酒精酵母.doc

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1、 一株耐酒精的酵母菌株的诱变育种四 川 理 工 学 院设计（论文）题目： 一株耐酒精的酵母菌株的诱变育种 1毕业设计（论文）的主要内容及基本要求1大曲中分离及纯化酵母菌。2紫外线诱变，氯化锂诱变和紫外线与氯化锂复合诱变。3分别对诱变菌的发酵性能和产气情况的测定。2指定查阅的主要参考文献及说明1酿造酒工艺学（第二版） 中国轻工业出版社 顾国贤主编2微生物学（第二版） 高等教育出版社 周德庆主编3微生物学实验指导 高等教育出版社 黄秀梨主编4现代微生物遗传学化学工业出版社 陈三凤 刘德虎 编著3进度安排设计（论文）各阶段名称起 止 日 期1文献检索：收集资料、撰写开题报告2009.03.23-20

2、09.03.292文献、资料查阅整理，撰写文献综述2009.03.30-2009.04.05 3拟订实验方案，提出实验条件及需求2009.04.06-2009.04.114实验仪器及药品的准备 2009.04.11-2009.05.125实验实施，现象观察并做好数据记录2009.04.13-2009.05.20 6分析实验结果，整理数据2009.05.21-2009.05.28 7撰写论文、修改论文2009.05.29-2009.06.108论文定稿、打印 、准备及答辩2009.06.10-2009.06.17 注：本表在学生接受任务时下达一株耐酒精的酵母菌株的诱变育种 本文主要介绍了耐酒精酵

3、母的诱变育种，通过诱变得到高发酵力和高耐酒精性能的酵母菌。本实验拟从大曲中分离及纯化得到具有发酵产酒精能力的酵母菌种,并以该菌作为出发菌株,首先分别通过紫外光诱变，氯化锂诱变和紫外光与氯化锂复合诱变，然后分别测试诱变后的酵母菌株的酒精发酵及耐酒精性能，从而筛选得到高发酵能力及高耐酒精度的酵母菌株。关键词：酵母菌；耐酒精；紫外线；氯化锂；复合诱变目 录摘 要.IABSTRCT.II目 录. 前 言1第一章 实验仪器与材料31.1 仪器与设备31.2 材料与试剂31.3 实验试剂的配制41.4 培养基的配制5第二章 实验内容与方案62.1 大曲中酿酒酵母的分离62.2 出发菌株的能力测定7 2.3

4、 紫外线诱变酵母菌.8 2.4 氯化锂诱变酵母菌.10 2.5 紫外线-氯化锂复合诱变酵母菌.13第三章 实验结果与讨论153.1实验结果153.2 实验讨论35第四章 结 论.39第五章 综 述.41参考文献.44致 谢46附 录.47表目录表2-1 不同酒精浓度下的无水乙醇加入情况 .7表2-2a不同酒精浓度下的无水乙醇加入情况.9表2-2b不同酒精浓度下的无水乙醇加入情况.10表2-3 不同质量分数下的氯化锂用量情况.11表2-4 不同酒精浓度下的无水乙醇加入情况 .12表2-5a 不同酒精浓度下的无水乙醇加入情况.13表2-5b 不同酒精浓度下的无水乙醇加入情况.14 表3-1 出发酵

5、母菌在不同乙醇体积分数下的产气情况.16表3-2 出发酵母菌的二氧化碳失重情况.17表3-3 出发酵母菌的发酵醪液酒精浓度情况.17表3-4 紫外线照射酵母菌的致死情况.18图3-5 紫外线诱变酵母菌的致死曲线.19表3-6a 紫外线诱变后的酵母菌的产气情况.21表3-6b 紫外线诱变后的酵母菌的产气情况.21表3-7 紫外线诱变后的酵母菌的二氧化碳失重情况.24表3-8 紫外线诱变后的酵母菌的发酵醪液酒精浓度情况.24表3-9 氯化锂诱变酵母菌的致死情况.25图3-10 氯化锂诱变酵母菌的致死曲线.26表3-11氯化锂诱变后的酵母菌的产气情况.28表3-12 氯化锂诱变后的酵母菌的二氧化碳失

6、重情况.29表3-13氯化锂诱变后的酵母菌的发酵醪液酒精浓度情况.29表3-14a 复合诱变后的酵母菌的产气情况.31表3-14b 复合诱变后的酵母菌的产气情况.31表3-14c 复合诱变后的酵母菌的产气情况.31表3-15 复合诱变后的酵母菌的二氧化碳失重情况.34表3-16 复合诱变后的酵母菌的发酵醪液酒精浓度情况.34图目录图3-1 酵母菌出发菌的菌落形态.15图3-2 出发酵母菌的产气情况.16图3-3 紫外线诱变后的酵母菌.20图3-4a 紫外线诱变后的酵母菌的产气情况.22图3-4b 紫外线诱变后的酵母菌的产气情况.23图3-5 氯化锂诱变后的酵母菌.27图3-6 氯化锂诱变后的酵

