一株微生物采油菌的16SrDNA鉴定和绿色荧光蛋白分子标记

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1、第 卷 第 期 徐 州 工 程 学 院 学 报 （自 然 科 学 版 ） （ ） 年 月一株微生物采油菌的 鉴定和绿色荧光蛋白分子标记王 欲 晓，庄 文 昌，王靖（徐 州 工 程 学 院 ，江 苏 徐 州 ；中 国 石 油 大 学 化 工 学 院 ，北 京 ）摘 要 ：筛选到一 株 高效生产多糖的 菌 ，油田先导试验证明该菌可 以 用于微 生 物 调 剖 提 高 原油 采 收 率 （，）经 分 析 鉴 定 ， 菌 属 于 肠 内 杆 菌 属（），为跟 踪 监测其动态信息 ，构 建 表达绿色荧光蛋白 （， ）的 重 组 质 粒 （），利 用 法 将 其 转 化 至 菌 ，利用荧光显微镜可以观 察

2、 到 重 组 （）工 程 菌 的 绿 色 荧 光 结 果 表 明 菌可以被绿色荧光蛋 白 基 因标 记 ，用 于 微 生 物 采 油 研 究 关 键 词 ：微 生 物 采 油 菌 ； 鉴 定 ；绿 色 荧 光 蛋 白 ；重 组 质 粒中 图 分 类 号 ： 文 献 标 志 码 ：文 章 编 号 ：（）微 生 物 提 高 原 油 采 收 率 （，简 称 ）是 一 种 新 型 提 高 原 油 采 收 率 的方 法 它 适 用 范 围 广 、工 艺 简 单 、投 资 少 、见 效 快 、功 能 多 、无 污 染 、注 入 的 微 生 物 和 营 养 物 既 便 宜 又 容 易 获 得，在 矿 场 条

3、 件 下 易 于 监 测 ，是目前具有发展前景的一项采油 技 术 从 世 纪 年 代 起 ，前 苏 联 和 东 欧 一些国 家进 行了多次 微生物采油现场试验 ，普 遍 取 得 成 功 ，结果表明细菌 采 油对 低 产 井 效果较好筛 选 优 秀 菌 种 是 技 术 的 关 键 所 在 ， 的 快 速 分 析 鉴 定 可 以 了 解 菌 种 的 种 属 关 系，而 荧光 标记 可以快速 跟踪和研究优势菌的动 态 信 息 ，更 好 的 为 技 术 服 务 年 等克 隆 了 基 因 的 ，并 分 析 了 的 一 级 结 构 ；年 等首 次 在 大 肠 杆 菌 细 胞 和 线 虫 中 表 达 了 目

4、 前 研 究表 明 ，绿 色 荧 光 蛋 白 可以作为分子标记物 ，通 过 基 因 工 程 手 段 ，在 不 影 响 微 生 物 自 身 性 状 的 前 提 下 ，导 入 生 物 体 ，使得新构建的生物产生易于观察的现象 材 料 与 方 法材 料菌 种 和 质 粒 菌 ，本 实 验 室 筛 选 ，可 以 高 效 生 产 多 糖 ，用于微生物采油 ，购 自 公 司 ，用 于 高效 转 化 外 源 基 因 的 菌 株 质 粒 ，购 自 华 美 生 物 技 术 公 司 ，克 隆 载 体 ，用 于 高 效 率 连 接 产 物 包 含 基 因 的 重 组 质 粒 （），本 实 验 室 构 建 培 养 基

5、 和 主 要 试 剂完 全 培 养 基 （）：蛋 白 胨 ，葡 萄 糖 ，酵 母 粉 ，牛 肉 膏 ， 值 ； 培 养 基（）：胰 蛋 白 胨 ，酵 母 粉 ，氯 化 钠 ， ； 加 葡 萄 糖 液 体 培 养 基 ： 培 养 基 加 葡 萄糖 限 制 性 内 切 酶 、 、 购 自 大 连 ；、（）、溶 菌 酶 、（）购 自 上 海收 稿 日 期 ：基 金 项 目 ：国家高科技研究发展计划 （ 计 划 ）项 目 （）作 者 简 介 ：王 欲 晓 （），男 ，江 苏 徐 州 人 ，硕 士 ，讲 师 ，主要从事微生物采油研究 通 讯 作 者 ：王 靖 （），女 ，北 京 人 ，博 士 ，教 授

