课程论文弓形虫的诊断及其疫苗的研究进展

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1、海 南 大 学 农 学 院课程论文题 目：弓形虫的诊断及其疫苗的研究进展学 号： 姓 名： 专 业： 08级动物医学 指导教师： 完成日期： 2011 年 6 月 5 日 弓形虫病的诊断及其疫苗的研究进展 张昱 （海南大学农学院 2008动物医学 ）摘要：弓形虫（Toxoplasma gondii）于1908年由Nicolle和Manceaux发现，是一种世界性分布的寄生原虫，能引起人兽共患的弓形虫病。它可以感染大多数哺乳动物。本文对该病的诊断技术及其疫苗研制做了简要阐述。关键词：弓形虫 诊断 疫苗 Advances in Diagnosis Method and Vaccine agains

2、t Toxoplasma gondiiYu zhang （ Veterinary Medicine class of 2008 College of Agriculture Hainan Uniuversiti ）Abstract：Toxoplasma gondii, Nicolle and Manceaux, 1908，is a unicellular protozoan that can infect a broad spectrum of organisms including humans.It is capable of infecting all warmblooded Anima

3、ls.this article reviews the latest reach progress in Diagnosis Method and Vaccine against Toxoplasma gondii.Key words：toxoplasma gondii 弓形虫病的传播与流行给畜牧业生产带来很大损失，尤其对养猪业的危害更大。猪弓形虫病是猪发生流产和死胎的原因之一，已证实弓形虫能够通过胎盘、子宫、产道及初乳等途径传播。该病多在34月龄的仔猪中发生，死亡率高达3040，其中以乳猪死亡率最高。国内外猪弓形虫病的发生和血清流行病学调查资料统计结果表明，弓形虫病对猪的感染是广泛的，其危害

4、也是严重的。弓形虫病缺乏特异性临床症状和体征，诊断较为困难，因此对其有效地诊断就显得尤为重要；由于弓形虫病的治疗仍未找到理想的药物,所以对其预防的意义远大于治疗。国内外在对弓形虫诊断和疫苗研制方面做了很多研究，现就此作一综述。1.病原弓形虫(Toxoplasma gondii)是猫科动物的肠道球虫，过去，国内的译名有弓形体、弓浆虫和毒浆虫等。弓形虫在生物界的位置仍然存在不同的看法，现根据LevinNDet al(1980)使用此分类法初步定为： 界(Kingdom)：动物界(Animalia) 门(Phylum)：原生动物门(Protozoa) 亚门(Subphylum)：顶复亚门(Subph

5、ylum apicomplexa) 纲(Class)：孢子虫纲(Class Sporozoasida) 亚纲(Subclass)：球虫亚纲(Subclass Coccdia) 目(Order)：真球虫目(Order eucoceidiida) 亚目(Suborder)：艾美耳亚目(Suborder EimeriiNa) 科(Family)：肉孢子虫科(Family Sarcocystidae) 属(Genus):弓形属(Genus Toxoplasma) 种(Spedes)：刚地种(Species Gondii)种的特征：卵囊(oocyst)包含2个孢子囊(sporocyst)，每个孢子囊含4

6、个子孢子(sporozoite)，在宿主体外进行孢子生殖(spomgony)。速殖子(tachyzoise)可在宿主任何器官内存在，包囊(cyst)主要在宿主的脑、眼、骨骼肌内存在。包囊包含缓殖子(bradyzoite)，属于兼性异宿主。终末宿主为猫科动物，在猫肠上皮细胞内由无性繁殖至有性繁殖。速殖子、缓殖子和卵囊都可感染终末宿主及中间宿主。2.弓形虫的生活史弓形虫的整个生活史发育要有两个宿主，猫科动物如家猫为终末宿主，在终末宿主体内肠上皮细胞内进行无性和有性生殖。有性生殖只限于猫小肠绒毛上皮细胞内，而无性生殖既可在小肠上皮细胞又可在小肠外其他器官组织内进行。弓形虫对中间宿主的选择不严格，无论

7、哺乳类，鸟类和人都可作为中间宿主，猫既可做终末宿主又可做中间宿主。对组织的选择也不严格，除红细胞外，任何有核细胞都可侵犯。弓形虫全部生活史的发育包括5个期，即速殖子(tachyzoite)，在假包囊(pseudocyst)内或外；缓殖子(bradyzoite)在组织包囊(cyst)：子孢子(sporozoite)在卵囊(ooeyst)内；裂殖体(schlzont)包含裂殖子(merozoite)；配子体，(gametocyte)分雌(大)配子(macrogamete)和雄(小)配子(microgamete)。2.1 速殖子(tachyzoite) 是繁殖在中间宿主有核细胞内迅速分裂的虫体，当数

