生化仪器分析与实验技术在药物质控研究中的应用

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1、生化仪器分析与实验技术生化仪器分析与实验技术在药物质控研究中的应用在药物质控研究中的应用生化仪器分析与实验技术生化仪器分析与实验技术生命学科研究集多学科为一体：光学、电学、化学、生物化学、免疫学 综合性实验技术四大实验技术：光谱分析、电泳技术、免疫学技术、层析技术生化仪器特点：功能多样化、操作智能化、测定微量化生化药品的定义与分类生化药品的定义与分类 一般系指从动、植物及微生物中提取、分离、纯化，一般系指从动、植物及微生物中提取、分离、纯化，或用生物化学半合成或用现代技术制得的具有生物化学或用生物化学半合成或用现代技术制得的具有生物化学活性的一类用于临床治疗的药物活性的一类用于临床治疗的药物:

2、 :氨基酸及其衍生物氨基酸及其衍生物 酶与辅酶酶与辅酶核苷酸及其衍生物核苷酸及其衍生物肽与蛋白肽与蛋白多糖多糖 类类脂类脂类基因工程药物的质控特点基因工程药物的质控特点 目前，研发成果主要集中在蛋白质和多肽类药物，其质目前，研发成果主要集中在蛋白质和多肽类药物，其质控内容主要有：控内容主要有： 结构确认结构确认 理化性质鉴别理化性质鉴别 纯度与杂质检查纯度与杂质检查 效价与含量测定效价与含量测定 生物活性测定生物活性测定 基因工程药物来源于活的生物体基因工程药物来源于活的生物体（细菌或细胞细菌或细胞，它的，它的生产涉及到生物材料和生物学过程，如发酵、细胞培养、生产涉及到生物材料和生物学过程，如

3、发酵、细胞培养、分离纯化目的产物等，这些过程有其固有的易变性，分离纯化目的产物等，这些过程有其固有的易变性， 必须对原材料、培养过程、纯化工艺过程、最必须对原材料、培养过程、纯化工艺过程、最终产品进行全面的质量控制。终产品进行全面的质量控制。临床应用 溶栓类溶栓类 tPA UK SK K2 tPA TNK tPA 纤溶酶 人水蛭素类似物 抗肿瘤抗肿瘤 门冬酰胺酶 TNFa 人精氨酸酶 抑肽酶 舍雷肽酶 蕲蛇酶 抗病毒抗病毒 利巴韦林 阿昔洛韦 干扰素 聚肌胞苷酸 肌苷 环磷腺苷 降血糖降血糖 人胰岛素及其类似物、人促胰岛素分泌素 治疗心脑血管病治疗心脑血管病 弹性蛋白酶 胰激肽原酶 生长抑素

4、促生长促生长 人生长激素制剂 促生殖促生殖 卡贝缩宫素 人促卵泡激素 人绒促性素 人促黄体生成素 曲普瑞林制剂 抗炎症抗炎症 胰蛋白酶 糜蛋白酶 复合凝乳酶 木瓜酶 超氧化物歧化酶 胶原酶 凝乳酶 菠萝蛋白酶 酸性蛋白酶 溶菌酶 玻璃酸酶 止血止血 尖吻蝮蛇凝血酶、血凝酶、凝血酶、巴曲酶、蛇毒激凝酶 消化消化 复方消化酶片 胰酶 胃蛋白酶 中性蛋白酶 淀粉酶 胰脂酶治疗高尿酸血症治疗高尿酸血症 假丝酵母尿酸氧化酶治疗治疗I I型戈谢病型戈谢病 阿糖苷酶 -葡萄糖脑苷脂酶补充营养增强免疫力补充营养增强免疫力 氨基酸输液 脂肪乳 脑磷脂 卵磷脂 猪苓多糖生物化学实验技术生物化学实验技术1.光谱分析

5、技术光谱分析技术2.层析技术层析技术3.色谱分析技术色谱分析技术4.电泳技术电泳技术5.免疫学技术免疫学技术6.离心技术离心技术7.膜分离技术膜分离技术光谱技术光谱技术: : (1) (1) 紫外紫外: : 氨基酸、核苷酸、肽、蛋白、酶氨基酸、核苷酸、肽、蛋白、酶、糖、糖；(2) (2) 红外红外: : 氨基酸、核苷酸、辅酶；氨基酸、核苷酸、辅酶；(3) (3) 核磁核磁: : 氨基酸、核苷酸、辅酶、肽、衍生物；氨基酸、核苷酸、辅酶、肽、衍生物；(4) (4) 质谱质谱: : 氨基酸、小肽、核苷酸；氨基酸、小肽、核苷酸；(5) (5) 拉曼光谱拉曼光谱: : 蛋白蛋白 、糖、糖；(6) (6)