7、母菌的产气情况.28图3-7 复合诱变后的酵母菌.30图3-8a 复合诱变菌产气情况.32图3-8b 复合诱变菌产气情况.33随着世界经济的发展与繁荣，石油的消耗越来越多，以至于它成为了维系世界经济与发展的命脉,然而现在全世界的石油储备越来越少，且由于它是不可再生的资源，消耗之后就会消失，故开发一种新型的石油的替代产品,已经是迫在眉睫，而且已经成为了世界各国能源研究的主要问题。酒精作为能源替代品, 与石油相比具有可再生、污染小、可减少温室效应等优点,是世界公认的可再生环保新型能源之一。目前,世界各国的燃料酒精工业正在蓬勃的发展。由于在酒精生产工艺中,提高成熟醪的酒精浓度可以降低蒸馏时的能耗,提

8、高设备利用率1,因此企业对如何提高发酵酒精浓度予高度重视。但是酒精对酵母菌本身是有一定的毒性的,当酒精度达到一定浓度时,会抑制酵母菌的生长、细胞发育以及酒精发酵的能力2。但是企业为了多产酒精,发酵时就会尽可能地提高成熟醪的酒精度,而酒精含量对酵母菌的生长影响很大,普通酵母在乙醇浓度达10%左右时,发酵完全受到抑制,所以在浓醪发酵时,有必要选用酒精耐性高的酵母菌，研究酵母菌的酒精耐受性机制以及开发出更高的耐酒精度的酒精高产酵母菌对于解决这一问题意义重大,同时也是目前酒精发酵领域的一个重要研究方向。 然而产酒精酵母在白酒酿造中应用广泛,由于一般采用斜面保藏法, 在低温条件下仍能进行缓慢的生理代谢,

9、 难免出现逐渐退化,细胞数及产酒能力大幅度下降。采用单细胞分离纯化的生产育种方法,一般能得到保持或稍优于原种性能的菌株, 但对于退化严重的菌种来说, 很难恢复原先水平,更别说分离到高产菌株3。采用诱变育种, 以解决传统生产育种无法解决的难题, 采取基因突变的方式筛选正向突变的菌株,结合现有的试验条件,得到更高耐酒精度的酵母菌是一条有效的途径。 本文拟从大曲中分离得到具有发酵产酒精能力的酵母菌,并以该菌为出发菌株,采用不同的诱变方法对出发菌进行诱变，分别采用了紫外线辐射的物理诱变法，氯化锂化学诱变发和紫外光与氯化锂的物理与化学复合诱变的方法，然后分别测试不同诱变方法诱变后的菌种的酒精发酵及耐酒精

10、度性能。对耐酒精度的测试本文采用了装麦芽汁液体培养基与试管中并装入杜氏小管，灭菌后分别按不同的乙醇体积分数加入无水乙醇，进行产气试验并观察现象；对酒精发酵力的测试则采用了二氧化碳失重法，发酵后分别测量其失重，从而测出发酵力。通过对比记录的数据筛选出高耐酒精度的菌株。从而就可以得到更高发酵能力和更高耐酒精度的酵母菌种。 综上所述,通过诱变育种得到更高的耐酒精度的酵母菌种,从而提高了酵母菌的耐酒精性能和酒精发酵力，这样可以更好地适合浓醪酒精发酵的要求,更加有利酒精的生产，提高酒精的产量，同时也为酒精发酵工业带来显著的经济效益。第1章 实验仪器与材料1.1 仪器与设备AR1140电子分析天平 梅特勒

11、.托利多仪器（上海）有限公司HH-S型电热恒温水浴锅 江苏省金坛市正基仪器有限公司 LHS-250SC恒温培养箱 上海齐欣科学仪器有限公司YX-280B型手提式压力蒸汽消毒器 江阴滨江医疗设备厂 SW-CJ-IF净化工作台 苏州安泰空气技术有限公司202-3AB电热恒温干燥箱 天津市泰斯特仪器有限公司BCD-185E/G冰箱 青岛海尔股份有限公司GEN/US3 漩涡混匀器 USAZHWY-1102C摇床 上海智城分析仪器制造有限公司菌落计数仪 杭州迅数科技有限公司 78HW-1型恒温磁力搅拌器 金坛市医疗仪器厂 8W紫外灯 中国南京紫光电器有限责任公司 显微镜 麦克奥迪仪器设备公司BP-型托盘

