第七章_蛋白质检验[技巧]

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1、第七章 _蛋白质检验 技巧 第八章血浆蛋白质的测定第一节概述一、血浆蛋白质的组成及功能血浆蛋白质是血浆固体成份中含量最多、组成复杂、功能广泛的一类化合物。占血浆固体成份90%左右，目前已经研究的血浆蛋白质有300 多种，分离出的纯品约 100 来种，除免疫球蛋白外，主要由肝细胞合成，主要功能有以下几方面:1. 维持血浆胶体渗透压 ; 清蛋白。2. 作为某些物质的载体，起运输作用 ; 如清蛋白能与多种物质结合 (FA、胆红素 ) ，某些球蛋白具特异地运输某些物质的功能，运铁蛋白、运皮质醇蛋白。3. 维持体液 pH 恒定 ; 血浆蛋白 pI 一般都小于 7.4 是弱酸，一部分以弱酸盐形式存在，构成

2、缓冲对。4. 免疫功能 ; 血浆中许多具有免疫功能的球蛋白，主要由浆细胞合成，电泳时位于 区带，如 IgG、 IgA 、IgM、IgD、 IgE ，此外，还有具有免疫作用的非特异球蛋白，如补体。5. 凝血与纤溶作用 ; 凝血与纤溶是一对矛盾的统一、凝血因子与纤溶因子绝大部分是血浆蛋白质，它们促进血液凝固，防止血液流失和溶解血栓，防止重要脏器的动脉栓塞。6. 营养作用 ; 血浆蛋白质可分解成 AA，用于合成组织蛋白或氧化供能。7. 催化作用 ; 血浆中有许多酶类，其中部分在血浆中发挥作用，称血浆功能性酶，如凝血酶原、纤溶酶原、铜蓝蛋白、 LPL、LCAT、肾素等。二、血浆中几种主要的蛋白质( 一

3、) 前白蛋白 (prealbumin ， PA)分子量 54kD，由肝细胞合成，电泳时移动速度较白蛋白快，位于其前方面得名，半寿期短为12h。PA是一类运载蛋白，一种能与甲状腺素结合，称为甲状腺结合蛋白，一种能与VitA 结合，称为 VitA 结合蛋白，常用测定方法是免疫学方法，正常参与范围0.2,0.4g /L，急性炎症，恶性肿瘤，肝硬化或肾炎时下降。( 二) 白蛋白 (albumin ，Alb) 分子量 66458，由肝实质细胞合成，半寿期15,19天，是血浆中含量最多的蛋白质，占40%,60%，主要功能，维持血浆胶体渗透性，缓冲作用，运输作用，营养作用，调节某些激素或药物活性。白蛋白可微

4、量地通过肾小球，约0.04%，但大部分被血小管重吸收。白蛋白的测定方法目前主要是溴甲酚绿(BCG)法，正常参考范围35,55g/L ，血浆白蛋白增高临床少见，主要见于严重失水引起血液浓缩，血浆白蛋白降低临床常见。 ?合成障碍急 ; 慢性肝炎。 ?丢失过多 ; 肾病综合症、慢性肾小球、肾炎、糖尿病、系统性斑狼疮等。 ?分解过多 ; 营养不良，慢性胃肠道疾病。( 三) - 酸性糖蛋白 ( -acid glycoprotein， AAG)、分子量约 4 万，含糖约 1145%， pI2.7,3.5，主要由肝细胞合成，某些肿瘤组织也可合成。AAG是主要的急性时相反应蛋白，急性炎症时上升，与免疫防御功能

5、有关。AAG测定方法，使用AAG抗体，进行免疫扩散法或免疫比浊法检测，正常0.5,1.5g/L,主要作为急性时相反应的指标，风湿病、恶性肿瘤、心肌参考范围梗塞患者上升，营养不良、严重肝病下降。( 四) - 抗胰蛋白酶 ( -antitrypsin， AT 或 AAT)，分子量 5.5 万， pI4.8 ，111含糖 10%,12%，电泳时位于 区带，占 90%左右，由肝细胞合成，能抑制多1种酶活性，尤其是蛋白酶，占血清中抑制蛋白酶活力的90%左右，抑制作用有明显的 pH依赖性，在中性和弱碱性中活力最大。AAT也是一种急性时相反应蛋白，主要功能是对抗多形核白细胞吞噬作用时释放的溶酶体蛋白水解酶。

