基因，其活性是三种RNA聚合酶中最高的。聚合酶中最高的。 rDNA40sRNA18s、5.8、28srRNA加工加工RNA pol I转录转录 研究发现，不同真核生物的研究发现，不同真核生物的rRNA转录起始转录起始位点邻近的序列完全不同位点邻近的序列完全不同RNA聚合酶聚合酶 I 启启动子区有较大变异。动子区有较大变异

34、。 rRNA基因具有转录的种属特异性。基因具有转录的种属特异性。rRNA基因的特点：基因的特点： 以基因家族、基因簇的形式串联排列，外显子以基因家族、基因簇的形式串联排列，外显子较为保守，内含子的长度和序列有较大差异。较为保守，内含子的长度和序列有较大差异。 18S、28S, 5.8S rRNA拷贝区拷贝区 ETS区区 ITS区区 NTS（IGS）启动子区启动子区rRNA前体前体NTS区的作用：转录起始识别区的作用：转录起始识别 含启动子序列含启动子序列核心元件核心元件 人位于人位于-45 +20 小鼠小鼠-39 +9 3端含增强子端含增强子 -150 -170bp间间 上游调控区（上游调控区

35、（UCE） 5端转录终止序列端转录终止序列包含了起始位点，决定转录起始包含了起始位点，决定转录起始明显增强核心启动子的转录活性，明显增强核心启动子的转录活性，决定转录强弱决定转录强弱非洲爪蟾非转录区的结构非洲爪蟾非转录区的结构类型类型II基因调控区：由三部分组成基因调控区：由三部分组成 核心元件区：核心元件区：决定是否转录决定是否转录 由由-30bp左右的左右的TATAbox和起始位点（和起始位点（INR）组）组 成成上游调控区上游调控区UPE： 具多种调控元件具多种调控元件 CCAAT框、框、GC框、框、GCCACACCC框等，含其中一种或多种，决定转框等，含其中一种或多种，决定转录强弱（转

36、录活化和转录起始频率），启动子的录强弱（转录活化和转录起始频率），启动子的强弱起决于强弱起决于UPE的类型。的类型。决定转录起始的选择，绝大多数真核基因决定转录起始的选择，绝大多数真核基因正确表达所必需正确表达所必需确定真正的起始位点确定真正的起始位点Sequence elements within a typical eukaryotic gene1GCTATACAATGC-25-50-80-95-1301 based on the thymidine kinase gene octamertranscription elementpromoterTATA box (TATAAAA) loc

37、ated approximately 25-30 bp upstream of the +1 start site determines the exact start site (not in all promoters) binds the TATA binding protein (TBP) which is a subunit of TFIIDGC box (CCGCCC) binds Sp1 (Specificity factor 1)CAAT box (GGCCAATCT) binds CTF (CAAT box transcription factor)Octamer (ATTT

38、GCAT) binds OTF (Octamer transcription factor)+1ATTTGCAT调控区的模块模型（调控因子模块）调控区的模块模型（调控因子模块） 调控区由一些独立的功能元件组成，每个调控区由一些独立的功能元件组成，每个单元约单元约720bp的小段，这些序列又称模块的小段，这些序列又称模块（元件）。每个元件可以与一种或多种转录调（元件）。每个元件可以与一种或多种转录调控因子结合，多个元件组合构成某个基因的调控因子结合，多个元件组合构成某个基因的调控区。控区。启动子：多个元件，从特定的位点以一定方向启动子：多个元件，从特定的位点以一定方向 指导指导RNA合成；合成；

39、增强子：若干元件作为整体促进远端的转录。增强子：若干元件作为整体促进远端的转录。RNA聚合酶II启动子远端调控区：远端调控区： 位于转录起始位点更上游；如位于转录起始位点更上游；如 珠蛋白基珠蛋白基因的远端调控区在因的远端调控区在-1300 -3300间间 增强子：使与它连锁的基因转录频率明显增增强子：使与它连锁的基因转录频率明显增强的强的DNA序列，作为基因表达的重要调节元件。序列，作为基因表达的重要调节元件。 特点：特点： 1.增强效应明显（增强效应明显（10 200倍）；倍）； 2.增强效应与其位置和取向无关增强效应与其位置和取向无关； 3.大多为重复序列，一般大多为重复序列，一般50b