12、天平 上海医用激光仪器厂100mL、250mL、1000mL、2000ml烧杯，玻璃棒，1ml,2ml,5mL、10mL移液管， 250mL锥形瓶，100mL滴瓶，滴管，棉塞，涂布棒，研钵，试管架，铁架台， 细纱布，洗耳球，接种针，血球计数板，酒精灯，试管，平皿，牛皮纸，杜氏小管，PH试纸，麻绳,记号笔，密度计（1.0-1.1），酒精计（0-40度）等。 1.2 材料与试剂1.2.1 材料酒曲 四川理工学院微生物实验室马铃薯 市售干麦芽粉 市售1.2.2 试剂无水乙醇（AR） 重庆川东化工（集团）有限公司化学试剂厂氯化锂（AR） 成都科龙化工试剂厂酵母膏 北京奥博生物技术有限责任公司NH4CL

13、（AR） 重庆北碚化学试剂厂MgSO4.7H2O（AR） 成都科龙化工试剂厂KH2PO4（AR） 重庆北碚化学试剂厂牛肉膏 上海化学试剂采购供应站蛋白胨 北京奥博生物技术有限责任公司NaCl（AR） 成都科龙化工试剂厂 葡萄糖 重庆北碚化学试剂厂琼脂 海南省琼海市梦圆琼胶卡拉胶食品有限公司硫酸（AR） 重庆川东化工(集团)有限公司化学试剂厂美蓝 重庆北碚化学试剂厂KOH（AR） 成都科龙化工试剂厂1.3 实验试剂的配制1.3.1 0.1%美蓝染色液的配制4： 美蓝酒精饱和液（0.3g美蓝溶于30mL95%酒精中）30mL与氢氧化钾溶液（0.1g/L)100mL两液混合，摇匀。1.3.2 0.1

14、molL硫酸配制： 计算：查数据：98%的浓硫酸密度1.84g/ml3,根据H2SO4分子式知道,当量浓度是摩尔浓度的2倍(SO42-),所以,克当量为98/2=49,设取浓硫酸为xml,配制1L的溶液时按公式计算得： 0.1=(x*1.84*98%)/49/1 x=2.71ml1.3.3 麦芽汁制备5： 称取干麦芽粉溶于水中（比例是1：3），水浴加热到60度左右，保温4小时左右，可以取一点与碘液反应，不变蓝则糖化完全，四层纱布过滤即可，配制为10波美度的浓度，在121C下灭菌20分钟并放入冰箱中备用。波美度与比重换算方法：波美度=144.3-(144.3/比重)；对于比谁重的：比重144.3

15、/(144.3-波美度)对于比水轻的：比重144.3/(144.3+波美度)根据公式计算得 X/999.972 =144.3/(144.3-10) X=1074.43X=1074.43kgm3=1.074.43gcm3式中：X-10波美度时的密度。1.4 培养基的配制：1.4.1 分离纯化培养基2 :（马铃薯培养基） 马铃薯200g，葡萄糖20 g ,琼脂20g ,加蒸馏水至1000mL，自然PH 。在 121C下灭菌20分钟并放入冰箱中保存备用。1.4.2 发酵培养基2: 葡萄糖15. 0 g ,酵母膏0. 5 g ,NH4Cl 0. 15 g ,MgSO47H2O 0. 065 g ,蛋白

16、胨0. 5 g ,KH2PO4 0. 15 g ,加蒸馏水至100 mL ,用H2SO4 调节pH至4.5 ，在121C下灭菌20分钟并放入冰箱中保存备用。第二章 实验内容与方案2.1 大曲中酿酒酵母的分离2.1.1 分离纯化培养基的制备： 马铃薯200g，葡萄糖20 g ,琼脂20g ,加蒸馏水至1000mL，自然PH ,121 高压灭菌20 min ,冷却后倒平板备用。2.1.2菌悬液的制备： 称大曲样品5g迅速倒入有灭菌生理盐水45ml的玻璃瓶内（瓶内装适量玻璃珠），充分振荡使大曲样品充分打散，即制成1：10的小曲悬液。 2.1.3 稀释涂布： 用无菌移液管吸取1ml小曲样品悬液，沿管壁

17、注入9ml灭菌生理盐水试管内，摇匀试管，即制成1：100的稀释液。按上述方法依次稀释，制成10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6的稀释液。将培养基注入平皿约15ml共9个，分别取10-4，10-5和10-6三管稀释液各0.1ml，分别接入相应标号的平皿中，每个稀释度接3个，然后进行涂布，待菌液渗入培养基后倒置，放于30度的恒温培养箱中培养2天。2.1.4 纯化：2天后，取出上述平皿，用接种针挑取菌落外观是圆形且菌落表面光滑，湿润，粘稠呈乳白色，有酒香味的菌落进行鉴定，用显微镜鉴定确认是酵母菌后，然后进行纯化，纯化采用稀释涂布法，从而得到纯种的酵母菌。2.1.5 接种保藏：将