6、AAT测定方法，目前主要采用免疫化学法，正常参考范围，新生儿血清1.45,2.7g/L，成人 0.78,2.0g/L，AAT下降见于胎儿呼吸窘迫症，AAT缺陷所致的肺气肿、肝硬化等， AAT上升见于急性炎症、外科手术后，长期服用可的松药物，妊娠及服用避孕药物。( 五) 甲胎蛋白 ( -fetoprotein，AFP)分子量 6.5,7万， pI4.75 含糖量 4%， 1主要由胎儿肝合成，妊娠13,15 周血清 AFP含量最高，以后逐渐下降，出生时仅为高峰期的 1%,0.1%，周岁时接近成人水平，仅10,30 g /L ，功能不详。AFP作为肿瘤标志物，对原发性肝 Ca的诊断很有价值， 80%

7、以上原发性肝 Ca患者血清 AFP上升，但无特异性，肺 Ca、胰腺 Ca，肝硬化患者血清 AFP亦升高，此外，羊水 AFP含量测定可用于胎儿产前监测， AFP?提示胎儿畸形 ( 神经管缺损、脊柱裂、无脑儿) ，死胎。AFP测定方法，火箭电泳放射自显影，放射免疫分析法，灵敏度特异性很高，有放射污染。反向间接血凝法(RPHA)，操作简便，定量不够精细，适合于普查、筛选。酶联免疫法 (ELISA) ，灵敏度接近放免，且操作简便，无放射污染，便于推广。( 六) 结合珠蛋白 (haptoglobin ， Hp)又名触珠蛋白，是一种糖蛋白，主要由肝合成，电泳时位于 区带，是一种急性时相反应蛋白，为两对肽链

8、组成的 2121 四聚体 ( ) ， 链有 和 两种，其中 有两种遗传变异体。 22 Hp的主要功能与血浆中游离血红蛋白结合， ( 不可逆结合 ) ，并送至肝细胞内降解，因此 Hp 在溶血后含量急剧下降。血浆 Hp 测定方法， ?测定 Hp-Hb 复合物中过氧化物酶活性。?在血浆中加入过量 Hb，生成 Hp-Hb复合物，凝胶层折法收复合物分离，测定结合的Hb。 ?电泳法。 ?免疫分析法，正常参考范围0.3,2.15g/L，个体间变异较大。急性时相反应中血浆Hp 上升，烧伤、肾病综合征引起Alb 丢失时 Hp 上升，血管内溶血 Hp 下降。( 七) - 巨球蛋白 ( -macroglobulin

9、， MG或 AMG) 是血浆中分子量 222最大的蛋白质，分子量为62.5,80 万，含糖量 8%。AMG最突出的特性能与多种分子和离子结合，特别是它能与不少蛋白水解酶结合而影响这些酶的活性，有选择地保护某些蛋白酶活性的作用。AMG由肝细胞与单核吞噬细胞系统合成，半寿期5 天。AMG测定方法，免疫化学法，正常参考范围1.25,4.10g /L，在低 Alb 血症，AMG上升，妊娠、服用避孕药时AMG上升。( 八) 铜蓝蛋白 (ceruloplasmin， CER) 含铜的糖蛋白，分子量约12,16 万，含糖量约 10%，因含铜而呈蓝色，故名铜蓝蛋白。2+3+CER具有氧化酶活性，使血液中Fe