6、，主要从事生物化学和微生物研究 （ ）生 物 工 程 有 限 公 司 ；其 他试剂为国 产分析纯或优级纯 ，试剂用水均为重 蒸 去离 子 水 方 法 菌 的 分 子 鉴 定 菌 提 取 基 因 组 和 反应体系参考文献 ， 扩 增 上 游 引 物 ： ，下 游 引 物 ： ， 预 变 性 ， ， ， ，共 反 应个 循 环 ； ， 停 止 琼 脂 糖 胶 中 回 收 纯 化 片 段 ， 产 物 纯 化 后 ，连 接 到 质 粒 上 ， 序 列 测 定 委 托 上 海 生 物 工 程 有 限 公 司 完 成 将 测 定 得 到 的 的 序 列 与 数 据 库 中 的 相 关 菌 的 用 进 行

7、比 对 分 析 ，分 析 各 序 列 间 的 相 似 性 ；利 用 分析不同菌株的 之间的进化距离 ，构 建 系 统 进 化 树 重 组 质 粒 （） 转 化 菌和绿色荧光检 测 及 分 子 检 测 法 将 用 包 含 基 因 的 重 组 质 粒 （） 转 化 菌 ，参 考 文 献 ，筛 选 阳 性 克 隆菌 落 绿 色 荧 光 检 测 ：在 培 养 基 中 ， 培 养 菌的阳性重组克隆 ，在 为时 加 入 至 终 物 质 的 量 浓 度 为 ，继 续 诱 导 培 养 ，荧 光 显 微镜 检测到显荧光的 菌 最 多 阳 性 菌克隆小提质粒 ， 扩 增 基 因 ，引 物 合 成 由 上 海 生

8、物 工 程 有 限 公 司 合 成上 游 引 物：；下 游 引 物： 所 使用的退火温度一般低于引物 值 的温度引物 值估算根据公式 （）（）一般反应程序： ， ， ，共 个 循 环， 延 伸 产 物 经 琼 脂 糖 电 泳 检 测基因阳性 菌转化子扩大培养，离心后收集菌体，超声破碎细胞，表达蛋白经 电泳检测结 果 和 分 析 野 生 菌 的 分 子 鉴 定根 据 的 通 用 引 物 ，在 最 佳 的 条 件 下 扩 增 出 菌 的 序 列 经 大 连 宝 生 物 公 司 测 序 ，得 到 的 序 列 ，如 图 将 此 序 列 与 、 数 据 库 中 的 序列 进 行 （），得 到 了 种 与

9、 菌 株 同 源 性 较 高 的 菌 株 序 列 ，见 表 用 软件比对分析序 列 之 间 的 相 似 值 ，然 后 用 软 件 计 算 出 序 列 的 系 统进 化 距 离 ，采 用 邻 位 相 连 法 构 建 出 菌 株 和 中 个亲缘关系较近 的 杆菌的系统发育树 如 图 所 示 分 析 表 明 ，菌 株 和 、 的 相 似 值 较 高 ，进 化 距 离 较 小 ，其中 与 （）相 似 值 最 高 为 菌 的 序 列 与 和 的 相 似 性 较 高 ，表明该菌属于肠内杆菌属 （） 重 组 菌 的 荧 光 检 测重 组 质 粒 转 化 菌 ，经鉴定及纯化后 ，挑 取 单 菌 落 ，接 种