18、上面纯化好的酵母菌选一个长势好的酵母菌落用于诱变，并用三点法接入到加入了分离培养基的平皿中，于30度的培养箱中培养2天。2天后用于诱变育种，作为出发菌株，用完后放入4度冰箱中保藏备用。取2支试管，倒入适量的分离培养基制成斜面。然后选择菌落形态特征好的分别接种于2支斜面上，放于30度的恒温培养箱中培养2天，2天后作为菌种保藏。2.2. 出发菌株的能力测定2.2.1 耐酒精度试验： 1.将上面分离所得的出发菌株，用接种针分别挑取一环酵母菌接种于两支装10ml的无菌生理盐水的试管中，混匀。2. 将上面备好的出发菌株,接入麦芽汁中,放于30的恒温培养箱中静置培养2天,制得种子培养液。取装有10ml麦芽

19、汁的试管(内装杜氏小管)10支,每个乙醇浓度做两支试管，种子培养液分别以1ml的接种量接入试管中,在无菌条件下分别加入不同量的无水乙醇混匀,使培养基中乙醇含量（体积分数）如表2-1所示。3. 然后，放于30恒温培养箱中静置培养1天,观察产气情况。 表2-1 不同酒精浓度下的无水乙醇加入情况 Graph2-1 The dosage of absolute ethyl alcohol in different alcohol concentration麦芽汁加入量（ml）10.0010.0010.0010.0010.00种子培养液加入量（ml）1.001.001.001.001.00无水乙醇加入量

20、（ml）0.000.340.590.831.09总 量（ml）11.0011.3411.5911.8312.09乙醇体积分数（%）0.002.995.097.029.022.2.2 活化酵母菌种: 将上面出发菌株，用接种针挑取一环酵母菌接入到装有200ml发酵培养基的锥形瓶中，放于摇床中在30度条件下培养2天。2.2.3酒精发酵能力测定: 于三支500mL 的锥形瓶瓶中加入200 mL 发酵培养基,按10 %的比例接入活化后的酵母菌种,于30 的摇床中发酵,每1 天测定一次CO2 失重,当CO2 失重小于2克时认为发酵结束，测定发酵醪液酒精浓度。附：酒精含量测定6：取100 mL 发酵液于50

21、0 mL 蒸馏瓶中,加100 mL 蒸馏水,蒸馏出100 mL 溶液,用酒精比重计测定溶液中的酒精浓度,同时测定溶液温度,换算为20 时的酒精浓度。2.3 紫外线诱变酵母菌2.3.1 制备菌悬液： 取上面的出发菌种，用接种针接种10环酵母菌于100ml灭菌的生理盐水锥形瓶中，放到摇床振荡30分钟。 2.3.2 致死曲线的测定： 1.紫外线灯处理： 打开紫外灯（8w）预热20分钟，从锥形瓶中取10ml菌悬液放在无菌的培养皿（9cm）中，同时制作6份。将培养皿发在离紫外灯30cm（垂直距离）处的磁力搅拌器上，照射1min后打开培养皿盖，开始照射，与照射处理开始的同时打开磁力搅拌器进行搅拌，即时计算

22、时间，照射时间分别为30s,1min,3min,5min,6min，7min。然后在红光下进行下面操作。 2.死亡率的确定： 取0.1%美蓝染色液1滴，置于载玻片中央，并用接种环分别取上面5份酵母菌悬液与染色液混匀。染色2-3min中，加盖玻片，在高倍镜下观察，在一个视野内计算死细胞（蓝色）和活细胞（不着色），共计数5-6个视野。 死亡率=（死细胞数/细胞总数）x100%最后制定致死曲线，找到最佳的诱变时间Ta。(由于紫外线诱变效应中,正突变较多地出现在偏低的剂量,负突变则较多地出现在偏高剂量,因此选择死亡率为70 %80 %的剂量。) 3.以照射时间为横轴，以致死率为纵轴，作致死曲线。 2.

23、3.3 紫外线诱变处理： 从锥形瓶中取10ml菌悬液放在无菌的培养皿（9cm）中, 将培养皿放在离紫外灯30cm（垂直距离）处的磁力搅拌器上，照射1min后打开培养皿盖，开始照射，与照射处理开始的同时打开磁力搅拌器进行搅拌，即时计算时间Ta（根据所得的致死曲线，对菌株采用80%左右致死率的诱变条件进行诱变）。照射后在黑暗冷冻中保存1-2小时，然后在红光下将菌悬液加入已准备好的5个装有分离培养基的平皿中，每个平皿0.1ml菌悬液，然后进行涂布，待菌液渗入培养基后倒置，将上述涂均的平板用黑布包好，在30度恒温培养箱中避光培养2天。 2.3.4 接种保藏:2天后，观察平皿中的菌落，选出长势很好菌落进

24、行下面的测试并接种于备好的斜面上，于30度的恒温培养箱中培养2天，2天后放于4C的冰箱中作为菌种保藏。2.3.5 耐酒精度试验: 1.将上面备好选育的菌株，用接种针分别挑取一环酵母菌接种于两支装10ml的无菌生理盐水的试管中，混匀。 2.将上面备好选育的菌株,接入麦芽汁中,放于30的恒温培养箱中静置培养2天,制得种子培养液。取装有10ml麦芽汁的试管(内装杜氏管)20支，每个乙醇浓度做两支试管,种子培养液分别以1ml的接种量接入试管中，在无菌条件下分别加入不同量的无水乙醇混匀,使培养基中乙醇含量（体积分数）如表2-2所示。3. 然后，放于30的恒温培养箱中静置培养1天,观察产气情况。表2-2a