6、 圆二色光谱圆二色光谱: :蛋白蛋白 、 糖糖 (7) 原子吸收：原子吸收：蛋白和酶中的金属离子蛋白和酶中的金属离子 (8) 荧光发射荧光发射 ： 氨基酸、核苷酸、肽、蛋白；氨基酸、核苷酸、肽、蛋白；层析与色谱分析技术层析与色谱分析技术(1) 纸层析纸层析: 氨基酸、糖、核苷酸氨基酸、糖、核苷酸(2) 板层析板层析: 氨基酸、核苷酸、脂；氨基酸、核苷酸、脂；(3) 柱层析柱层析: 氨基酸、核苷酸、蛋白脂；氨基酸、核苷酸、蛋白脂；(4) 气相色谱气相色谱: 有机残留杂质；有机残留杂质；(5) 液相色谱液相色谱: 氨基酸、肽、蛋白、核酸、糖、脂氨基酸、肽、蛋白、核酸、糖、脂 (6) 气质联用：气质

7、联用：脂、肽、蛋白、核糖；脂、肽、蛋白、核糖； (7)液质联用：液质联用：肽、蛋白、核糖；肽、蛋白、核糖； (8) 临界色谱：临界色谱：肽、蛋白、核糖。肽、蛋白、核糖。电泳技术电泳技术: : (1) (1) 纸电泳纸电泳 氨基酸、糖、核苷酸氨基酸、糖、核苷酸 (2) (2) 淀粉电泳淀粉电泳 氨基酸、核苷酸氨基酸、核苷酸 (3) (3) 淀粉凝胶电泳淀粉凝胶电泳 糖、核苷酸糖、核苷酸 (4) (4) 琼脂凝胶电泳与免疫电泳琼脂凝胶电泳与免疫电泳 核酸核酸 蛋白质蛋白质 (5) PAGE (5) PAGE 核酸核酸 多肽多肽 蛋白质蛋白质 酶酶 (6) SDS-PAGE (6) SDS-PAGE

8、 多肽多肽 蛋白质蛋白质 酶酶 (7)(7)等电聚焦电泳等电聚焦电泳 多肽多肽 蛋白质蛋白质 酶酶 (8) (8) 毛细管电泳毛细管电泳 核酸核酸 多肽多肽 蛋白质蛋白质 (9) (9) 等速电泳等速电泳 多肽多肽 蛋白质蛋白质 酶酶 现代仪器分析现代仪器分析1.DNA1.DNA序列仪序列仪2.2.氨基酸序列仪氨基酸序列仪 N N末端末端aaaa序列序列3.3.飞行时间质谱分析仪飞行时间质谱分析仪 MALDI-TOF/MSMALDI-TOF/MS 分子量分子量 质量肽图质量肽图 纯度纯度 糖蛋白微观不均一性糖蛋白微观不均一性4.4.电喷雾电喷雾质谱分析仪质谱分析仪 分子量微观不均一性分子量微观

9、不均一性5.5.多功能电泳仪多功能电泳仪 分子量分子量 纯度纯度 等电点等电点 电印记电印记 双向电泳双向电泳6.C6.C末端肽段分馏仪末端肽段分馏仪7. 7. 园二色光谱仪园二色光谱仪 蛋白质二级结构蛋白质二级结构8.8.激光激光拉曼光谱仪拉曼光谱仪: 蛋白二级结构与构象蛋白二级结构与构象 生物膜结构生物膜结构9.库仑水分测定仪库仑水分测定仪 684KF 微量水分微量水分10.多功能荧光微板仪多功能荧光微板仪 SPECTRA MAX GEMINI XS 体外细胞活性体外细胞活性 残余残余DNA11.多功能酶标仪多功能酶标仪 SPECTRA MAX 190型型 体外细胞活性体外细胞活性 宿主蛋

10、白宿主蛋白12.液相色谱质谱仪液相色谱质谱仪 分子量分子量 质量肽图质量肽图13.不溶性微粒测定仪不溶性微粒测定仪 HIAC/ROYCO 8103型型 制剂中微粒制剂中微粒14.高效液相色谱仪高效液相色谱仪 岛津岛津 惠普惠普 沃特斯沃特斯 纯度与杂质检查纯度与杂质检查 效价与含量测定效价与含量测定 肽图谱肽图谱15.高效毛细管电泳仪高效毛细管电泳仪 肽图谱肽图谱 纯度纯度 含量含量16.液闪仪液闪仪 放免活性测定放免活性测定17.多角光散射仪多角光散射仪 多亚基蛋白多亚基蛋白 多糖多糖质控内容 结构确认 理化性质检测 纯度与杂质检查 含量测定 生物活性测定 效价测定 安全性检查主要质控技术

11、生化分析技术 生物学技术 (1)HPLC (1)HPLC法（分子筛、反相、疏水相互作用、阴离子交换、氨基柱）法（分子筛、反相、疏水相互作用、阴离子交换、氨基柱）鉴别和肽图谱测定（胰酶、鉴别和肽图谱测定（胰酶、V8V8酶、胃蛋白酶）；检查有关物质或高酶、胃蛋白酶）；检查有关物质或高分子蛋白或游离分子蛋白或游离PEGPEG；含量测定；含量测定； (2) (2) 多肽与蛋白质的多肽与蛋白质的Western-blottingWestern-blotting及其免疫学测定及其免疫学测定 (3)(3)等电聚焦法电泳法检测等电点和异构体；等电聚焦法电泳法检测等电点和异构体；（4）SDSSDSPAGEPAGE