8、个或数十个虫体占据整个宿主的细胞浆，宿主细胞的胞膜变成速殖子集合体的膜时，称之为假包囊。2.2 缓殖子(bradyzoite) 是与殖子相对应的名称。速殖子繁殖迅速，而缓殖子则在虫体分泌物所形成的囊壁内缓慢增殖。速殖子的核位于正中而缓殖子的核位于末端，被囊壁包住的许多缓殖子谓之包囊。2.3 配子体 是弓形虫裂殖子侵入细胞后，不形成裂殖体，而发育为大(雌)小(雄)配子体。2.4 卵囊 是双层囊壁内发育的合子(zygote)，未孢子化的卵囊包含一个孢子体(sporont)，孢子形成时，孢子体分化为2个孢子胚(sporoblast)的圆形体，以后延长成为孢子囊(sporocyst)，两个孢子囊内有4

9、个子孢子。2.5 裂殖体 是弓形虫缓殖子或子孢子等进入猫小肠上皮细胞后，配子生殖开始之前，虫体在猫小肠上皮内通过二芽殖(endodygeny)，内多芽殖(endopolygeny)弓形虫病PCR和ELISA诊断方法的建立和初步应用裂体增殖(schizogony)或“辟裂”(splitting)等方式进行增殖，最终成为有多个虫体(裂殖子)的集合体。裂殖体破裂，裂殖子侵入新的宿主细胞，继续增值为下一代的裂殖体。3.弓形虫的诊断3.1病原学诊断方法3.1.1直接镜检 取病料(心、肺、肝、淋巴结、腹液、脑脊液等)作抹片或涂片,固定、染色、镜检,查出弓形虫虫体即可确诊。3.1.2病原分离 将病料研磨过滤

10、加PBS或液体病料离心浓缩,给易感动物接种,进行弓形虫虫体的分离,至少盲传三代以后没发现弓形虫才可以认为阴性。病原学诊断方法较为简单,结果可靠，在过去近一个世纪的弓形虫病诊断中曾起到非常重要的作用。但这种方法检出率低、耗时、容易漏诊,一般不能进行生前诊断。另外，动物接种法有时有扩散病原，甚至造成操作者自身感染的危险。随着弓形虫病发病率的下降、抗弓形虫药物的广泛使用以及弓形虫病临床症状的复杂性，传统的病原学的检查方法费时、费力，亦由其特异性和敏感性的原因常常导致诊断的错误，已越来越不能适应当前弓形虫病诊断的需要。3.2 免疫学诊断免疫学诊断方法是目前进行弓形虫感染调查、临床弓形虫病确诊的常用方法

11、。3.2.1 凝集试验（Agglutination test，AT）其原理是建立在抗原与抗体特异性结合基础上的。3.2.1.1 直接凝集试验(DAT) 简便快速， 阳性反应出现时间比间接血细胞凝集试验(IHA)早。试验以甲醛固定的弓形虫悬液作为抗原与被检血清直接进行反应。在玻片上加不同稀释度的试验血清，混匀，几分钟后在显微镜下观察，如发生凝集，则为阳性反应。3.2.1.2 间接血细胞凝集试验(IHA) 主要优点是简便、快速原，循环抗原(CAg)比特异抗体出现的时间早，其特意性抗体可能延迟出现或不全， 特别是先天性弓形虫病和免疫受损者，甚至不出现特意性抗体6。CAg 是病原体存在的指征，CAg

12、的检测，不但可显示急性活动性感染，也可鉴定治疗效果、灵敏，已广泛应用于流行病学调查，陈义民和张德林先后建立了以弓形虫滋养体(速殖子)抗原和代谢分泌抗原致敏绵羊红细胞的IHA 方法。,用此方法制备的试剂较前者提前2d检出血清中的抗体,且在检测结果上两者的符合率为100%。3.2.1.3 改良凝集试验(MAT) 是Dubey 和Desmonts 建立的，被认为是特异敏感的检测方法Dubey对1 000头自然感染的母猪进行了各种血清学检测方法的对比实验,结果表明MAT可以检测猪的潜伏感染和现症感染被是特异敏感的检测方法，但存在着检测费时、费用高等缺点。3.2.2 酶联免疫吸附试验(ELISA) EL