25、不同酒精浓度下的无水乙醇加入情况 Graph2-2a The dosage of absolute ethyl alcohol in different alcohol concentration麦芽汁加入量（ml）10.0010.0010.0010.0010.00种子培养液加入量（ml）1.001.001.001.001.00无水乙醇加入量（ml）0.000.340.590.831.09总 量（ml）11.0011.3411.5911.8312.09乙醇体积分数（%）0.002.995.097.029.02表2-2b不同酒精浓度下的无水乙醇加入情况 Graph2-2b The dosage

26、of absolute ethyl alcohol in different alcohol concentration麦芽汁加入量（ml）10.0010.0010.0010.0010.00种子培养液加入量（ml）1.001.001.001.001.00无水乙醇加入量（ml）1.361.652.002.302.60总 量（ml）12.3612.6513.0013.3013.60乙醇体积分数（%）11.0013.0415.3817.2919.122.3.6 活化酵母菌种: 将上面备好选育的菌株，用接种针挑取一环酵母菌接入到装有200ml发酵培养基的锥形瓶中，放于摇床中在30度条件下培养2天。2.

27、3.7 酒精发酵能力测定: 于三支500mL 的锥形瓶瓶中加入200 mL 发酵培养基,按10 %的比例接入活化后的酵母菌种,于30 的摇床中发酵,每1 天测定一次CO2 失重,当CO2 失重小于2克时认为发酵结束，测定发酵醪液酒精浓度，将数据与出发酵母菌进行比较 酒精含量测定：取100 mL 发酵液于500 mL 蒸馏瓶中,加100 mL 蒸馏水,蒸馏出100 mL 溶液,用酒精比重计测定溶液中的酒精浓度,同时测定溶液温度,换算为20 时的酒精浓度。2.4 氯化锂诱变酵母菌2.4.1 制备氯化锂培养基：首先，将氯化锂以0%，0.3%，0.6%，0.9%，1.2%的质量分数的用量分别加入到分离

28、培养基中溶化，每个质量分数做100ml的氯化锂培养基（如表2-3）。表2-3 不同质量分数下的氯化锂用量情况Graph2-3 The dosage of Licl in different Licl concentration氯化锂质量分数（%）0.0000.3000.6000.9001.200氯化锂的加入量（g/100ml）0.0000.3720.7441.1161.4882.4.2 制备菌悬液：然后，将出发菌种用接种针接种1环酵母菌于10ml灭菌的生理盐水锥形瓶中，放到摇床振荡30分钟。2.4.3 平板涂布: 将预先准备好10个装有分离培养基含氯化锂0%， 0.3%， 0.6%， 0.9%

29、， 1.2%每个浓度两个平皿分别加入0.1ml菌悬液进行涂布，待菌悬液待菌液渗入培养基后，倒置于30度的恒温培养箱中培养3天。2.4.4 死亡率的确定:（菌落计数法） 2天后，观察平皿中菌落数并记录，以0%的氯化锂平皿作对照计算致死率，以氯化锂在培养基中的质量分数为横坐标，致死率为纵坐标作图，得到LiCl诱变的致死曲线。 2.4.5氯化锂诱变处理： 根据所得的致死曲线，对菌株采用80%左右致死率的诱变条件进行诱变酵母菌，平行作5个平板，倒置于30度的恒温培养箱中培养3天。2.4.6 接种保藏：两天后，观察平皿中的菌落，选出长势很好菌落进行下面的测试并接种于备好的斜面上，于30度的恒温培养箱中培

30、养2天，2天后放于4C的冰箱中作为菌种保藏。2.4.7 耐酒精度试验： 1.将上面备好选育的菌株，用接种针分别挑取一环酵母菌接入到两支装有10ml的无菌生理盐水的试管中，混匀。 2.将上面备好选育的菌株,接入麦芽汁中,放于30的恒温培养箱中静置培养2天,制得种子培养液。取装有麦芽汁10ml的试管(内装杜氏小管)12支,种子培养液分别以1ml的接种量接入试管中，在无菌条件下分别加入不同量的无水乙醇混匀,使培养基中乙醇含量如表2-4所示。 3.然后，放于30的恒温培养箱中静置培养2天,观察产气情况。表2-4不同酒精浓度下的无水乙醇加入情况 Graph2-4 The dosage of absolu

