分子流行病学的研

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1、概述概述l定义定义l分子流行病学研究进展分子流行病学研究进展l分子流行病学在医院感染控制中的应用分子流行病学在医院感染控制中的应用分子流行病学定义分子流行病学定义分子流行病学是应用先进的实验技术测量分子流行病学是应用先进的实验技术测量生物学标志，结合流行病学现场研究方法生物学标志，结合流行病学现场研究方法，从分子水平阐明疾病的病因及其相关的，从分子水平阐明疾病的病因及其相关的致病过程。致病过程。传统流行病学传统流行病学l应用血清学方法对血清中各种成分（抗原、应用血清学方法对血清中各种成分（抗原、抗体、代谢产物、生化物质等）的出现和抗体、代谢产物、生化物质等）的出现和分布进行研究，阐明疾病及健康

2、状态在人分布进行研究，阐明疾病及健康状态在人群中的分布及其影响因素，并在采取预防群中的分布及其影响因素，并在采取预防控制措施后应用血清学方法来考核其效果。控制措施后应用血清学方法来考核其效果。传统流行病学传统流行病学 暴露暴露 疾病疾病 揭示揭示“黑匣子黑匣子”秘密秘密分子流行病学分子流行病学传染性疾病传染性疾病 耐药性质粒、病原体变异、新传染病耐药性质粒、病原体变异、新传染病慢性非传染病慢性非传染病 证实疾病的病因证实疾病的病因 多病因、多阶段、多基因、长潜隐期多病因、多阶段、多基因、长潜隐期 人群易感性人群易感性- 研究个体的发病差异研究个体的发病差异 生物个体间的遗传和环境不同，易感性差

3、异很大生物个体间的遗传和环境不同，易感性差异很大 ， 传统传统流行病学无法有效测量流行病学无法有效测量分子流行病学的产生分子流行病学的产生分子生物学的快速发分子生物学的快速发展展l理论突破理论突破 断裂基因，操纵子断裂基因，操纵子模型，限制性内切酶，模型，限制性内切酶，DNA聚合酶等聚合酶等l技术创新技术创新 凝胶电泳技术、核酸凝胶电泳技术、核酸体外扩增、体外扩增、DNA测序、测序、蛋白质测序、分子杂蛋白质测序、分子杂交等交等分子流行病学的发展轨迹分子流行病学的发展轨迹1972年年Kilbone博士美国传染病学会第博士美国传染病学会第10次年会上首次提出次年会上首次提出1982年年Perera

4、提出提出“癌症分子流行病学癌症分子流行病学”1993年美国人年美国人Schulte出版了世界上第一本分子流行病学专出版了世界上第一本分子流行病学专著，即著，即“分子流行病学分子流行病学”应用分子标志物或生物学测量研究致病因子与所致疾病之间应用分子标志物或生物学测量研究致病因子与所致疾病之间的联系。的联系。A 研究方法拓展研究方法拓展B 研究范围拓宽研究范围拓宽分子流行病学和传统流行病学的分子流行病学和传统流行病学的关系关系区别点区别点传统流行病学传统流行病学分子流行病学分子流行病学暴露测量回忆偏倚往往难以避免；用传统的问卷调查难于解决暴露随时间变化，或多途径暴露，符合暴露等。采用生物标志物则可

5、解决这些问题暴露测量精确研究对象选择又选择偏倚减少错分集体损害在损害达到相当程度时才能鉴别出采用生物标志：可提前发现机体损害有利于研究低暴露的影响个体易感性不能测量能测量观察的终点可将观察的终点前移可增加队列研究终点人数分子流行病学与医院感染控制分子流行病学与医院感染控制 -细菌同源性分析研究在感细菌同源性分析研究在感控中的应用控中的应用手术伤口感染！手术伤口感染！ 院内感染？院内感染？导管相关性血流感染！导管相关性血流感染！呼吸机相关性肺炎！呼吸机相关性肺炎！医院感染医院感染 医院感染是当前医疗卫生的重大问题之一，医院感染是当前医疗卫生的重大问题之一，由于院内感染密切关系到医疗服务质量，由于

6、院内感染密切关系到医疗服务质量，关系到病人的预后、病死率、住院时间、关系到病人的预后、病死率、住院时间、床位周转率以及病人和国家的巨额经济损床位周转率以及病人和国家的巨额经济损失等。因而，院内感染的控制问题已列为失等。因而，院内感染的控制问题已列为国家乃至世界各国医院管理的重要内容。国家乃至世界各国医院管理的重要内容。医院感染的常规检测项目医院感染的常规检测项目医院感染病例监测医院感染病例监测医院环境卫生学监测医院环境卫生学监测消毒灭菌效果监测消毒灭菌效果监测医院感染爆发定义医院感染爆发定义指在医疗机构或某科室的患者中短时间内指在医疗机构或某科室的患者中短时间内发生发生3例以上同种同源感染病例