13、ISA 是当前诊断弓形虫感染应用最广的技术。间接ELISA 法检测弓形虫IgM 抗体， 急性病例检出率较高，但类风湿因子阳性者易出现假阳性反应。近年来，新发展的双夹心法检测IgM，提高了敏感性及特异性。除此以外， 研究人员在ELISA 基础上还创建了如葡萄球菌A 蛋白ELISA(SPA-ELISA)、亲和素-生物素-ELISA(ABC-ELISA)、斑点-ELISA(Dot ELISA)和PCR-ELISA 等多种新的测定方法。ELISA 法用于弓形虫病免疫诊断检测抗体和抗，特别是对于免疫受损患者的诊断非常重要。此试验操作比较麻烦。3.2.3 补体结合试验（CT) 是临床常用的血清学诊断方法之

14、一， 该法既可用已知抗原查未知抗体来诊断疾病，亦可用已知抗体查未知抗原来鉴定抗原。1937 年Nicolan和Rovello 首次应用本试验诊断弓形虫病。补体结合抗体是IgG 抗体，出现晚，消失早而持续时间短。机体感染弓形虫后大约3 周左右才能出现补体结合抗体，持续存在半年或24 年、亦有56 年、甚至10 年的报道，但不能排除再感染的可能性。3.2.4 染色试验(DT) 由Sabin 和Feldnlan(1948)首创，是一种只适用于弓形虫感染的血清学试验的特殊方法。碱性美蓝可使弓形虫染成蓝色，若加入致活剂和免疫血清后则不能被染成蓝色， 如发现50%虫体未被染上蓝色时，即为阳性。其特异性强、

15、敏感性好已被普遍公认。但要活虫参与试验，由于在实际应用时不易操作，国内几乎不再采用。免疫酶染色试验（IEST）是在染色试验的基础上，以玻片上的弓形虫作为抗原，与血清样本中抗体反应，该方法简单、敏感、特异、迅速、可在现场使用。3.2.5 间接荧光抗体试验( IFAT) IFAT是以完整的死弓形虫为抗原,采用荧光标记的二抗检测特异IgM和IgG。IFAT具有特异、敏感、快速、重复性好等优点。但如有类风湿因子、抗核抗体则存在非特异性染色,可引起假阳性反应,同时判定结果易带主观性。3.2.6 放射免疫分析(RIA) 放射免疫分析法检测弓形虫病的抗原、抗体，具有灵敏度高、特异性强和重复性好等优点，为弓形

16、虫病的研究和诊断，特别是早期诊断，提供了一种新的血清学诊断方法，能进行精确的定性及定量分析。何浩明等用放射免疫分析双抗体法， 对连云港地区1004名人群进行了弓形虫病流行病学调查，结果113人为阳性，阳性率为1125。但此法需要一定的实验设备和条件，检测周期长。3.3 分子生物学诊断目前，由于免疫学方法本身的一些不足(Moni函Giraldo ct al，2002)，分子生物学手段已应用于弓形虫病的检测fYazar S et al，2004)，国内外已经建立了多种的弓形虫病基因诊断方法(ZH砧NG Shuyi et al，1999)，有DNA探针和PCR等。3.3.1 DNA探针 该方法可检测

17、的临床标本范围较广。Blanco等(1992)曾建立了RH株弓形虫基因文库，筛选出一个重复片段，用32P标记作为探针，斑点杂交可检测到80pg以上纯化弓形虫DNA或1000个弓形虫(在15x104人或鼠白细胞存在下)。夏爱梯等(1992)也建立了zS2株弓形虫基因文库，筛选了一个11kb特异性DNA片段并用32P标记作为探针检测弓形虫，敏感度为500pg纯化弓形虫DNA，并对部分临床检材进行了试验，都取得了满意的效果。从探针来源看，目前用于弓形虫检测的探针多为特异性DNA克隆片段或人工合成的寡核苷酸探针，但其制各需要一定条件且费用较大，不易推广。传统的制备探针的方法用基因克隆技术，选用限制性内