10、氧化成 Fe，故又称亚铁氧化酶。 CER还起着抗氧化剂的作用。防止组织中脂质过氧化物和自由基的生成，CER属于急性时相反应蛋白，血浆CER在感染、创伤、肿瘤上升，Wilson 病 ( 肝点状核变性 )CER下降。CER测定方法，根据其氧化酶活性或免疫化学法，成人正常参考范围0.2,0.5g/L。( 九) 转铁蛋白 (transferrin，TRF) 血浆中主要含铁蛋白质，分子量7.7万，含糖约 6%，由肝及网状皮系统合成，半寿期7 天。主要运载由消化道吸收的铁和RBC降解释放的铁，此外还可逆地结合多价金属离子，如 Ca、Zn、Cu 等。TRF测定方法，扩散法、放免法、散射比浊法，成人正常参考范

11、围2.2,4.0g/L。TRF在急性时反应中下降，如炎症、恶性病变时、TRF、Alb 、PA同时下降，慢性肝病，营养不良亦下降，妊娠、口服避孕药，注射雌激素TRF上升。( 十) - 微球蛋白 ( -microglobulin， BMG) 分子量 11800，存在于所有22有核细胞的表面，特别是淋巴细胞和肿瘤细胞并由此释放入血，半寿期107mim。作为人类淋巴细胞抗原 链交部分。BMG测定方法，由于含量很低，常采用放免法，正常参考范围1.0,2.5mg/L 。主要用于监测肾小管功能，特别是肾移植后，如有排斥反应，BMG在尿中排出量上升，肾功能衰竭，炎症、肿瘤血浆BMG上升。( 十一 )C- 反应

12、蛋白 (C-reactive protein， CRP)，是一种能结合肺炎双球菌细胞壁 C-多糖的蛋白质，分子量 11.5,14 万，五条肽链组成，肝细胞合成。CRP能激活补体，促进粒细胞巨噬细胞的运动和吞噬，具有调理素样作用。CRP测定方法，免疫扩散法，火箭免疫电泳法， ELISA 法，放免法，正常参考范围 : 成人 0.42,5.2mg/L 。作为急性时相反应的一个极灵敏指标，急性心肌梗死，创伤、感染、炎症、外科手术、肿瘤浸润迅速上升。血浆蛋白质的组成与含量组成 分子量 功能 正常参考值临床意义前白蛋白营养不良、肿瘤、急性炎5.4 万 运载T、 T、VitA 0.2-0.4g/L 34(P

13、A)症、肝病 ?白蛋白维持胶渗、缓冲作用、6.6 万35-55g/L慢性肝炎、肝硬化、肾炎?(Alb)运输作用 - 酸性糖蛋白风湿病、恶性肿瘤、心肌14 万 与免疫功能有关0.5-1.5g/L(AAG) 梗塞 ? - 抗胰蛋白酶对抗溶酶体蛋白水解胎儿呼吸窘迫症、肺气肿、15.5万 0.78-2g/L (AAT) 酶 急性炎症、妊娠 ?原发性肝癌 ?羊水 AFP胎甲胎蛋白 (AFP) 6.5-7万 10- 30g/L 儿产前监测与血浆中游离 Hb结结合珠蛋白 8-40 万 0.3-2.05g/L Alb丢失时 ?、溶血时 ?合 - 巨球蛋白与蛋白水解酶结合影低Alb 、妊娠、口服避孕药162.5

14、-80 万1.25-401g/L (AMG)响其活性 ? 2+3+ 铜蓝蛋白使 Fe?Fe，抗氧化感染、创伤、肿瘤 ?、 Wilson12-16万0.2-0.5g/L (CER)剂 病?转铁蛋白炎症、恶性病变、慢性肝3+7.7万 运载Fe 2.2-4.0g/L (TRF)病?妊娠、口服避孕药? - 微球蛋白肾小管功能监测，肾衰、 21.18 万 淋巴细胞抗原一部分1-2.6mg/L (BMG)炎症、肿瘤 ? C- 反应蛋白激活补体、促进粒 C、急性心肌梗塞、创伤、感 10.5-14 万 0.42-5.2mg/L (CRP) 巨噬 C 的运动和吞噬 染、炎症、手术后、妊娠 ?上述蛋白质除 PA、

