亚甲蓝病毒灭活血浆的质量测定

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1、亚甲蓝病毒灭活亚甲蓝病毒灭活血浆血浆的质量控制的质量控制 乌鲁木齐市血液中心质量管理科乌鲁木齐市血液中心质量管理科 梅静梅静 2015.4 血浆病毒血浆病毒灭活的必灭活的必要性要性亚甲蓝亚甲蓝病病毒灭活血毒灭活血浆的制备浆的制备亚甲蓝病亚甲蓝病毒灭活毒灭活的的技术原理技术原理病毒灭活病毒灭活血浆的质血浆的质量控制量控制血浆病毒灭活的必要性 随着血液检测技术的进步和血液管理措施的完善，目前的HBsAg、抗-HCV、抗-HIV的检测在很大程度上降低了输血导致病毒传播的几率，但由于 1 病毒变异导致免疫反应性的改变； 2 免疫静默感染； 3 检测技术存在窗口期漏检的局限性； 4 检测病原体种类的局限

2、； 输血引起艾滋病病毒（HIV、HCV、HBV）的风险尚不能完全杜绝；不常见的病毒如人类T淋巴细胞白血病病毒（HTLV）、西尼罗病毒（WNV）、EB病毒等在大多数国家均未被列入血液常规检测。现有的检测手段不能完全排除血浆中可能存在的未知病毒。 血浆制品病毒去除方法：血浆制品病毒去除方法：乙醇沉淀深层过滤离子交换色谱和亲和层析色谱纳米膜过滤 纳米膜过滤技术 单一的病毒灭活/去除方法虽然能较好的起到处理病毒效果，但是无法灭活和去除所有病毒，如细小病毒B19、VIR918、PARV4、SV40和PrPSc。主要在血浆蛋白分离工艺中应用主要在血浆蛋白分离工艺中应用血浆病毒灭活方法有机溶剂/去污剂（S/

3、D）法热处理蒸汽处理法以上方法多用于从原以上方法多用于从原料血浆生产血浆蛋白料血浆生产血浆蛋白制品，均需要将大量制品，均需要将大量的不同人份的血浆混的不同人份的血浆混合处理，不但容易增合处理，不但容易增加某些不能被灭活病加某些不能被灭活病原体（如朊病毒原体（如朊病毒prion等）的扩散风险，等）的扩散风险，且且处理难度大，费用高。处理难度大，费用高。亚甲蓝光化学法亚甲蓝光化学法能对能对单人份血浆进行病毒单人份血浆进行病毒灭活灭活，适用于采供血，适用于采供血机构对临床用血浆的机构对临床用血浆的病毒灭活处理，更适病毒灭活处理，更适合于我国的国情和临合于我国的国情和临床实际应用。床实际应用。 终端干

4、热法 低pH孵放法辛酸处理法亚甲蓝病毒灭活的技术原理亚甲蓝又名美蓝，分子量 319185，是一种光敏剂，吩噻嗪类染料，其最大吸收峰为 670nm，临床上常作为解毒剂，用于治疗亚硝酸盐中毒引起的高铁血红蛋白血症和氰化物中毒。亚甲蓝表面携带正电荷，与病毒核酸结合后可以嵌入DNA/RNA 中，与病毒核酸带负电荷的 G-C 碱基对相结合。在有光照的条件下，亚甲蓝分子吸收光能后可激发产生单态分子氧，这种单态分子氧通过修饰鸟嘌呤碱基而影响核酸，使其产生缺口，引起核酸链的断裂或导致碱基位点丢失，从而阻止其复制,达到灭活病毒的目的。u 与脂膜和蛋白质结合u对核酸有较高的亲和性u亚甲蓝为多靶点的光敏剂，光照射产

5、生单线态氧和羟自由基引起广泛损伤 亚甲蓝可与病毒的核酸与脂质包膜相结合，在可见光的作用下，可使病毒的核酸断裂，包膜破损，因而能杀灭包括艾滋病病毒（HIV）、乙肝病毒（HBV）、丙肝病毒（HCV）等的脂质包膜病毒和部分非脂质包膜病毒。 对亚甲兰光化学法病毒灭活有效性的研究显示，血浆中指示病毒的滴度显著下降，血浆中的病毒含量下降了6个数量级，可能残留的病毒量低于百万分之一，达到了国际公认的血浆病毒灭活有效性指标，也符合卫生部关于血浆制品病毒灭活的有关规定。 亚甲蓝病毒灭活的技术原理 美国AABB技术手册描述了病原体灭活血浆制品，介绍了欧盟开展的三种病毒灭活方法，其中包括亚甲蓝、核黄素和补骨脂素。但