31、te ethyl alcohol in different alcohol concentration麦芽汁加入量（ml）10.0010.0010.0010.0010.0010.00种子培养液加入量（ml）1.001.001.001.001.001.00无水乙醇加入量（ml）0.000.340.590.831.091.36总 量（ml）11.0011.3411.5911.8312.0912.36乙醇体积分数（%）0.002.995.097.029.0211.002.4.8活化酵母菌种： 将上面备好选育的菌株，用接种针挑取一环酵母菌接入到装有200ml发酵培养基的锥形瓶中，放于摇床中在30度条件

32、下培养2天。2.4.9酒精发酵能力测定： 于三支500mL 的锥形瓶瓶中加入200 mL 发酵培养基,按10 %的比例接入活化后的酵母菌种,放于30 的摇床中发酵,每1 天测定一次CO2 失重,当CO2 失重小于2克时认为发酵结束，测定发酵醪液酒精浓度，将数据与出发酵母菌进行比较。附： 酒精含量测定：取100 mL 发酵液于500 mL 蒸馏瓶中,加100 mL 蒸馏水,蒸馏出100 mL 溶液,用酒精比重计测定溶液中的酒精浓度,同时测定溶液温度,换算为20 时的酒精浓度。2.5 紫外线-氯化锂复合诱变酵母菌2.5.1 复合诱变处理：将用氯化锂诱变80%左右致死率的诱变条件下长出的菌落（挑选长

33、势好的菌落）制成菌悬液，于紫外线80%左右致死率的诱变条件进行诱变，然后涂布于平板上，平行作5个平板，然后放于30度的恒温培养箱中培养两天。2.5.2 接种保藏：两天后，观察平皿中的菌落，选出长势很好菌落进行下面的测试并接种于备好的斜面上，放于30度的恒温培养箱中培养样2天，2天后放于4C的冰箱中作为菌种保藏。2.5.3 耐酒精度试验： 1.将上面备好选育的菌株，用接种针分别挑取一环酵母菌接入到两支装有10ml的无菌生理盐水的试管中，混匀。 2.将上面备好选育的菌株,接入麦芽汁中,放于30的恒温培养箱中静置培养2天,制得种子培养液。取装有10ml麦芽汁的试管(内装杜氏管)28支,种子培养液分别

34、以1ml的接种量接入试管中，在无菌条件下分别加入不同量的无水乙醇混匀,使培养基中乙醇含量如表2-5所示。3. 然后，放于30的恒温培养箱中静置培养2天,观察产气情况。表2-5a不同酒精浓度下的无水乙醇加入情况 Graph2-5a The dosage of absolute ethyl alcohol in different alcohol concentration麦芽汁加入量（ml）10.0010.0010.0010.0010.0010.0010.00种子培养液加入量（ml）1.001.001.001.001.001.001.00无水乙醇加入量（ml）0.000.340.590.831.

35、091.361.65总 量（ml）11.0011.3411.5911.8312.0912.3612.65乙醇体积分数（%）0.002.995.097.029.0211.0013.04表2-5b不同酒精浓度下的无水乙醇加入情况 Graph2-5b The dosage of absolute ethyl alcohol in different alcohol concentration麦芽汁加入量（ml）10.0010.0010.0010.0010.0010.0010.00种子培养液加入量（ml）1.001.001.001.001.001.001.00无水乙醇加入量（ml）2.002.302.

36、603.003.303.704.00总 量（ml）13.0013.3013.6014.0014.3014.7015.00乙醇体积分数（%）15.3817.2919.1221.4323.0825.1726.672.5.4 活化酵母菌种： 将上面备好选育的菌株，用接种针挑取一环酵母菌接入到装有200ml发酵培养基的锥形瓶中，放于摇床中在30度条件下培养2天。2.5.5 酒精发酵能力测定： 于三支500mL 的锥形瓶瓶中加入200 mL 发酵培养基,按10 %的比例接入活化后的酵母菌种,于30 的摇床中发酵,每1 天测定一次CO2 失重,当CO2失重小于2克时认为发酵结束，测定发酵醪液酒精浓度，将数

37、据与出发酵母菌进行比较。附： 酒精含量测定：取100 mL 发酵液于500 mL 蒸馏瓶中,加100 mL 蒸馏水,蒸馏出100 mL 溶液,用酒精比重计测定溶液中的酒精浓度,同时测定溶液温度,换算为20 时的酒精浓度。第3章 实验结果与讨论3.1 实验结果3.1.1大曲中分离纯化酵母菌的结果：大曲中分离得到得酵母菌，菌落形态呈圆形，不透明，乳白色，表面光滑，有光泽，湿润，粘稠。出发酵母菌如图3-1所示： 图3-1 酵母菌出发菌的菌落形态Picture3-1 The shape of Saccharomyces cerevisiae strain3.1.2 出发菌株的能力测定的结果：3.1.2

38、.1 出发菌耐酒精度试验结果：出发酵母菌经过麦芽汁培养基的产气试验，产气所需时间较短，且现象明确。24小时后观察的产气结果是0%，2.99%（乙醇体积分数）的试管中杜氏小管全充满了气体；5.09%的试管的杜氏小管中有1/2管气体；7.02%的试管的杜氏小管中有1/3管气体；9.02%的试管的杜氏小管没有产气。实验结果如表3-1所示： 表3-1 出发酵母菌在不同乙醇体积分数下的产气情况Graph3-1 The gas production of the original strain in different ethyl alcohol concentration乙醇体积分数（%）02.995.