15、Alb 、BMG外都属于糖蛋白，含糖量最高的是 AAG、45%，除BMG外都主要由肝细胞合成。三、疾病时的血浆蛋白质的变化( 一) 炎症、创伤在炎症、创伤、感染、心肌梗塞、肿瘤等情况下其血浆浓度会发生明显改变的蛋白质称为急性时相反应蛋白(acute phcse reactante， APR)，主要包括 AAG、AAT、Hp、CER、C、C、纤维蛋白原、 CRP升高 ;PA、34Alb 、 TRF下降。( 二) 肝脏疾病血浆蛋白质大多数是由肝细胞合成，因此肝脏疾病会导致多种血浆蛋白质发生变化。如乙肝活动期AAT、IgM 升高 ; 而 Hp、 PA、Alb 降低。肝硬化时 AAT、IgA 、AMG

16、明显升高 ;IgG 升高 ;CER、 CRP轻度升高 ; 而 AAG、 Hp、C3 降低 ;PA、Alb 、TRF明显降低。( 三) 肾脏疾病肾脏疾病早期可因蛋白尿而导致血浆蛋白质丢失，丢失的蛋白质与其分子量有关，小分子蛋白质丢失明显，而大分子量蛋白质因肝细胞代偿性合成增加。主要表现是Alb 明显降低， PA、AAG、AAT、TRF降低 ; 而 AMG、Hp、 -LP升高。第二节血浆蛋白质测定临床生化检验中测定蛋白质的方法很多，主要利用蛋白质的分子组成，结构或性质进行。一、测定蛋白质特征元素氮如凯氏定氮法，是测定蛋白质的经典方法，1883 年 Kjeldahl首创，精密度准确度高，但操作复杂、

17、费时、技术性强，不适合临床常规检测，一般用于标准血清的标定和校正。二、利用重复的肽链结构如双缩脲法， 1914 年首创，操作简便，重复性好，各种蛋白产生的颜色反应相近，但灵敏度较低，是目前临床上测定总蛋白的常规方法。三、利用酪氨酸、色氨酸残基与试剂的反应或紫外吸收如 :1. 酚试剂法 1921 年， Folim 首创，后又经改进， 1951 年 Lowry 改良成今法、灵敏度高 ( 较双缩脲法高 100 倍) ，主要用于微量蛋白质检测，但各种蛋白质中酪氨酸含量不一，故准确性较差，试剂配制复杂且不稳定，化学干扰多，目前临床上仅用于粘蛋白测定。2. 紫外吸收法 在 280nm处有一吸收峰，快速、简

18、单，不需加任何试剂，保留蛋白质活性，化学干扰大。四、利用与染料的结合能力1. 考马克斯亮蓝 G-250 结合蛋白法 (CBB法) 1976 年 Bradford 应用于蛋白质测定，操作简便、快速、重复性好，灵敏度高，干扰因素少，但特异性不高，大分子肽 ( 分子量 300 以上 ) ，也参与反应，线性范围窄，临床上主要用于尿、脑溶液蛋白质测定。2. 溴甲酚绿结合清蛋白法 (BCG法 ) 灵敏度高，血清用量少，操作简便，但特异性不高，部分球蛋白也能与之结合 ( - 球蛋白、运铁蛋白、触珠蛋白等 ) ，1是目前临床上测定清蛋白的常规方法。五、利用沉淀后借浊度或光折射测定如比浊法、折光测定法，方法简便

19、，试剂易得，但浊度的强弱受反应的条件影响大( 加试剂的方法、温度等 ) ，结果准确性差，一般用于尿、脑脊液蛋白测定。六、电泳法 CAE、PAGE，目前临床上常用电泳技术，但只能计算各种蛋白质百分含量。七、利用免疫学特性 免疫化学法，特异性、灵敏度高，只能用于某种特异蛋白的测定。第三节血清总蛋白的测定 ( 双缩脲法 )一、原理蛋白质分子中的肽键在碱性条件下能与二价铜离子作用生成紫红色的络合物，产生的颜色强度在一定范围内与蛋白质的含量成正比，但双缩脲反应并非蛋白质特有的颜色反应，分子中含二个以上肽键者有此反应。二、双缩脲试剂未失结晶水的硫酸铜 (CuSO5HO)3.0g溶于 500ml 新鲜制备的