6、美国未开展。 欧盟指南中描述了病原体灭活的FFP制品的质量要求，同时也介绍了三种方法。 英国指南中明确描述了亚甲蓝处理和去除的FFP制品的质量要求，质量要求中对亚甲蓝残留量要求为0.3umol/L0.3umol/L ，与我们的国标一致。2007年乌鲁木齐市血液中心引进该技术, 截至2014年底使用亚甲蓝光化学病毒灭活血浆13万单位以上。2004年，世界卫生组织将亚甲蓝光化学血浆病毒灭活技术列入 “人血浆制品病毒灭活或去除指南”， 欧盟和英国也纳入“输血指南”。90年代中期，上海血液中心开发以荧光照射光源和配置亚甲蓝去除滤器为特点的亚甲蓝光化学血浆病毒灭活技术，随后该项技术在我国被逐步推广。19

7、92年，德国最早将依靠该项技术处理的新鲜冰冻血浆应用于临床。一次性使用血浆病毒灭活输血过滤器Depasse 最早提出了 “过滤器的应用”，极大地简化和改进了 MB-P 法的操作，为 MB-P 法由实验室走向临床迈出了重要一步。目前使用的一次性使用血浆病毒灭活输血过滤器主要由亚甲蓝添加元件、光照袋、过滤器、血浆储存袋和连接管路组成，是一种简便、实用的血浆灭活器材。亚甲蓝作为一种外来物质进入人体后，对人体的潜在影响尚不可知。若病毒灭活血浆中残留过多的亚甲蓝，还会造成血浆外观和色泽的明显改变，使病人输注时可能产生心理负担。在保证灭活所需的有效浓度下，要尽量减少其残留量，因而对病毒灭活血浆中的亚甲蓝残

8、留量/率进行控制很有必要。选择合适的亚甲蓝含量的测定方法很重要。医用病毒灭活箱的应用医用病毒灭活箱的应用 当前的医用病毒灭活箱是用于光照灭活时的专用设备，它集光源、温控、机械摆动等装置于一身，可以根据需要设定照射强度、照射温度、照射时间和摆动频率等诸多条件，使用方便。光源选择：光源选择：荧光灯（1）单位时间内照射所释放的热量较低；（2）达到相同灭活效果的照射时间最短；（3）波长接600700nm。照射方式：照射方式：有效光照强度范围在 30 00040 000lx。（1）放置血袋的托盘为钢丝结构，有较大空隙，使血袋两面都可以接受照射；（2）照射过程中托盘以602 次/分钟的频率摆动；（3）箱内

9、面为镜面，可以将灯管直射的光源和镜面反射的光源从 360 度全方位地照射血浆。 亚甲蓝病毒灭活血浆在我国开展近十年，各种关于病毒灭活对血浆主要成分影响情况的报道可归纳为：血浆经过 MB-P 法灭活后，血浆总蛋白回收率90%以上；但部分不稳定的凝血因子(，)和纤维蛋白原（Fg）的变化明显，因子的回收率一般在 80%左右。血浆的免疫原性、各种电解质、酶的稳定性等的变化不明显，PH 值也未受影响。 亚甲蓝的浓度与血浆病毒的灭活效果有直接关系，只有达到一定的释放量才能起作用，但亚甲蓝若残留过多会影响血浆的外观色泽，且亚甲蓝存在致突变的可能性，因而必须对灭活前后亚甲蓝的含量进行测。血浆中亚甲蓝残留量的检

10、测固相萃取小柱将亚甲蓝从血浆中提取出。分光光度计检测。不能直接用分光光度计测定血浆中亚甲蓝的含量,因为血浆本身为复杂的混合物,含有多种蛋白,在亚甲蓝最大吸光波长处血浆蛋白亦有吸光,而且血浆蛋白个体差异很大,因此无法取得准确的检测结果,要想准确检测血浆中亚甲蓝含量,必须排除干扰,既将亚甲蓝提取出来,再进行测定。亚甲蓝检测依据检测依据血站技术操作规程2012年版：14 附录附录 F 血液质量控制检查方法血液质量控制检查方法 F.19 亚甲蓝残留量。全血及成分血质量标准 GB18467-20125.16病毒灭活冰冻血浆质量标准，亚甲蓝残留量 0.30 mol/L。16血浆中亚甲蓝残留量的检测 所需实

11、验仪器、试剂所需实验仪器、试剂试验仪器试验仪器: : 固相萃取富集装置及配套的固相萃取耗材：推荐使用固相萃取富集装置及配套的固相萃取耗材：推荐使用Waters Waters OasisOasis产品产品 （）真空泵真空泵分光光度计分光光度计试管离心机试管离心机试剂：亚甲蓝标准品粉剂、甲醇、乙酸、蒸馏水试剂：亚甲蓝标准品粉剂、甲醇、乙酸、蒸馏水其他耗材：容量瓶、移液器、试管等其他耗材：容量瓶、移液器、试管等亚甲蓝残留量的检测原理固相萃取固相萃取-分光光度法分光光度法 利用固相小柱内吸附介质是一种大孔聚合物，利用固相小柱内吸附介质是一种大孔聚合物，对血浆中亚甲蓝具有很强的对血浆中亚甲蓝具有很强的选