39、097.029.02产气量全管气体全管气体1/2管气体1/3管气体未产气产气情况如图3-2所示:（下图从左到右乙醇体积分数依次由0%增加到13.04%）图3-2 出发酵母菌的产气情况Picture3-2 The gas production of the original strain 3.1.2.1 酒精发酵能力测定的结果：出发酵母菌经过液体发酵培养基的发酵试验，发酵时间较短，经二氧化碳失重测定一天就能发酵完毕，且有很浓的酒香味，但是发酵醪液酒精浓度经测定只有3.8%。酒精发酵能力测定的结果如表3-2所示：表3-2出发酵母菌的二氧化碳失重情况（单位：g）graph3-2 The weight

40、 loss of CO2 in the fermentation of the original strain 时 间第一组第二组第三组平均值初始值343.2324.3344.4第一天333.4311.2332.3第二天331.3310.0331.2失重量（第一天）9.813.112.111.67出发酵母菌的发酵醪液酒精浓度情况如表3-3所示:表3-3 出发酵母菌的发酵醪液酒精浓度情况Graph3-3 The alcohol-concentration of fermentative liquid concerning the original strain组 别第一组第二组第三组平均值酒精浓

41、度（%）3.54.04.03.8注：表中的酒精浓度均是换算成20C时的酒精浓度3.1.3 紫外线诱变后的酵母菌的试验结果：3.1.3.1 紫外线诱变酵母菌的致死曲线： 致死曲线是通过计数死菌与活菌数量并计算致死率来进行制作的，酵母菌计数采用了显微镜直接计数法，计数前先用美蓝染色，便可以清晰的辨认出死菌还是活菌，计数使用的是25*16型的血球计数板，分别计数了五个中方格（左上，左下，右上，右下，中央）。致死曲线分别以时间为横轴，以致死率为纵轴。酵母菌细胞呈椭圆形，在10*100倍的油镜下容易观察到酵母菌的液泡，酵母菌出芽情况也清晰可见，经过美蓝染色，死菌变成蓝色，活菌不被作色。由于紫外线诱变效应

42、中,正突变较多地出现在偏低的剂量,负突变则较多地出现在偏高剂量,因此选择死亡率为70 %80 %的剂量为最佳。所以本文选取了紫外线照射6分钟，酵母菌致死率为76.7%时为实验诱变最佳条件。紫外线照射结果如表3-3所示：表3-4 紫外线照射酵母菌的致死情况Graph3-4 the quantity of Saccharomyces cerevisiae strains killed by different dosage of UV紫外线照射时间照射30秒（个）照射1分钟（个）照射3分钟（个）照射5分钟（个）照射6分钟（个）照射7分钟（个）一方格死菌个数005202030活菌个数15251510

43、100二中格死菌个数005102025活菌个数2030201550三中格死菌个数000151520活菌个数25252010100四中格死菌个数000202535活菌个数3030150100五中格死菌个数0010103525活菌个数2035201500总 数110135110125150135 致死率（%）0.00.018.262.576.7100.0紫外线诱变酵母菌的致死曲线如图3-5所示：图3-5 紫外线诱变酵母菌的致死曲线 Graph3-5 the curved shape of Saccharomyces cerevisiae strains killed by different do

44、sage of UV3.1.3.2 紫外线诱变后的酵母菌：出发酵母菌经过紫外线诱变后，生长速度加快，菌落形态与出发酵母菌基本一致，只有菌落比出发菌小，因为培养时间为一天。紫外线诱变后的酵母菌如图3-3所示：图3-3 紫外线诱变后的酵母菌Picture3-3 The Saccharomyces cerevisiae strains mutated by UV3.1.3.3 紫外线诱变后的酵母菌的酒精度试验结果:出发酵母菌经过紫外线诱变后，接入到液体麦芽汁培养基中产气。与出发酵母菌相比较，紫外线诱变后的酵母菌的耐酒精度有明显的增强。紫外线诱变后的酵母菌的产气情况由出发酵母菌的7.02%（乙醇体积分

45、数）的耐酒精度增加到了17.29%。产气情况如表3-6所示：表3-6a 紫外线诱变后的酵母菌的产气情况Graph3-6 The gas production of Saccharomyces cerevisiae strains mutated by UV乙醇体积分数（%）02.995.097.029.02产气量全管气体全管气体全管气体全管气体全管气体表3-6b 紫外线诱变后的酵母菌的产气情况Graph3-6b The gas production of Saccharomyces cerevisiae strains mutated by UV乙醇体积分数（%）11.0013.0415.38