12、法测定蛋白和多肽分子量和纯度；法测定蛋白和多肽分子量和纯度； (5)(5)底物法或凝块裂解法测定酶活性；底物法或凝块裂解法测定酶活性； (6)(6)分子杂交免疫法检测残余分子杂交免疫法检测残余DNADNA； (7)(7)免疫分析法检测免疫分析法检测E.coliE.coli肽或宿主蛋白；肽或宿主蛋白； (8) (8) 体外细胞培养法测定效价；体外细胞培养法测定效价；（9 9）高校毛细管电泳检测纯度；）高校毛细管电泳检测纯度；（10）银染）银染SDSPAGE法检测解离亚基或聚合物；法检测解离亚基或聚合物； 肽图谱测定与分析肽图谱测定与分析目的目的 鉴别蛋白质一级结构是否改变鉴别蛋白质一级结构是否改

13、变方法方法 裂解裂解-分离分离-检测检测 裂解：化学法裂解：化学法-溴化氢（溴化氢（Met羧基端，酸性条件）；羧基端，酸性条件）； 5，5-二硝基苯甲酸（二硝基苯甲酸（Cys,pH8.0）；）； 酶法酶法-专一性蛋白水解酶专一性蛋白水解酶 胰蛋白酶：胰蛋白酶：碱性碱性aa Arg 和和 Lys羧基端，羧基端，对对Arg-Pro,Lys-Pro健无作用健无作用 胰凝乳蛋白酶：胰凝乳蛋白酶：芳香族芳香族aa羧基端，羧基端， 内肽酶：内肽酶： Lys羧基端；羧基端； V8蛋白酶蛋白酶 ：酸性酸性aa Asp 和和Glu 羧基端羧基端（PBS，pH8.0） ， Asp-X （乙酸乙酸BS，pH84.0

14、） 梭菌蛋白酶：梭菌蛋白酶： Arg 羧基端，羧基端， 凝血酶：凝血酶：专一裂解专一裂解Arg-Gly键键 胃蛋白酶：胃蛋白酶： 肽段分离：肽段分离： HPLC：C18 C8 HPCE ：胶束，聚焦，区带，凝胶模式，：胶束，聚焦，区带，凝胶模式，SDS-PAGE：15%胶浓度，胶浓度，Tricine-三甲基甘氨酸，三甲基甘氨酸，肽段检测：肽段检测： 紫外检测器紫外检测器 214nm 肽图谱肽图谱 质谱检测器质谱检测器 肽段分子量肽段分子量 质量肽图质量肽图人胰岛素甘精胰岛素门冬胰岛素赖脯胰岛素地特胰岛素谷赖胰岛素生产企业多家企业Aventis 公司 丹麦Novo Nordisk公司美国Lill

15、y公司丹麦Novo Nordisk公司Aventis 公司商品名多种来得时Lantus 诺和锐NovoRapid优泌乐Humalog诺和平Levemir艾倍得Apidra分子式分子式C257H383N65O77S6C267H404N72O78S6C256H381N65O79S6C256H381N65O79S6C267H402N64O76S6C258H384N64O78S6分子量分子量5807.6960635825.85807.585916.95823等电点等电点5.46.75.15.45.45.1起效时间起效时间速效速效长效长效 长效长效 速效速效长效长效速效速效 人胰岛素与胰岛素类似物肽图分

16、析人胰岛素与胰岛素类似物肽图分析人胰岛素V8酶切位点示意图人胰岛素及其类似物的RP-HPLCRP-HPLC肽图谱 1.片段 2.片段 3.片段 4.片段 5.片段和的聚合 等电聚焦电泳分析等电聚焦电泳分析材料，试剂及仪器材料，试剂及仪器等电点标准蛋白、凝胶支持膜（等电点标准蛋白、凝胶支持膜（Gel Bond Gel Bond R R PAG film PAG film）、）、电泳电源（电泳电源（EPS 3500EPS 3500）、恒温水循环器（）、恒温水循环器（MultiTemp II MultiTemp II ）、）、水平电泳槽（水平电泳槽（Multiphor IIMultiphor II）

17、均为）均为Pharmacia Pharmacia 公司产品；电公司产品；电泳玻璃板及其固定装置（泳玻璃板及其固定装置（Bio-Rad Mini Bio-Rad Mini 型）。型）。实验方法实验方法溶液的配制溶液的配制 丙烯酰胺贮液丙烯酰胺贮液(10%) (10%) ； 过硫酸铵溶液过硫酸铵溶液(10% AP) (10% AP) ；电极液电极液 阴极液阴极液 ：1mol/L NaOH1mol/L NaOH；阳极液：；阳极液：1mol/L 1mol/L 磷酸。磷酸。甲基红指示液；固定液甲基红指示液；固定液 ；脱色液；脱色液；染色液染色液 考马斯亮蓝考马斯亮蓝G 0.1gG 0.1g，加脱色溶液，