40、p； 4.增强效应有严密的组织和细胞特异性，增强效应有严密的组织和细胞特异性，只有特只有特定的蛋白质（转录因子）参与才能发挥其功能定的蛋白质（转录因子）参与才能发挥其功能；5. 没有基因专一性。没有基因专一性。 作用机制：通过改变模板作用机制：通过改变模板DNA的整体结构（影的整体结构（影响响DNA-Pro复合物的结构或改变复合物的结构或改变DNA超螺旋超螺旋密度）密度） eg.形成形成Z-DNA，增强子才有功能。，增强子才有功能。 一个增强子并不限于促进某一特殊启动子一个增强子并不限于促进某一特殊启动子的转录，它能刺激附近的任一启动子。的转录，它能刺激附近的任一启动子。类型类型III tRN

41、A、 5s rRNA、小分子、小分子RNA RNA聚合酶聚合酶III的转录产物都是短的的转录产物都是短的RNA，不，不编码蛋白质，以编码蛋白质，以RNA的形式执行生物学功能，多的形式执行生物学功能，多数作为蛋白质合成机器的组分（数作为蛋白质合成机器的组分（ tRNA ） tRNA基因结构特点：串联重复排列，多拷贝。基因结构特点：串联重复排列，多拷贝。 启动子有三种类型：启动子有三种类型： 基因内启动子基因内启动子 基因外启动子基因外启动子 混合启动子混合启动子基因内启动子：基因内启动子：转录起始识别区位于转录区域内部，转录起转录起始识别区位于转录区域内部，转录起始频率由转录起始位点负责。始频率

42、由转录起始位点负责。 5s rRNA基因启动子（、框）位于基因启动子（、框）位于+55+80bp之间之间非洲爪蟾非洲爪蟾tRNA基因启动子位于基因启动子位于+8+72间，间，其中框其中框+8+30，框，框+51+72。5S rRNA基因启动子在转录区内基因启动子在转录区内基因外启动子：基因外启动子：位于转录序列上游位于转录序列上游TATA结构结构 类似于类型类似于类型的的TATA框框近端序列元件近端序列元件PSE60bp远端序列元件远端序列元件DSE250bp（增强子）（增强子）混合启动子：混合启动子： 具有基因内和基因外混合启动子元件。具有基因内和基因外混合启动子元件。 如：海胆硒代半胱氨酸

43、如：海胆硒代半胱氨酸tRNA基因基因真核生物基因的转录因子真核生物基因的转录因子真核生物真核生物RNA聚合酶不具有全能性，需严格聚合酶不具有全能性，需严格依赖一些蛋白因子才能识别并结合到启动子特定依赖一些蛋白因子才能识别并结合到启动子特定序列上，启动转录反应（调控区的模块模型序列上，启动转录反应（调控区的模块模型每每一个元件都是一种或多种蛋白因子特异识别的序一个元件都是一种或多种蛋白因子特异识别的序列列一个元件叫一个模块，很多模块组成一个一个元件叫一个模块，很多模块组成一个调控区）。调控区）。转录转录因子因子通用转录因子普遍性转录因子通用转录因子普遍性转录因子主要与启动子核心元件框结合，主要与

44、启动子核心元件框结合，是同类基因转录都必须的转录因子，是同类基因转录都必须的转录因子， 如如TFA、B、D、E等。等。转录调控因子转录调控因子与上游调控区和远端调控区（增强子）结合，与上游调控区和远端调控区（增强子）结合，影响转录水平，在一些特定的基因转录中起作用。影响转录水平，在一些特定的基因转录中起作用。（不同基因的特殊转录调控因子）（不同基因的特殊转录调控因子）转录因子：以反式作用影响转录的因子。转录因子：以反式作用影响转录的因子。 转录因子一般有两种结构域，一种是与转录因子一般有两种结构域，一种是与DNA特异序列结合的结构域；一种是与相邻蛋白质结特异序列结合的结构域；一种是与相邻蛋白质

45、结合的结构域。合的结构域。如：亮氨酸拉链结构、锌指结构如：亮氨酸拉链结构、锌指结构 有的蛋白因子只具有蛋白质相互作用结构有的蛋白因子只具有蛋白质相互作用结构域，在两种不同的蛋白质间起桥梁作用。域，在两种不同的蛋白质间起桥梁作用。亮氨酸拉链模型及它在转录因子两个分子二聚体化中的作用亮氨酸拉链模型及它在转录因子两个分子二聚体化中的作用二聚体化转录因子二聚体化转录因子C/EBP的亮氨酸拉链的亮氨酸拉链和和DNA结合结构域的结构模型结合结构域的结构模型三类基因的转录因子三类基因的转录因子1.类型类型 I rRNA UBF 上游结合因子与上游调控元件上游结合因子与上游调控元件UCE结合结合 SL1 与核