46、17.2919.12产气量全管气体全管气体2/3管气体2/3管气体未产气产气情况如图3-4所示：（下图乙醇体积分数从右到左依次由0%增加到15.38%）图3-4a 紫外线诱变后的酵母菌的产气情况Picture3-4a The gas production of Saccharomyces cerevisiae strains mutated by UV（下图乙醇体积分数从左到右依次为17.29%，19.12%）图3-4b 紫外线诱变后的酵母菌的产气情况Picture3-4b The gas production of Saccharomyces cerevisiae strains mutat

47、ed by UV3.1.3.4 紫外线诱变后的酵母菌的酒精发酵能力的测定结果：出发酵母菌经紫外线诱变后，接入到发酵培养基中发酵，发酵能力与出发酵母菌相比，明显增强，由出发酵母菌的每天二氧化碳失重11.67克增加到每天失重15.4克，发酵能力比起出发酵母菌提高了32.0%，但是发酵醪液酒精浓度比起出发酵母菌来也没有多大提高，紫外线诱变后的酵母菌的发酵醪液酒精浓度为4.3%。酒精发酵能力测定的结果如表3-5所示：表3-7 紫外线诱变后的酵母菌的二氧化碳失重情况（单位：g）Graph3-7 The weight loss of CO2 in the fermentation of Saccharom

48、yces cerevisiae strains mutated by UV时 间第一组第二组第三组平均值初始值310.6339.0337.2第一天295.7321.0322.9第二天295.2319.5321.9失重量（第一天）14.917.014.315.4出发酵母菌的发酵醪液酒精浓度情况如表3-8所示:表3-8 紫外线诱变后的酵母菌的发酵醪液酒精浓度情况Graph3-8 The alcohol-concentration of fermentative liquid concerning the Saccharomyces cerevisiae strains mutated by UV组

49、 别第一组第二组第三组平均值酒精浓度（%）4.05.04.04.3注：表中的酒精浓度均是换算成20C时的酒精浓度3.1.4 氯化锂诱变后的酵母菌的试验结果：3.1.4.1 氯化锂诱变酵母菌的致死曲线： 致死曲线是通过计数平板中长出的菌落数量与对照平板中长出的菌落数量并计算致死率来进行制作的，酵母菌落得计数采用了平板计数法，使用全自动菌落计数仪进行计数，致死曲线分别以氯化锂在培养基中的质量分数为横轴，以致死率为纵轴制作。氯化锂是无机的化学诱变剂，有一定的毒性，操作是一定要带手套，还要注意废物的处理。本文未把诱变时间看作变量，都是将出发酵母菌涂布于平板上培养2天观察菌落并计数，经过试验选取了0.6

50、%（质量分数）的氯化锂培养基作为最佳的诱变条件，酵母菌致死率为83.7%。氯化锂诱变酵母菌的致死情况如表3-9所示：表3-9 氯化锂诱变酵母菌的致死情况Graph3-9 The quantity of Saccharomyces cerevisiae strains killed by different dosage of LiclLicl诱变的质量分数（%）0.00.30.60.9第一个平板（个）138113230第二个平板（个）126116200菌落总数(个)264229430致死率（%）0.013.383.7100.0氯化锂诱变酵母菌的致死曲线如图3-10所示：图3-10 氯化锂诱变酵

51、母菌的致死曲线Graph3-10 the curved shape of Saccharomyces cerevisiae strains killed by different Licl3.1.4.2 氯化锂诱变后的酵母菌：出发酵母菌经氯化锂诱变后长出的菌落形态与出发酵母菌基本一致。与出发酵母菌相比，氯化锂诱变后酵母菌的生长速度减慢。氯化锂诱变后的酵母菌如图3-5所示:图3-5 氯化锂诱变后的酵母菌Picture3-5 The Saccharomyces cerevisiae strains mutated by Licl3.1.4.3 氯化锂诱变后的酵母菌的耐酒精度试验：出发酵母菌经过氯化

52、锂诱变后，接入到液体麦芽汁培养基中产气，与出发酵母菌比较氯化锂诱变后的酵母菌的耐酒精度没有明显的变化。氯化锂诱变后的酵母菌的耐酒精度为9.02%。氯化锂诱变后的酵母菌的产气情况如表3-11所示：表3-11氯化锂诱变后的酵母菌的产气情况Graph3-11 The gas production of Saccharomyces cerevisiae strains mutated by Licl乙醇体积分数（%）02.995.097.029.0211.00产气量全管产气全管产气全管产气全管产气全管产气未产气氯化锂诱变后的酵母菌的产气情况如图3-6所示：（下图从左到右乙醇体积分数依次由0%增加到11.00%） 图3-6 氯化锂诱变后的酵母菌的产气情况Picture3-6 The gas production of Saccharomyces cerevisiae s