18、切酶酶切某特异片段后，克隆转化，表达到载体内，然后进行筛选。此方法繁杂，费时。PCR扩增特异DNA片段，同时标记上同位素或非同位素，比缺口翻译标记有利，但效果不太理想。3.3.2 PCR 弓形虫分子生物学的研究进展，使得PCR技术在弓形虫的检测上得到了迅速的应用。3.3.2.1 弓形虫特异性靶基因序列：目前应用于PCR 检测的靶基因序列有：B1 基因、P30 基因、核糖体DNA。B1 基因由BURG 在1989 年首次鉴定，35 倍重复的多拷贝基因，序列高度保守，是目前最为理想的引物之一。具有公认的高度特异性，用其建立的PCR 方法检测弓形虫具有高度的敏感性和特异性。Savva 等首先应用P3

19、0 基因设计引物进行PCR 检测。P30 是一种主要表膜抗原，在大多数虫株非常保守，是常用的引物之一。对P30 的反应可见于急性期，慢性期和先天性感染。核糖体DNA 引物(rDNA)具有种特异性和种内群体特异性，因此可作为PCR 的靶基因。Jones等用B1、P30 和rDNA 3 种引物设计的套式PCR 检测房水弓形虫DNA，比较三者的敏感性。以B1 基因为引物能检出相当于一个速殖子的DNA，而P30 和rDNA 引物的敏感性略低于B1 基因。TGR 核酸序列、529bp 片段、GRA2 序列等作为弓形虫种的遗传标记用于该病的检测。3.3.2.2 PCR类型：巢式PCR(nested PCR

20、)：巢式PCR是在常规PCR 方法基础上发展的一种新方法， 它利用内外两对引物，外引物含有内引物的部分序列，经两次先后扩增，可从极少量的模板中获得较高浓度和纯度的靶片段，从而提高了敏感性，并可应用于不同的临床标本的检测。荧光定量PCR(FQ-PCR)：采用与DNA 双链特异性结合的荧光染料、荧光共振能量转移的杂交探针技术及水解探针模式。探针荧光信号的强度随基因量的增加而增加，从而达到定量的目的。试验采用闭管操作，避免了后处理时易出现的污染；实时定量检测克服了传统PCR方法的平台效应。PCR 技术与免疫学检测技术相结合， 发展成为PCR-ELISA 以及免疫PCR (I-PCR) 的技术， 因其

21、具有PCR 的灵敏性、核酸杂交的特异性以及ELISA 的酶联放大作用，故而检测结果更灵敏、更准确。4 弓形虫疫苗4.1全虫疫苗4.1.1 灭活疫苗弓形虫灭活疫苗包括固定的全虫和裂解物，对动物进行免疫接种结果显示，抗感染能力弱，所以对于人群和家畜无实用价值。4.1.2 弱毒或战毒活疫苗相对灭活疫苗，减毒活疫苗却具有一定的优越性，弱毒或减毒活疫苗是将病原微生物在人工培育的条件下，促使产生定向变异，使其极大程度地丧失致病性，但仍保留一定的毒力、免疫原性和繁衍能力。此类疫苗可刺激机体产生细胞免疫应答和体液免疫应答等多种保护性反应。近几年随着分子遗传学的发展，人们采用放射线及化学试剂等手段，成功地研制出

22、弓形虫弱毒或减毒活疫苗。4.2 虫体特异组分疫苗这种疫苗是用免疫化学方法从虫体裂解物或排泄和分泌抗原(ESA)中，提取特定组分作为疫苗。弓形虫在宿主体内能分泌和排泄大量ESA，这些抗原成分主要作用于宿主的免疫体系，激发宿主产生细胞免疫和体液免疫，阻止弓形虫的寄生。4.3基因工程疫苗基因工程疫苗是用基因工程或分子克隆技术,分离出病原的保护性抗原基因,将其转入原核或真核系统使表达出该病原的保护性抗原, 制成疫苗。4.3.1 亚单位疫苗亚单位疫苗是从病原中分离的1个或几个具有免疫原性的抗原决定族表位制成的蛋白质疫苗。研究较多的有P30、P22疫苗。P30主要位于弓形虫表膜,参与虫体的附着和侵入宿主细

23、。含量只占虫体蛋白的3% 25% ,却能抑制患者血清中抗体活性的50% ,因此是诱导宿主免疫应答的主要靶抗原,具有高度的免疫原性和免疫保护性。抗P30抗体在体外有杀虫作用,在体内有保护作用。P30的免疫保护作用受很多因素的影响,如免疫鼠种、免疫剂量、免疫途径及免疫佐剂类型等,不同条件下,有可能得到相反的实验结果。P22蛋白是一种重要的弓形虫速殖子膜抗原,主要参与弓形虫的入侵过程,并且与弓形虫速殖子向缓殖子的转化有关。抗P22表面原的抗体能阻止弓形虫定位固定于宿主细胞的表面,从而阻止其入侵细胞内。P22 的抗原性较P30弱,但仍能提高免疫动物的免疫水平。4.3.2 复合多价疫苗由于弓形虫生活史复