18、加脱色溶液100ml100ml。等电点标准蛋白溶液的制备等电点标准蛋白溶液的制备 取一小瓶等电点标准蛋白，溶于取一小瓶等电点标准蛋白，溶于100l100l无离无离子水中，子水中，44存放待用。存放待用。样品溶液制备样品溶液制备 取取rhbFGFrhbFGF脱盐样品适量，用水配成脱盐样品适量，用水配成3mg/ml3mg/ml的溶液。取此的溶液。取此溶液溶液90l90l加加Amphline 10lAmphline 10l，甲基红指示液，甲基红指示液2l2l，混匀备用。，混匀备用。 凝胶的制备凝胶的制备玻璃板的处理玻璃板的处理 将水平制胶模具中的小玻璃板一面加几滴硅烷化试剂，用擦镜纸将水平制胶模具中

19、的小玻璃板一面加几滴硅烷化试剂，用擦镜纸均匀涂布于玻璃板表面，室温放置干燥后，用无离子水冲洗表面，去掉水滴，备用。均匀涂布于玻璃板表面，室温放置干燥后，用无离子水冲洗表面，去掉水滴，备用。制胶制胶 将凝胶支持膜疏水面一侧紧贴在大玻璃板上，膜两侧边缘放置隔片带将凝胶支持膜疏水面一侧紧贴在大玻璃板上，膜两侧边缘放置隔片带(0.5-(0.5-0.7mm)0.7mm)，将小玻璃板硅烷化处理的一面朝膜放在隔片带上，固定。凝胶液，将小玻璃板硅烷化处理的一面朝膜放在隔片带上，固定。凝胶液( (丙烯酰丙烯酰胺无离子水载体两性电解质胺无离子水载体两性电解质6.36.34.54.51.2)1.2)经充分脱气处理后

20、，加经充分脱气处理后，加1010APAP和和TEMED(0.03TEMED(0.03：0.06)0.06)，混匀，沿平板一端灌入，勿使产生气泡，凝胶凝固后，去，混匀，沿平板一端灌入，勿使产生气泡，凝胶凝固后，去掉玻璃板，待用。掉玻璃板，待用。预电泳预电泳 将制好的胶铺在电泳槽内冷却板中央，将制好的胶铺在电泳槽内冷却板中央，44预冷预冷3030分钟。将电极条分别用分钟。将电极条分别用阴、阳极电极液充分湿润，去掉多余电极液后，平行置于凝胶两端。电极垂直平置阴、阳极电极液充分湿润，去掉多余电极液后，平行置于凝胶两端。电极垂直平置于电极条上，保持适当的压力。于电极条上，保持适当的压力。200V200V

21、，预电泳，预电泳2020分钟。分钟。加样加样 先将滤纸片（先将滤纸片（0.5cm0.5cm0.5cm0.5cm）排放在距阴极端）排放在距阴极端2 2或或3cm3cm处，分别样品液、标处，分别样品液、标准液各准液各10l10l加在滤纸上。加在滤纸上。电泳电泳 先先200V200V恒压电泳恒压电泳20min20min后，恒流后，恒流8mA8mA，电压升至，电压升至550V550V后，再恒功率后，再恒功率12W12W电泳，电泳，当电压升至当电压升至1200V1200V时，停止电泳。时，停止电泳。固定与染色固定与染色 将胶片置于固定液中将胶片置于固定液中1 1小时，取出置脱色液中平衡小时，取出置脱色液

22、中平衡3030分钟，再置染色分钟，再置染色液中液中2020分钟，最后将胶片置脱色溶液中直至本底透明。分钟，最后将胶片置脱色溶液中直至本底透明。 2.2 2.2 凝胶的制备凝胶的制备 等电聚焦方法学的考虑等电聚焦方法学的考虑 等电聚焦分析的条件等电聚焦分析的条件 凝胶中有稳定的、连续的和凝胶中有稳定的、连续的和线性的线性的pHpH梯度。常用两性缓冲离子建立梯度。常用两性缓冲离子建立载体两性电载体两性电解质解质pHpH梯度；或是将缓冲基团成为凝胶介质的一部梯度；或是将缓冲基团成为凝胶介质的一部分即分即固相固相pHpH梯度。后者灌胶技术比较复杂，电泳时梯度。后者灌胶技术比较复杂，电泳时需要高电压，且

23、电泳时间长。需要高电压，且电泳时间长。原理原理 在支持介质中放入载体两性电介质，通以直在支持介质中放入载体两性电介质，通以直流电后，在两极之间形成稳定、连续和线性的流电后，在两极之间形成稳定、连续和线性的pHpH梯梯度。当带电的蛋白质分子进入此体系时，移动并聚度。当带电的蛋白质分子进入此体系时，移动并聚焦于相当其等电点的位置。由此可见，焦于相当其等电点的位置。由此可见，IEFIEF是依照是依照等电点的不同将蛋白质分子分离。根据蛋白带在等电点的不同将蛋白质分子分离。根据蛋白带在pHpH梯度中的位置可测得该蛋白质的等电点梯度中的位置可测得该蛋白质的等电点 。等电聚焦实验条件的考查等电聚焦实验条件的