46、心元件结合，具有种属特异性，能使与核心元件结合，具有种属特异性，能使RNA聚合酶聚合酶I正确的与起始位点结合，作用类似正确的与起始位点结合，作用类似于于 因子，又叫因子，又叫“定位因子定位因子” TFI A RNA聚合酶聚合酶I 的激活因子的激活因子UBF与与UCE结合，结合，SL1与与UBF结合，使结合，使UBF向前移动向前移动改善改善UBF与核心元件结合，形成一个跨越核心与核心元件结合，形成一个跨越核心元件元件UCE的蛋白质的蛋白质-DNA复合体复合体RNA聚合酶聚合酶I结合上去，形成开放性起始复合物结合上去，形成开放性起始复合物转录开始转录开始类型类型基因转录因子基因转录因子 tRNA

47、、5sRNA、SnRNA 普遍性普遍性 转录因子：转录因子：TF B、C 转录调控因子：转录调控因子： TF A 卵母细胞卵母细胞 5sRNA特异蛋白因子特异蛋白因子A框框TF BTF CTF ARNApol 激活因子激活因子增强子结增强子结合因子合因子使使RNApol 正确正确定位于起始位点定位于起始位点 类型类型基因转录因子基因转录因子 TF A、B、D、E等等类型类型基因调控区域与各种转录因子的结合位置基因调控区域与各种转录因子的结合位置类型类型基因转录的起始基因转录的起始转录终止：转录终止： 目前对真核基因转录了解较少，目前对真核基因转录了解较少， RNApol的转录产物是大分子的转录

48、产物是大分子RNA，经剪切，经剪切加工成成熟加工成成熟rRNA ； RNApol 的初级转录产物经加工后为的初级转录产物经加工后为mRNA； RNApol 的体外转录与体内转录产物具有的体外转录与体内转录产物具有相同的末端，因此是研究真核基因转录终止的较相同的末端，因此是研究真核基因转录终止的较好对象。好对象。 SV40的终止有类似与大肠杆菌的转录终止的终止有类似与大肠杆菌的转录终止子（不依赖于子（不依赖于p因子），转录产物形成发夹结构，因子），转录产物形成发夹结构，末端有一串末端有一串U，终止序列产物中有特定的剪切和，终止序列产物中有特定的剪切和修饰信号。修饰信号。真核基因转录后的加工真核基

49、因转录后的加工 1.真核基因转录产物的特点：真核基因转录产物的特点： 含内含子，需经剪接去除；含内含子，需经剪接去除； 需要修饰（加帽、加尾，稀有碱基）；需要修饰（加帽、加尾，稀有碱基）； 转录和翻译是两个相对独立的过程。转录和翻译是两个相对独立的过程。 2.加工类型加工类型: 加帽、加尾加帽、加尾 修饰修饰甲基化、酰基化甲基化、酰基化 剪接剪接 RNA编辑编辑 3.RNA加工的意义：加工的意义： 活化活化使无活性的前体使无活性的前体RNA加工成有活性加工成有活性的成熟的成熟RNA；（；（rRNA、tRNA的剪接、修饰）的剪接、修饰） 改变基因的编码产物改变基因的编码产物同一转录产物，不同同一

50、转录产物，不同剪接方式，编辑方式，蛋白产物不同；剪接方式，编辑方式，蛋白产物不同； 调节方式调节方式加工会影响加工会影响RNA的活性、半衰的活性、半衰期、运输等，影响期、运输等，影响RNA功能的发挥；功能的发挥；Steps in mRNA processing (hnRNA is the precursor of mRNA) capping (occurs co-transcriptionally) cleavage and polyadenylation (forms the 3 end) splicing (occurs in the nucleus prior to transport)

51、 exon 1 intron 1 exon 2capcapcappoly(A)cappoly(A)Transcription of pre-mRNA and capping at the 5 endCleavage of the 3 end and polyadenylationSplicing to remove intron sequencesTransport of mature mRNA to the cytoplasm加帽加帽 ( Cap0、CapI、CapII三种帽子结构三种帽子结构 ) 在细胞核中进行，在细胞核中进行，hnRNA的的5端常为端常为GTP，帽子化过程后，形成帽子化过