12、择性选择性吸附，可吸附，可排除血排除血浆蛋白、脂肪和其它杂质的干扰，浆蛋白、脂肪和其它杂质的干扰，当血浆标本通过当血浆标本通过小柱时，血浆中血浆中亚甲蓝被柱子中大孔聚合物小柱时，血浆中血浆中亚甲蓝被柱子中大孔聚合物吸附，最后用洗脱液洗脱液洗脱亚甲蓝，采用柱子吸附，最后用洗脱液洗脱液洗脱亚甲蓝，采用柱子提取血浆中残留亚甲蓝，用含提取血浆中残留亚甲蓝，用含1%醋酸的甲醇溶液调醋酸的甲醇溶液调零，在零，在653 nm检测标准、质控、测定管，其吸光度检测标准、质控、测定管，其吸光度与浓度呈正比。与浓度呈正比。Waters Oasis小柱特性小柱特性:-大孔聚合物大孔聚合物.对化合物的保留强对化合物的保

13、留强 - 是一种通用性的吸附剂（是一种通用性的吸附剂（pH范围较宽范围较宽1-14）- 30%甲醇清洗甲醇清洗,可完全去除血浆中的蛋白、脂质和其它杂可完全去除血浆中的蛋白、脂质和其它杂质质 - 亚甲蓝在不同溶剂中亚甲蓝在不同溶剂中,最大吸收峰不同：最大吸收峰不同： 甲醇溶液为甲醇溶液为653nm ,故本法选故本法选653nm 为测试波长为测试波长. - 可用可用1乙酸的甲醇溶液乙酸的甲醇溶液,迅速将柱床顶的亚甲蓝洗脱迅速将柱床顶的亚甲蓝洗脱.亚甲蓝酸性染料，（亚甲蓝酸性染料，（pH3.5 1乙酸的甲醇溶液）乙酸的甲醇溶液）19主要检测设备：固相萃取富集装置亚甲蓝残留量检测方法u使用Waters

14、 Oasis小柱萃取血浆中的亚甲蓝使用前的Waters小柱1、用6ml甲醇活化Waters小柱2、加入6ml供试血浆亚甲蓝残留量检测方法u将萃取出的亚甲蓝洗脱后进行比色 Waters小柱萃取出血浆中的亚甲蓝3、萃取亚甲蓝4、用30甲醇6mL清洗 5、用含1乙酸的甲醇溶液2ml洗脱 6、洗脱液离心（3500rpm/10min） 7、用含1乙酸的甲醇溶液作试剂空白，在6542nm波长处测定吸光度注：用同样的方法萃取检测标准品 成品试剂盒的组成小柱小柱R1： 活化液活化液R2： 清洗液清洗液 R3： 洗脱液洗脱液亚甲蓝标准液：（亚甲蓝标准液：（100mol/L) )质控液：（质控液：（0.300mo

15、l/L）操作方法（详读说明书、按说明书操作）操作方法（详读说明书、按说明书操作）1、柱预处理柱预处理 取小柱三支表明测定、标准、质控，分别插入固相萃取装置过滤柱子取小柱三支表明测定、标准、质控，分别插入固相萃取装置过滤柱子中，加入中，加入3ml活化液活化小柱。活化液活化小柱。2、加标准液（加标准液（ 10mol/L）：（取血浆）：（取血浆0.36ml,加加100mol/L标准液标准液0.04ml混匀）于标明标准的小柱内加混匀）于标明标准的小柱内加0.3ml标准液标准液3、加质控液（加质控液（0.300mol/L）：）： （取血浆（取血浆0.36ml,加质控液加质控液0.04ml混匀）混匀）于标

16、明标准的小柱内加于标明标准的小柱内加0.3ml质控液质控液4、加样：于标明测定的小柱内加加样：于标明测定的小柱内加6.0ml血浆血浆5、清洗清洗 待血浆完全进入小柱后，用待血浆完全进入小柱后，用3ml清洗液清洗小柱，去血浆中的蛋白清洗液清洗小柱，去血浆中的蛋白质、脂质和其他杂质，血浆中亚甲蓝被吸附于吸附剂上。质、脂质和其他杂质，血浆中亚甲蓝被吸附于吸附剂上。6、洗脱洗脱换干净的试管，加换干净的试管，加2ml洗脱液洗脱小柱上的亚甲蓝洗脱液洗脱小柱上的亚甲蓝。7、检测检测 将洗脱液离心将洗脱液离心3000转转/5分钟，取上清液于分钟，取上清液于4040半自动半自动生化分析仪检测洗脱液调零，生化分析仪检测洗脱液调零，654nm波长，分别测定波长，分别测定标准管和测定管吸光度。标准管和测定管吸光度。计算：亚甲蓝（计算：亚甲蓝（mol/L）= 0.5 （mol/L）标准管吸光度测定管吸光度比色比色: 亚甲蓝遇光易分解，萃取后需及时比色留取标本留取标本：病毒灭活冰冻血浆置3037融化时间应小于6分钟。为使其尽快融化，应不断轻柔摇动血浆袋。不得急剧摇动血浆袋，以防止血浆中出现大量泡沫。注意事项注意事项谢 谢！