24、考查支持介质支持介质 在分析在分析IEF中常用聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶作为支持介质。中常用聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶作为支持介质。前者适于分析分子量小于前者适于分析分子量小于30万蛋白质，后者适于分子量大至万蛋白质，后者适于分子量大至200万的大分子。万的大分子。我们用聚丙烯酰胺凝胶为支持介质，并考查了凝胶浓度为我们用聚丙烯酰胺凝胶为支持介质，并考查了凝胶浓度为3、5、9和和交联度为交联度为3时对结果的影响，实验中发现，时对结果的影响，实验中发现，3胶太软，难操作，胶太软，难操作， 而而9胶又较硬，易断裂，结果以胶又较硬，易断裂，结果以5T较合适。较合适。载体两性电介质载体两性电介质 是是I

25、EF最关键的试剂，它直接关系到最关键的试剂，它直接关系到pH梯度的形成梯度的形成以及蛋白带的聚焦。我们比较了市售产品以及蛋白带的聚焦。我们比较了市售产品Ampholine(LKB)、Pharmalyte(Pharmacia)和国产和国产Ampholine国产的试剂在有效期内使用可以达到国外同类产品的效果国产的试剂在有效期内使用可以达到国外同类产品的效果在凝胶和样品溶液中，载体两性电介质的最适浓度为在凝胶和样品溶液中，载体两性电介质的最适浓度为10。阳、阴极电极溶液阳、阴极电极溶液 作用是为了避免样品或载体在阳极氧化作用是为了避免样品或载体在阳极氧化或在阴极还原。电极液的选择会影响最终的或在阴极

26、还原。电极液的选择会影响最终的pH梯度，梯度，特别是在靠近电极条位置。我们比较了特别是在靠近电极条位置。我们比较了1mol/L的磷酸乙二胺、的磷酸乙二胺、NaOH-HPES、NaOH-H3PO4电极液，结果以电极液，结果以NaOH-H3PO4为最适。为最适。盐离子干扰盐离子干扰 pH梯度的形成并使蛋白带畸变。有些离子还会产生梯度的形成并使蛋白带畸变。有些离子还会产生高电流而导致烧胶样品中有盐（大于高电流而导致烧胶样品中有盐（大于0.1mol/L时），应先脱盐。时），应先脱盐。样品加样位置样品加样位置 影响聚焦效果，采用滤纸片加样法可把样品影响聚焦效果，采用滤纸片加样法可把样品加在凝胶上不同的位

27、置，对碱性蛋白而言，应靠阴极加样，加在凝胶上不同的位置，对碱性蛋白而言，应靠阴极加样，即两电极距离的即两电极距离的1/3处，有助于蛋白快速聚焦。处，有助于蛋白快速聚焦。pHpH梯度和梯度和pIpI的测定的测定 平板电泳胶可以用表面电极或等电点标准蛋白测定平板电泳胶可以用表面电极或等电点标准蛋白测定pHpH梯度。梯度。但前者需要昂贵的表面电极和但前者需要昂贵的表面电极和pHpH计，操作麻烦，干扰因素多，计，操作麻烦，干扰因素多， 常采用等电点标准蛋白测定常采用等电点标准蛋白测定pHpH梯度。以蛋白迁移距离为横座梯度。以蛋白迁移距离为横座标，等电点为纵座标，绘制标，等电点为纵座标，绘制pHpH梯度

28、曲线。由样品的迁移距离即梯度曲线。由样品的迁移距离即可求出其可求出其pIpI值。值。 线性回归方程为线性回归方程为 y=y=1.2593x+10.808 =0.99391.2593x+10.808 =0.9939。 由由IEFIEF图谱可见图谱可见rhbFGFrhbFGF样品聚焦在样品聚焦在9.39.3附近，附近， 由由pHpH梯度曲线得到的等电点为梯度曲线得到的等电点为9.49.4（n= 5n= 5，RSD%=1.0%RSD%=1.0%），）， 与文献值与文献值(pI=9.6)(pI=9.6)相比相比, ,重组重组rhbFGFrhbFGF的等电点偏低，这可能的等电点偏低，这可能是因为重组是因

29、为重组rhbFGFrhbFGF含有含有1717个氨基酸的融合蛋白，使其组成与天个氨基酸的融合蛋白，使其组成与天然然hbFGFhbFGF有差别。有差别。 rhbFGFrhbFGF的的IEFIEF图谱（见图图谱（见图1 1），），pHpH梯度曲线（见图梯度曲线（见图2 2）。）。rhbFGF IEF图谱图谱Lane 1,2,3：rhbFGF样品样品 Lane 4：等电点标准蛋白：等电点标准蛋白0246810120246迁移距离等电点pH梯度曲线梯度曲线3.504.555.205.856.556.857.358.158.458.659.3 rh-PTH(134)的的IEF电泳结果电泳结果 Resul