7、的现象例以上同种同源感染病例的现象 同一种病原体，药敏一致同一种病原体，药敏一致院内感染控制院内感染控制院内感染的研究中，一个很重要的问题，院内感染的研究中，一个很重要的问题，就是如何确定感染源和传播途径，只有明就是如何确定感染源和传播途径，只有明确病原菌的感染方式，才能采取有效的预确病原菌的感染方式，才能采取有效的预防和控制措施。防和控制措施。 临床微生物实验室临床微生物实验室 基础基础微生物检验学微生物检验学 分子流行病学分子流行病学 方法方法 院内感染控制院内感染控制 目的目的 临床诊断临床诊断 基础基础15分子分型（分子流行病学研究）分子分型（分子流行病学研究）从核酸分子水平上分析医院

8、感染的发生、发展规律及机理，从核酸分子水平上分析医院感染的发生、发展规律及机理，更加准确有效地进行医院感染管理控制，已成为当前国际医更加准确有效地进行医院感染管理控制，已成为当前国际医院感染管理研究中的重要方向。院感染管理研究中的重要方向。 从患者分离株到病区周围环境株的比较分析； 从外源性感染到内源性感染 从某一医院的医院感染暴发到大范围甚至世界范围的感染菌株流行变迁；基因多态性分析技术已成为医院感染监测控制的高水平研究领域。微生物室在医院感染中的作用微生物室在医院感染中的作用鉴定鉴定特殊耐药菌的检出特殊耐药菌的检出流行病学分型流行病学分型 PFGE 脉冲场凝胶电泳脉冲场凝胶电泳 RAPD

9、随机扩增随机扩增DNA多态性多态性 17消化、释放出消化、释放出DNADNAPFGE原理18Enzyme酶切酶切PFGEPFGE原理原理约520个、长度10800kb的大片段DNA19脉冲场凝胶电泳脉冲场凝胶电泳(PFGE)PFGE原理原理l电场不断在两种方向（有一定夹角，而不是相反电场不断在两种方向（有一定夹角，而不是相反的两个方向）变动。的两个方向）变动。DNA分子带有负电荷，会朝分子带有负电荷，会朝正极移动。相对较小的分子在电场转换后可以较正极移动。相对较小的分子在电场转换后可以较快转变移动方向，而较大的分子在凝胶中转向较快转变移动方向，而较大的分子在凝胶中转向较为困难。因此小分子向前移

10、动的速度比大分子快为困难。因此小分子向前移动的速度比大分子快l可以用来分离大小从可以用来分离大小从10kb到到10Mb的的DNA分子分子21脉冲电泳PFGE原理原理22PFGEPFGE结果判读结果判读目测法：目测法：按美国疾病控制和预防中心按美国疾病控制和预防中心( (CDC)TenoverCDC)Tenover等人推荐的方等人推荐的方法判读。法判读。图谱完全相同的定为图谱完全相同的定为一个型一个型，彼此之间相差一个带的定，彼此之间相差一个带的定为同一型的为同一型的不同亚型不同亚型，相差，相差2 23 3个带的认为个带的认为亲缘关系密亲缘关系密切切，相差，相差4 46 6个带的认为个带的认为可

11、能相关可能相关，条带相差，条带相差7 7个以上的个以上的认为认为无亲缘关系无亲缘关系。并随机地选择不同的字母如。并随机地选择不同的字母如A A、B B、C C、D D等的字母顺序分型。等的字母顺序分型。 聚类分析聚类分析计算机输入计算机输入SPSSSPSS，做树状图做树状图案例一案例一2006年年7月，本市某医院外科重症监护病月，本市某医院外科重症监护病房（房（ICU）8例患者下呼吸道感染多重耐药例患者下呼吸道感染多重耐药鲍曼不动杆菌鲍曼不动杆菌目标性检测目标性检测对该对该ICU的环境、医疗用品、医务人员手及的环境、医疗用品、医务人员手及鼻咽拭子进行细菌学监测，共采样鼻咽拭子进行细菌学监测，共