10、表 达 培 养 基 （含 终 质 量 浓 度 为 ）液 体 培 养 基 中 ， 振 摇 过 夜 以 体 积 分 数 的 接 种量转接至新鲜的 表 达 培 养 基 中 （含 终 质 量 浓 度 为 ） 培 养 至 值 之 间 ，加 入 诱 导 剂 至 终 物 质 的 量 浓 度 为 继 续 诱 导 培 养 一 定 时 间 后 取 样 ，用 荧 光 显 微 镜 观 察 ， 的 荧 光 检 测 使 用 日 本 荧 光 显 微 镜 （ 显 微 镜 数 码 相 机 ， 汞 灯 ， 滤 光 片 ，吸 收 滤 镜 ，分 光 镜 ， 蓝 光 激 发 ，目 镜 ，物 镜 ），使 用 软 件 获 取 图 像 荧

11、光 检 测 结 果 见 图 ，说 明 重 组 菌成功表达绿色荧 光 蛋白 重 组 菌 检 测 菌 的阳性转化子扩大培养后 ，小 提 质 粒 ， 检 测 基 因 检 测 结 果 如 图 ，在 左 右 处 ，出 现 明 显 的 基 因 条 带 ，表 明 菌的阳性转化子含有 基 因 徐州工程学院学报 （自 然 科 学 版 ） 年 第 期 图 野 生 菌 的 全 序 列表 与 菌同源性较高的 株 菌 的 的 序 列 号菌 株特性序 号 图 基 于 序 列 同 源 性 的 菌 株 间 的 系 统 发 育 树（） 基 因 标 记 的 菌 阳 性 转 化 子（）野 生 菌图 重 组 菌的荧光显微镜照片 （）

12、经 诱 导 的 菌 阳 性 转 化 子 ，离 心 后 收 集 菌 体 ，超 声 破 碎 细 胞 ，表 达 蛋 白 经 电 泳 检测 ，见 图 ，表 明 ： 菌 转 化 子 在 相 对 分 子 质 量 万处有一明显条带 ，和 报 道 的 的 相 对 分 子 质 量 一 致 ，说 明 菌 转 化 子 已 经 成 功 表 达 出 蛋 白 注 ： 为相对分子质量标记 ； 为 左 右 的 基 因 条 带 图 重 组 菌 阳 性 转 化 子 质 粒 的注 ： 为相对分子质量标记 ；为 野 生 菌表达的总蛋白 ；为 重 组 菌 阳 性 转 化 子 经 诱导表达的总蛋白 徐州工程学院学报 （自 然 科 学 版

13、 ） 年 第 期结 语经 分 析 鉴 定 ， 菌属于肠内杆菌属 （），利 用 法 成 功 转 化 重 组 质 粒 （） 至 菌 ，利用荧光显微镜可以观察到 重 组 工程菌高效表达 绿 色 荧 光 本 研 究 为 跟 踪 监测 采 油 优 势 菌 种 ，为微 生物提高原 油采收率提供参考 参 考 文 献 ：李 希 明 ，冯 时 林 ，曾 庆 坤 ，等 微生物采油技术研究 油气采收率技术 ，（）：罗 跃 ，佘 跃 惠 微生物采油技术研究的国内外动态及本源微生物采油技术 国内外油田工程 ，（）：周 琳 ，张 杰 群 落 分 析 中 的 及 其 基 因 优 化 扩 增 微 生 物 学 报 ，（）： ， ， ，（）： ，（）：邓 超 ，黄 大 昉 ，宋 福 平 绿色荧光蛋白及其应用 中国生物工程杂志 ，（）：殷 幼 平 ，李 强 ，袁 训 娥 ，等 绿色荧光蛋白基因原核表达载 体 的构建及其在昆虫肠道短短芽孢杆菌和苏 云金芽孢杆菌中的 表 达 ，微 生 物 学 报 ，（）：， 分子克隆实验指南 版 北 京 ：科 学 出 版 社 ，郝 福 英 分子生物学实验技术 北 京 ：北京大学出版社 ， ， ，（，；，）： （） ， （）， （ ） ，（） ： （）；（）；（责 任 编 辑 崔 思 荣 ）