52、程后，形成m7G5ppp5Np结构。结构。 5帽子的功能：帽子的功能：n 保护保护mRNA免受免受5-核酸外切酶降解；核酸外切酶降解；n 使使mRNA进入细胞质；进入细胞质；n 对翻译起识别作用（对翻译起识别作用（ m7G5ppp5Np 优先与优先与核糖体结合）。核糖体结合）。三种帽结构三种帽结构 三种帽结构三种帽结构初级转录物的切除与多聚腺苷酸化Capping occurs co-transcriptionally shortly after initiation guanylyltransferase (nuclear) transfers G residue to 5 end methy

53、ltransferases (nuclear and cytoplasmic) add methylgroups to 5 terminal G and at two 2 ribose positions onthe next two nucleotides capping involves formation of a 5- 5 triphosphate bond cap function protects 5 end of mRNA (increases mRNA stability) required for initiation of protein synthesispppNpNmG

54、pppNmpNmPolyadenylation cleavage of the primary transcript occurs approximately 10-30 nucleotides 3-ward of the AAUAAA consensus site polyadenylation catalyzed by poly(A) polymerase approximately 200 adenylate residues are added poly(A) is associated with poly(A) binding protein (PBP) function of po

55、ly(A) tail is to stabilize mRNAmGpppNmpNmAAUAAAmGpppNmpNmAAUAAAAAAAAA3cleavagepolyadenylation 编码蛋白质的结构基因在核浆中被转录，编码蛋白质的结构基因在核浆中被转录，RNA分子很大，且很不稳定，由于大小很不一分子很大，且很不稳定，由于大小很不一致，称为核内不均一致，称为核内不均一RNA（hnRNA），其中），其中mRNA是由是由hnRNA加工成的。加工成的。hnRNA 25%mRNA 75%在核内降解在核内降解 hnRNA先加帽，先加帽， hnRNA尾端被切去一段尾端被切去一段后，加后，加poly（A

56、）尾，切除内含子成为）尾，切除内含子成为mRNA，进入细胞浆内。进入细胞浆内。剪接剪接 把断裂基因转录本中的内含子除去把断裂基因转录本中的内含子除去真核生物基因是断裂基因真核生物基因是断裂基因(split gene) 外显子外显子(exon)与内含子与内含子(intron)内含子的剪接方式内含子的剪接方式 自我剪接（由自我剪接（由RNA分子本身完成分子本身完成 ）：）：型型 型型 剪接体剪接体SnRNP参与参与mRNA 酶蛋白参与的剪接酶蛋白参与的剪接tRNA-珠蛋白的mRNA与基因杂交 -珠蛋白的pre-mRNA与基因的杂交鸡卵清蛋白鸡卵清蛋白mRNA与基因杂交图与基因杂交图自我剪接自我剪接

57、 型内含子型内含子 rRNA 特点：需要鸟苷酸参与（特点：需要鸟苷酸参与（GTP、GMP、GDP），），G的的2或或3-OH对对5端剪接点亲核攻击，通端剪接点亲核攻击，通过构象上的拉力或电子丢失，使剪接点上链的削过构象上的拉力或电子丢失，使剪接点上链的削弱和断裂。弱和断裂。 此反应不需要此反应不需要ATP，由，由GTP提供能量，提供能量，RNA有自行剪接能力，又称自身催化作用。有自行剪接能力，又称自身催化作用。 核酸酶核酸酶Ribozyme具有催化活性的具有催化活性的RNA分子。分子。GroupI内含子剪接四膜虫四膜虫rRNA的自我剪接的自我剪接型内含子型内含子 剪接过程：剪接过程： 离下游外

58、显子离下游外显子78bp处有一分支点处有一分支点A，A的的3-OH进攻外显子进攻外显子5端磷酸，使剪接点上链断裂。端磷酸，使剪接点上链断裂。 此反应不需要鸟苷酸参与此反应不需要鸟苷酸参与Chemistry of mRNA splicing two cleavage-ligation reactions transesterification reactions - exchange of onephosphodiester bond for another - not catalyzed bytraditional enzymes branch site adenosine forms 2,

59、5 phosphodiester bondwith guanosine at 5 end of intronG-p-G-U A-G-p-G2OH-A-5intron 1exon 1exon 2Pre-mRNAFirst clevage-ligation (transesterification) reactionbranch site adenosineG-OH 3 A-G-p-GU-G-5-p-2-A53AAO-G-p-G53U-G-5-p-2-A A3 G-ASplicingintermediateLariatexon 1exon 1exon 2exon 2intron 1intron 1