30、t of the IEF gel electrophoresislane1: pI marker pH3.5-9.3lane2: standard of PTH(134)lane35: samples of rh-PTH(134)SDS-PAGE 检测分析多肽与蛋白质检测分析多肽与蛋白质多肽分离多肽分离 TricineSDSPAGE 凝胶的配制凝胶的配制 浓缩胶浓缩胶 空间胶空间胶 分离胶分离胶 组成组成 16.5% 10% 4% 丙烯酰胺溶液丙烯酰胺溶液 1.0ml 6.1ml 10ml 凝胶缓冲液凝胶缓冲液 3.1ml 10ml 10ml 甘油甘油 2.0g 10%AP溶液溶液 80l 1

31、20l 120l TEMED 8l 12l 12l 加水至终体积加水至终体积 12.5ml 30ml 30ml分离原理分离原理 凝胶组成：浓缩胶、空间胶、分离胶。凝胶组成：浓缩胶、空间胶、分离胶。 浓缩胶的主要作用在于防止对流及浓缩样品，浓缩胶的主要作用在于防止对流及浓缩样品， 空间胶有助于提高分子量低于空间胶有助于提高分子量低于5KD5KD多肽的分辨率。多肽的分辨率。 在在pH6.88.8pH6.88.8范围内范围内,Tricine,Tricine（pK8.15pK8.15）作为尾随离子）作为尾随离子, , 在浓缩胶中具有较大的相对迁移率在浓缩胶中具有较大的相对迁移率, ,移动比甘氨酸快移动

32、比甘氨酸快, ,因此因此对样品的浓缩效应集中在低分子量范围。对样品的浓缩效应集中在低分子量范围。 多肽的分离效果与多肽的分离效果与3 3种胶的高度比有关，通过试验我们种胶的高度比有关，通过试验我们发现浓缩胶、空间胶、分离胶的高度比为发现浓缩胶、空间胶、分离胶的高度比为1:1:41:1:4比较合适。比较合适。 不同的起始电压也影响分离效果不同的起始电压也影响分离效果, , 我们试用了我们试用了80V80V和和35V35V，发现，发现35V35V更有利于多肽的分离。更有利于多肽的分离。凝胶染色方法，凝胶染色方法，银染法银染法 0.04-0.1ug0.04-0.1ug 灵敏度高，标准多肽分子量染色清

33、晰，但地龙、水蛭灵敏度高，标准多肽分子量染色清晰，但地龙、水蛭提取物银染后，背景较深，小分子蛋白难与其它着色物质提取物银染后，背景较深，小分子蛋白难与其它着色物质分开，这可能是由于提取物中所含糖类和其它物质干扰银分开，这可能是由于提取物中所含糖类和其它物质干扰银染。染。考马斯亮蓝考马斯亮蓝R-250R-250和和G-250 G-250 染色染色 0.2-.5ug0.2-.5ug R-250R-250：样品中小分子蛋白条带不易着色，这可能是受样品中小分子蛋白条带不易着色，这可能是受所含糖类物质的干扰。所含糖类物质的干扰。 G-250G-250：凝胶着色均匀，而且背景着色易脱去，显出清凝胶着色均匀

34、，而且背景着色易脱去，显出清晰的条带。晰的条带。电泳样品的处理电泳样品的处理1 还原还原SDS处理处理 在样品溶液加入在样品溶液加入SDS，还原剂，还原剂-巯基乙醇巯基乙醇:4-5%,有臭味有臭味 DTT:2-3%,无味，不会影响其他样品，无味，不会影响其他样品，100 3-5min, 有时还原剂可能被氧化，冷却后补加，以防蛋白质重新折叠和亚基的缔合，有时还原剂可能被氧化，冷却后补加，以防蛋白质重新折叠和亚基的缔合，加入加入EDTAEDTA可防止可防止DTTDTT氧化。氧化。2非还原非还原SDS处理处理 在样品溶液加入在样品溶液加入1%SDS， 100 3-5min, 二硫键未断二硫键未断裂，

35、不完全去折叠。裂，不完全去折叠。 3烷基化还原烷基化还原SDS处理处理 碘乙酰胺：保护巯基不被氧化，多巯基蛋白质测定的分子量略有碘乙酰胺：保护巯基不被氧化，多巯基蛋白质测定的分子量略有增加。增加。 蛋白印迹与免疫学测定蛋白印迹与免疫学测定应用应用 原料与制剂中不同蛋白组分的鉴别与定量原料与制剂中不同蛋白组分的鉴别与定量方法与原理方法与原理 将电泳分离的蛋白或多肽转移到固将电泳分离的蛋白或多肽转移到固定基质上，以特异性抗体为探针，它与附着于固定基质上，以特异性抗体为探针，它与附着于固定基质上靶蛋白或多肽发生特异性反应，对蛋白定基质上靶蛋白或多肽发生特异性反应，对蛋白或多肽电泳图谱上的特定组分进行