12、采样107份，份，其中其中23份检出鲍曼不动杆菌，阳性率份检出鲍曼不动杆菌，阳性率21.3%。主要分布在医务人员手、咽部及。主要分布在医务人员手、咽部及床头柜、输液泵、监护仪、治疗车、地面床头柜、输液泵、监护仪、治疗车、地面、病人用物等环境和医疗用品。、病人用物等环境和医疗用品。院感爆发流行的控制院感爆发流行的控制空气消毒空气消毒 15%过氧乙酸铵过氧乙酸铵2g/m3用量进用量进 行蒸熏及臭氧消毒行蒸熏及臭氧消毒物表消毒物表消毒 地面、台面地面、台面0.5%过氧乙酸拖擦过氧乙酸拖擦 消毒消毒医疗用品消毒医疗用品消毒 高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌 0.5%过氧乙酸浸泡消毒过氧乙酸浸泡消毒感染患者感染

13、患者 隔离治疗隔离治疗 ，分组护理，分组护理医务人员咽部带菌者医务人员咽部带菌者 每日每日2-3次呋喃西林次呋喃西林滴鼻，口泰嗽口滴鼻，口泰嗽口案例二案例二2006年我市某院发现了一例携带耐碳青霉年我市某院发现了一例携带耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌（痰，血）的患者烯肺炎克雷伯菌（痰，血）的患者为了防止该耐药菌在医院内的播散，对该为了防止该耐药菌在医院内的播散，对该病区进行目标性监测病区进行目标性监测四株肺炎克雷伯菌的药敏四株肺炎克雷伯菌的药敏 12 3 4亚胺培南亚胺培南16161616厄他培南厄他培南16161616头孢西丁头孢西丁=64=64=64=64头孢匹汚头孢匹汚=64=64=64=64头

14、孢曲松头孢曲松=4=4=4=4妥布霉素妥布霉素4444头孢他啶头孢他啶=16=16=16=16氨曲南氨曲南=64=64=64=64头孢他啶头孢他啶=64=64=64=64环丙沙星环丙沙星=64=64=64=64哌拉西林他唑巴坦哌拉西林他唑巴坦 =128=128=128=128左氧氟沙星左氧氟沙星=64=64=64=64氨苄西林氨苄西林=32=32=32=32氨苄西林，舒巴坦氨苄西林，舒巴坦 =32=32=32=32KB(mm）2163219320852011多粘菌素多粘菌素B20202120美罗培南美罗培南15151515头孢哌酮头孢哌酮 舒巴坦舒巴坦6666耐药菌的基因型分析耐药菌的基因型分

15、析l1.为阳性对照（为阳性对照（KPC-2)l2.肺克（患者痰）肺克（患者痰）l3.肺克（患者血）肺克（患者血）l4.肺克（隔壁床患者痰）肺克（隔壁床患者痰）l5.肺克（病房拖把）肺克（病房拖把）l6.为阴性对照为阴性对照lMark聚类分析聚类分析院感及时控制因素院感及时控制因素l及时发现及时发现 l医务人员的重视医务人员的重视lICU 环境因素环境因素(单房间单房间,单独护理单独护理)l环境的消毒措施有效环境的消毒措施有效l半年内未出现耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌半年内未出现耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌KPC酶酶l水解亚胺培南或美罗培南（水解亚胺培南或美罗培南（是目前临床上控制革兰阴是目前临床上控制革兰

16、阴性菌感染的最有效的抗菌药物）性菌感染的最有效的抗菌药物）的一类的一类内酰胺酶内酰胺酶l属于功能分类法的属于功能分类法的2f组，组，A类，可被克拉维酸抑类，可被克拉维酸抑制，不被乙二胺四乙酸（制，不被乙二胺四乙酸（EDTA）所抑制）所抑制l现已报道的现已报道的KPC亚型共亚型共12种亚型种亚型 l在中国主要见于浙江在中国主要见于浙江产产KPC酶耐药菌的传播酶耐药菌的传播l研究认为，研究认为，blaKPC位于一种新型的位于一种新型的Tn3型的转座型的转座子子Tn4401上，上，l其转座子的结构是其转座子的结构是KPC基因转移的原因基因转移的原因l这种新型的转座子结构可以使这种新型的转座子结构可以

17、使blaKPC从其原始位从其原始位置转移至各类不同的质粒置转移至各类不同的质粒l同时认为转座子同时认为转座子Tn4401是一个复合转座子，由是一个复合转座子，由2次序列插入形成次序列插入形成产产KPC酶耐药菌酶耐药菌l有限的有限的DNA指纹和脉冲凝胶电泳资料显示产指纹和脉冲凝胶电泳资料显示产KPC酶的肠杆菌科细菌易发生医院感染的暴发流行酶的肠杆菌科细菌易发生医院感染的暴发流行l最早在美国、特别在美国的东北部各州蔓延，并最早在美国、特别在美国的东北部各州蔓延，并造成局部地区暴发流行造成局部地区暴发流行l以后几年再世界各地都有报告以后几年再世界各地都有报告脉冲场凝胶电泳（脉冲场凝胶电泳（PFGE)