24、杂、形态多样性、入侵宿主广泛性,造成其抗原成分多、抗原的免疫特性及致病分子机制均不同。因此,单价的亚单位疫苗效果并不理想,多价复合疫苗成为弓形虫疫苗发展的新方向。复合多价疫苗是将不同抗原分子设计成联合抗原或将编码不同抗原分子的功能性表位氨基酸的基因片断连接起来,通过原核或真核表达系统表达出联合表位肽段制成的疫苗主要包括多期疫苗、多价疫苗及多免疫应答疫苗等。4.4 核酸疫苗核酸疫苗是上世纪90年代发展起来的继病原体疫苗、亚单位疫苗之后的第三代疫苗,包括DNA疫苗和RNA疫苗,以DNA疫苗研究较多。核酸疫苗是将含有病原生物的某种抗原的cDNA或mRNA与特定载体(如质粒)的重组体,作为抗原直接接种

25、动物或人体,核酸进入机体细胞内,表达编码的抗原,激活免疫系统产生抵抗病原侵入或致病的免疫力。相比传统疫苗,核酸疫苗具有独特的优势和潜能: 可诱发机体全面免疫应答,免疫力持久,减少了免疫次数; 产生CTL作用,对胞内寄生的病毒、原虫等具有杀伤作用,且比较安全; 能联合免疫,制备多价疫苗; 既有预防作用,也有治疗作用; 制备简单,成本低廉,易于大规模生产; 便于储存和运输; 直接DNA接种,操作简单。5存在的问题和展望 近几年通过大量的实验研究,弓形虫病诊断及其疫苗的研究方面已取得较大进展,一些研究成果已经或正在对弓形虫病的防治产生积极影响。 但是，在弓形虫病的诊断方面还存在以下几方面的问题:用于

26、诊断的抗原或抗体纯度不够高;大多数诊断技术还不成熟,只停留在实验室研究阶段;用于现场快速检测的商品化弓形虫病诊断试剂盒寥寥无几。今后应为检测提供可靠的诊断抗原或抗体,加快解决试剂的标准化问题,建立综合的检测系统来弥补单一检测系统带来的不足。弓形虫疫苗的研制从60年代开始,主要经历了全虫疫苗、虫体特异组分疫苗、基因工程疫苗、核酸疫苗4个发展阶段。灭活疫苗的安全性较好，保护力不理想；弱毒苗有较好的免疫力，但在安全性上一直存在毒力返强、组织内形成包囊等问题。目前研制的多为亚单位疫苗，免疫效果并不理想，后来的多价疫苗随克服了单抗原分子诱导免疫保护水平低的问题，同时也存在生产过程复杂、技术难度大、成本高

27、的缺点。近年来发展起来的核酸疫苗虽有其独特的有点，但免疫原性较低，在畜体中诱导免疫应答水平不高等缺点极大的制约了弓形虫疫苗的研制和发展。总的来说目前弓形虫的诊断和免疫保护技术还不理想，因此有必要对弓形虫及其宿主的关系进行深入研究，特别是针对弓形虫各期共有的保护性抗原及保护性表位的鉴定，有益于弓形虫病的诊断和疫苗的开发。相信随着科学技术的发展，上述问题会得到解决。参考文献1孙秀涛，谢银杰，张思东等.免疫学与分子生物学技术在弓形虫病诊断中的研究进展J.动物医学进展.2009(7)2王德富.猪弓形虫病的诊断和防治J.畜牧兽医科技信息 2010(033)3闫若潜，刘光辉，赵雪丽等.猪弓形虫特异性PCR诊断方法的建立及应用J.中国动物检疫.2007(3)4王艳华,张德林,李学瑞等.弓形虫病免疫学诊断方法研究进展J.动物医学进展 2007(6)5龚娅，陈晓光弓形虫疫苗的研究进展J中国人兽共患病杂志，2000，16(1)6徐安健，谷俊朝.刚地弓形虫基因工程疫苗J中国生物工程杂志.2009(11)7张清国，黄炳成.弓形虫主要抗原及其疫苗的研究进展J.中国人兽共患病学报。2010(7)8贺勋，谢荣华.佐剂在弓形虫疫苗中的应用J.医学信息 2009(8)