36、定性定量分析。或多肽电泳图谱上的特定组分进行定性定量分析。 实验步骤实验步骤 电泳转移封闭免疫检测电泳转移封闭免疫检测特点特点 将高分辨率的电泳技术与灵敏专一的免疫将高分辨率的电泳技术与灵敏专一的免疫探测技术结合起来。灵敏度探测技术结合起来。灵敏度1-5ng，蛋白质或多肽，蛋白质或多肽条带不会扩散，操作简便，试剂用量少，便于对条带不会扩散，操作简便，试剂用量少，便于对蛋白质或多肽进行各种分析。蛋白质或多肽进行各种分析。 关于实验上的一些考虑关于实验上的一些考虑1.电泳电泳 ： SDS对被分离组分活性的影响对被分离组分活性的影响2.固相纸膜：固相纸膜： NC膜膜 常用常用0.45um，分子量小于

37、，分子量小于20000时，时， 用小孔膜，用小孔膜，0.1-0.2um。还有尼龙膜，重氮苄氧甲基纤维膜。还有尼龙膜，重氮苄氧甲基纤维膜 3.转移：转移：缓冲液缓冲液离子强度，离子强度，pH值，稳定性，值，稳定性， Towbin缓冲液：缓冲液：tris-甘氨酸，甘氨酸，pH8.3，加，加甲醇甲醇20 甲醇作用：甲醇作用：解离解离SDS蛋白复合物中的蛋白复合物中的SDS，增强与膜，增强与膜 的结合能力。的结合能力。 电泳印迹电泳印迹 阳极阳极NC膜膜 凝胶阴极凝胶阴极 垂直槽式：垂直槽式：12Hr, 大量转移缓冲液，高场强，需冷却大量转移缓冲液，高场强，需冷却（）（）海绵垫滤纸海绵垫滤纸NC膜凝胶

38、滤纸海绵垫膜凝胶滤纸海绵垫（）（） 水平半干式：水平半干式：1.5-2h，低电流，少量转移缓冲液，低电流，少量转移缓冲液，（）（）板滤纸板滤纸NCNC膜凝胶滤纸版（）膜凝胶滤纸版（） 水平半干式转印水平半干式转印 取取6张滤纸浸泡于转移缓冲液中张滤纸浸泡于转移缓冲液中,取硝酸纤维取硝酸纤维膜膜(0.45m)一张浸泡于去离子水中一张浸泡于去离子水中, 510min；用；用水淋洗石墨板水淋洗石墨板,用纸巾擦干电极板上的液滴用纸巾擦干电极板上的液滴,将电将电泳后的胶片浸于转移缓冲液中。泳后的胶片浸于转移缓冲液中。 依次放置依次放置阳极板阳极板3层滤纸层滤纸硝酸纤维素膜硝酸纤维素膜电泳胶片电泳胶片3层

39、滤纸层滤纸阴极板。阴极板。 滤纸、纤维素膜和胶片应大小相同，每放一层滤纸、纤维素膜和胶片应大小相同，每放一层要精确对齐要精确对齐,各层之间不留气泡。各层之间不留气泡。 以以0.65mA/cm2设置电流设置电流, 恒流转移恒流转移1-2hr, 关闭关闭电源，停止转印。电源，停止转印。4.封闭封闭 用封闭试剂将膜上非蛋白结合区饱和，以减少非特异性用封闭试剂将膜上非蛋白结合区饱和，以减少非特异性结合，降低显色背景。结合，降低显色背景。 (2 m l(2 m l封闭液封闭液/c m2 )/c m2 ) 封闭试剂：封闭试剂：3%脱脂奶粉，脱脂奶粉，BSA，明胶，加入，明胶，加入0.3%吐温吐温20可改善

40、封闭效果可改善封闭效果5.蛋白多肽检测蛋白多肽检测 非特异性检测非特异性检测 了解分离情况，转印效果了解分离情况，转印效果 丽春红丽春红S染色染色显色短，能被洗去，不影响免疫显色显色短，能被洗去，不影响免疫显色 印度墨水总蛋白染色，显色久，便宜，灵敏度高印度墨水总蛋白染色，显色久，便宜，灵敏度高 氨基黑氨基黑10B，考马斯亮蓝，考马斯亮蓝影响免疫显色影响免疫显色 特异性检测特异性检测 加加 入入蛋白或多肽的抗体蛋白或多肽的抗体溶液溶液 , 4反应过夜反应过夜 , 用用Tris盐盐 溶溶 液液 洗洗 膜膜 3次次 , 每每 次次 10 m i n ；加；加 入入 酶酶 标标 抗抗 体体 溶溶 液

41、液 ，置置 室室 温温 反反 应应12 h r，洗，洗 膜膜 同同 前。取前。取 出出 膜膜 置置 显显 色色 液液中中,室温室温下显色，至下显色，至 出出 现现 色色 斑斑 ，用，用 水水 漂漂 洗洗 ，观，观 察察 结结 果果 。 标记酶标记酶 底物底物 显色显色 特点特点 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 BCIP/NBT 蓝紫色蓝紫色 显色久显色久辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶 DAB 棕色棕色 色易退色易退BCIP ：5溴溴4氯氯3吲哚磷酸吲哚磷酸NBT： 氮蓝四唑氮蓝四唑DAB： 3，3二氨基联苯胺二氨基联苯胺 甲状旁腺激素（甲状旁腺激素（parathyroid hormone，PTH）是维）是