18、l对基因组的对基因组的DNA酶切片段多态性进行同源酶切片段多态性进行同源性分析，是短期院内感染爆发流行判断的性分析，是短期院内感染爆发流行判断的金标准金标准l是一种分离大分子是一种分离大分子DNA的方法的方法耐碳青酶烯肠杆菌科细菌耐碳青酶烯肠杆菌科细菌l2007年下半年零星出现年下半年零星出现(肺克肺克)l2010年年1-8月收集到月收集到18株株.包括肺克克雷伯包括肺克克雷伯菌（菌（15）大肠埃希菌（）大肠埃希菌（1）阴沟肠杆菌（）阴沟肠杆菌（1）枸橼酸杆菌（枸橼酸杆菌（1）产产KPC-2肺克同源性分析肺克同源性分析(2010.1-8)流行病学分析流行病学分析lA型传播源头型传播源头:患者来

19、自上海某医院，转至我院重症监护室，患者来自上海某医院，转至我院重症监护室，入院次日做痰培养，检出亚胺培南耐药的肺克。后转入康入院次日做痰培养，检出亚胺培南耐药的肺克。后转入康复科，耐药菌一直被检测到。复科，耐药菌一直被检测到。A型患者分布于重症监护室，型患者分布于重症监护室，康复科，血液科。康复科，血液科。lB型和型和C型的七名患者住我院某外科。型的七名患者住我院某外科。B型的五名患者在分型的五名患者在分离出该耐药菌前未使用过碳青霉烯类抗生素，推测是院内离出该耐药菌前未使用过碳青霉烯类抗生素，推测是院内环境感染所致环境感染所致lC型的两名患者，源头的患者住院时间长达型的两名患者，源头的患者住院

20、时间长达121天，在分天，在分离出该菌之前，美罗培南使用时间近二十天，推测离出该菌之前，美罗培南使用时间近二十天，推测C型可型可能是抗生素筛选的结果。能是抗生素筛选的结果。 PFGE的局限性的局限性l无法判断无法判断2006年产年产KPC酶肺克的小范围流酶肺克的小范围流行与行与2010年出现的年出现的15株产株产KPC酶的肺克酶的肺克A,B,C,三个克隆间有无同源性三个克隆间有无同源性l不同实验室间的分型结果不能进行比较不同实验室间的分型结果不能进行比较多位点序列分型多位点序列分型(Multilocus sequence typing,MLSTl一种基于核酸序列测定的细菌分型方法一种基于核酸序

21、列测定的细菌分型方法l通过通过PCR扩增管家基因内部片段扩增管家基因内部片段l测定其序列，分析菌株的变异测定其序列，分析菌株的变异MLST的原理的原理l一般测定一般测定610个管家基因内部个管家基因内部400600bp的核苷酸序列，每个位点的序列根据其发的核苷酸序列，每个位点的序列根据其发现的时间顺序赋予一个等位基因编号，每现的时间顺序赋予一个等位基因编号，每一株菌的等位基因编号按照指定的顺序排一株菌的等位基因编号按照指定的顺序排列就是它的等位基因谱列就是它的等位基因谱 ，也即是这株菌的，也即是这株菌的序列型（序列型（sequence type,ST）。这样得到）。这样得到的每个的每个ST均代

22、表一组单独的核苷酸序列信均代表一组单独的核苷酸序列信息息 。序列型（序列型（ST)l序列型（序列型（ Sequence-typying, STs ）等同于）等同于MLEE得出的电泳型得出的电泳型(Electrophoretic type, ET）l通过比较通过比较ST可以发现菌株的相关性可以发现菌株的相关性,即密切相关菌即密切相关菌株具有相同的株具有相同的ST或仅有极个别基因位点不同的或仅有极个别基因位点不同的ST,而不相关菌株的而不相关菌株的ST至少有至少有3个或个或3个以上基因位点个以上基因位点不同不同MLST的分析方法的分析方法lMLST技术针对看家基因设计引物对其进行技术针对看家基因设计引物对其进行PCR扩扩增和测序增和测序,得出每个菌株各个位点的等位基因数值得出每个菌株各个位点的等位基因数值l然后进行等位基因图谱然后进行等位基因图谱(allelic profile)或序列类或序列类型型(sequence types, STs)鉴定鉴定l再根据等位基因图谱使用配对差异矩阵再根据等位基因图谱使用配对差异矩阵(matrix pair-wise differences)等方法构建系统树图进行等方法构建系统树图进行聚类分析聚类分析谢谢qadchhyahoo