60、Second clevage-ligation reactionSpliced mRNA ligation of exons releases lariat RNA (intron)GroupII内含子剪接剪接体的剪接剪接体的剪接真核真核mRNA前体内含子的剪接前体内含子的剪接 hnRNA的的3和和5剪接点具有保守的结构序列，剪接点具有保守的结构序列，提供了正确的剪接信号。提供了正确的剪接信号。 哺乳动物或酵母哺乳动物或酵母mRNA的剪接只有形成剪接的剪接只有形成剪接体后才能进行。体后才能进行。 剪接体剪接体包括包括mRNA前体、前体、细胞核小分子细胞核小分子RNA（snRNA）和蛋白因子）和

61、蛋白因子组成的复合体。组成的复合体。细胞核小分子核糖核蛋白细胞核小分子核糖核蛋白snRNP 真核生物内含子真核生物内含子5剪接位点和剪接位点和3剪接位点的保守顺序剪接位点的保守顺序snRNP至少有五种：至少有五种： U1 与与5剪接点结合剪接点结合 U2 与内含子分支点结合与内含子分支点结合 U4/ U6 U5 与与3剪接点结合剪接点结合剪接过程剪接过程：U1 与与5剪接点结合，剪接点结合， U2与分支点结合，与分支点结合，U4/ U6 复合物结合，形成完整的复合物结合，形成完整的 “剪接体剪接体” 5剪接点被切开，形成剪接点被切开，形成5-外显子和套索中间产物外显子和套索中间产物U4 离开剪

62、接体，离开剪接体， 3剪接点切开剪接点切开两个外显子共价连接，形成成熟两个外显子共价连接，形成成熟mRNA和套索状内含子和套索状内含子Recognition of splice sites invariant GU and AG dinucleotides at intron ends donor (upstream) and acceptor (downstream) splice sitesare within conserved consensus sequencessmall nuclear RNA (snRNA) U1 recognizes thedonor splice site

63、sequence (base-pairing interaction) U2 snRNA binds to the branch site (base-pairing interaction)Y= U or C for pyrimidine; N= any nucleotide G/GUAAGU.A.YYYYYNYAG/Gdonor (5) splice siteacceptor (3) splice sitebranch siteU1U2Spliceosome - assembly of the splicing apparatus snRNAs are associated with pr

64、oteins (snRNPs or “snurps”) splicing snRNAs - U1, U2, U4, U5, U6 antibodies to snRNPs are seen in the autoimmunedisease systemic lupus erythematosus (SLE)G-p-G-U A-G-p-G2OH-A-5intron 1exon 1exon 2Spliceosome assemblyStep 1: binding of U1and U2 snRNPsU1= hnRNP proteinsU2G-p-G-U A-G-p-G2OH-A-53intron

65、1exon 1exon 2Step 2: binding of U4, U5, U6U1U5U2U4 U6G-p-G-U A-G-p-G2OH-A-53intron 1exon 1exon 2Step 3: U1 is released,then U4 is releasedU5U2U6G-p-G53U-G-5-p-2-A A3 G-Aintron 1mRNA2OH-AU5U2U6Step 4: U6 binds the 5 splice site andthe two splicing reactions occur,catalyzed by U2 and U6 snRNPsSnRNA参与的

66、参与的mRNA前体的剪接前体的剪接自我剪接与剪接体催化的剪接比较自我剪接与剪接体催化的剪接比较酶蛋白参与的酶蛋白参与的tRNA前体的剪接前体的剪接 tRNA前体的内含子中有一段与前体的内含子中有一段与tRNA的反的反密码子互补的序列，因而使反密码臂的构象发生密码子互补的序列，因而使反密码臂的构象发生了改变了改变反密码臂伸长了很多；反密码臂伸长了很多； tRNA前体剪接中需要核酸内切酶和前体剪接中需要核酸内切酶和RNA连连接酶接酶 tRNA的前体加工的前体加工剪接过程：剪接过程： 特异性特异性RNA内切酶识别内含子二级结构，内切酶识别内含子二级结构，将两侧磷酸二酯键切开，形成将两侧磷酸二酯键切开，形成5-OH和和3-P；（不需；（不需ATP）两个两个tRNA半分子碱基互补配对，形成半分子碱基互补配对，形成成熟的成熟的tRNA构象，构象，RNA连接酶形成磷连接酶形成磷酸二酯键（需要酸二酯键（需要ATP）mRNA的不同剪接产物的不同剪接产物 在某些生物中，在不同分化时期，在某些生物中，在不同分化时期，RNA种类种类无区别，基因表达差异靠加工实现，如海胆卵母无区别，基因表达差异靠加工实现，如海