42、维持机体血钙平衡的重要激素之一，其基本生理作用是持机体血钙平衡的重要激素之一，其基本生理作用是通过增加成骨细胞及破骨细胞数目，促进骨吸收及生通过增加成骨细胞及破骨细胞数目，促进骨吸收及生长。大量临床应用研究表明，长。大量临床应用研究表明，PTH是目前治疗骨质疏是目前治疗骨质疏松症的最重要药物之一松症的最重要药物之一 。 目前应用于临床研究的主要有目前应用于临床研究的主要有hPTH (1-84)、(1-38)及及(1-34)片段，均为基因工程产品。片段，均为基因工程产品。 有关此类产品的质控方法有关此类产品的质控方法 研究重点：研究重点： 生物学活性生物学活性 肽含量测定肽含量测定 国际标准品国

43、际标准品 同一性鉴别同一性鉴别 杂质分析杂质分析 理化对照品理化对照品氨基酸分析方法氨基酸分析方法柱前衍生法： PITC衍生法 OPA-FMOC衍生法 AQC衍生法 DNFB衍生法柱后衍生法: 茚三酮衍生检测法 OPA衍生检测法直接分析法： 电化学检测法 蒸发光散射检测法方法及灵敏度的比较：方法及灵敏度的比较：1 柱后茚三酮衍生的自动分析仪法 （50-100 ng）2 柱后OPA衍生的自动分析仪法 （15 ng）3 柱前异硫氰酸苯酯衍生法 （100-150 ng）4 柱前OPA衍生法 （3 ng）5 柱前AQC衍生法 （10 ng）6 柱前2.4-二硝基氟苯衍生法 （ 100 ng）7 DAB

44、S-Cl衍生法 （10 ng）8 柱前FMOC-Cl法 （2 ng）Agela XBP-C18 柱柱 甲状旁腺激素生物学活性测定方法甲状旁腺激素生物学活性测定方法酶标法酶标法放免法放免法化学发光法化学发光法荧光分析法荧光分析法大鼠骨肉瘤细胞株大鼠骨肉瘤细胞株UMR-106UMR-106人甲状旁腺激素（人甲状旁腺激素（1-341-34）国际标准品）国际标准品测定原理测定原理 hPTHhPTH可以刺激UMR-106细胞株细胞内cAMP水平升高，故测定细胞内cAMP水平，可作为其生物活性检测的指标。 hPTH与其细胞膜上的受体结合，通过G蛋白等信号传导系统，激活腺苷酸环化酶，在腺苷酸环化酶的作用下A

45、MP环化形成cAMP， 造成细胞中二级信使cAMP含量增加，利用竞争性抑制反应，cAMP可以与 cAMP依赖的蛋白激酶发生特异性结合，通过测定cAMP水平，可反映hPTH的生物学活性。 加入一定量标记的cAMP与 cAMP依赖的蛋白激酶结合形成带标记性的复合物，但同时加入未标记的cAMP时，cAMP就可以与 标记的cAMP发生竞争，竞争性的与cAMP依赖的蛋白激酶结合。竞争性结合的结果使得形成的带标记性的cAMPcAMP蛋白激酶结合物减少。其中，未标记的cAMP就是cAMP标准品或所需测定的cAMP。通过测定cAMPcAMP蛋白激酶复合物的信号强度，并与标准品相比，就可得到待测样品中cAMP的

46、含量。 测定方法 将rh-PTH134作用于靶细胞株UMR-106-01，然后提取细胞的总cAMP，通过竞争性抑制标记的cAMP与结合蛋白的结合，造成检测信号的改变来测定细胞总cAMP的含量，用空白对照校正，并与h-PTH134国际标准品比较来计算样品的生物活性。根据cAMP标准品的cAMP值，作出cAMP标准曲线，并根据cAMP标准曲线方程计算出各点的cAMP值，采用计算机程序或直线回归计算法对各点cAMP值的数据进行处理，计算出待测样品的半效稀释倍数，并按下式公式计算结果： 待测样品效价标准品效价 标准品预稀释倍数待测样品预稀释倍数标准品半效稀释倍数待测样品半效稀释倍数-0.50.00.5

47、1.01.52.02468101214Chi20.0482Initial(A1)2.4939 0.12951Final (A2)12.408230.13782EC50 (x0)0.650980.01079Slope (p)4.469630.54988 stY Axis TitleX axis title-0.50.00.51.01.52.024681012Chi20.08403Initial(A1)2.596460.15525Final (A2)12.955841.1598EC50 (x0)1.288120.05931Slope (p)2.157120.38901 QY Axis TitleX axis titlerhPTH生物学活性测定生物学活性测定 反应曲线反应曲线