20、蒸馏水或4?2刚煮沸冷却的去离子水中，加酒石酸钾钠(NaKCOO4HO)9.0g，碘化钾 5.0g ，446?2待完全溶解后加入6mol/L NaOH 溶液 100ml，最后加蒸馏水至1L，置聚乙烯瓶内盖紧保存。酒石酸钾钠的作用是结合铜离子，维持铜离子在碱性溶液中的溶解度，碘化钾防止两价铜离子还原。三、正常参考范围 :60,80g/L四、临床意义( 一) 血清总蛋白增高1. 血液浓缩 严重腹泻 、呕吐、高烧。2. 合成增加 主要见于球蛋白合成增加，多发性骨髓瘤。( 二) 血清总蛋白降低1. 血液稀释 静脉滴注过多低渗溶液，各种原因所引起的水钠潴留。2. 摄入不足和消耗增加 营养不良，慢性胃肠道

21、疾病引起的消化吸收不良，消耗性疾病，结核病、甲亢、恶性肿瘤。3. 合成障碍 严重肿瘤4. 蛋白质丢失 严重烧伤，大量血浆渗出，肾病综合症。第四节血清清蛋白测定 ( 溴甲酚绿法 )一、原理溴甲酚绿 (BCG)在 pH4.2 的环境中，在有非离子去垢剂 (Brij-35) 存在时，可与清蛋白结合形成蓝绿色复合物，颜色的深浅在一不定范围内与清蛋白含量成正比。BCG与蛋白结合的特异性较低，它不仅与 Alb 结合呈色，还可与其他蛋白质呈色，其中 - 球蛋白， TRF、Hp 最明显，但反应速度不同， Alb 可立即反应 1( 快反应 ) ，其他蛋白质反应慢 ( 慢反应 ) 。二、试剂1. 10mmol/L

22、 BCG 贮存液 BCG1.75g，溶于 5ml 1 mol/L NaOH 溶液中，加蒸馏水至 250ml。2.0.5mol/L在琥珀酸缓冲贮存液 (pH4.0) NaOH10g，琥珀酸 56g，溶解于800ml 蒸馏水中，用 1mol/L NaOH 溶液调 pH至 4.10?0.05 ，加蒸馏水至 1L。3.叠氮钠贮存液 叠氮钠 40g 溶于 1000ml 蒸馏水中。4.Brij-35溶液 Brij-35 25g ，加蒸馏水 80ml，置 60?左右水浴使其溶解，然后加水至 100ml。5. BCG 试剂 于 IL 容量瓶内加蒸馏水 400ml，琥珀酸缓冲贮存液 100ml，BCG贮存液8m

23、l，叠氮钠贮存液2.5ml ， Brij-35溶液2.5ml ，加蒸馏水至刻度，配好的BCG试剂的pH应为4.15?0.05。Brij-35可提高蛋白质与染料的结合力及溶解度，提高呈色稳定性，如无Brij-35可用吐温 -20 代替，叠氮钠有防腐作用。三、正常参考范围 :35,5.5g/L。四、临床意义1. 血清清蛋白(1) 增高 常见于严重脱水所致的血浆浓缩。(2) 降低 临床上较常见，与总蛋白降低的原因大致相同。急性降低常见于大量出血或严重烧伤 ; 慢性降低见于肾病蛋白尿、肝功受损、肠道肿瘤与结核、慢性出血、营养不良和消耗性疾病等。清蛋白如低于 20g/L ，患者可出现水肿。2. 血清球蛋

24、白(1) 增高 严重脱水、炎症、免疫系统疾病和肿瘤。(2) 降低 血液稀释、严重营养不良、胃肠道疾病等。肾上腺皮质激素和其它免疫抑制剂有抑制免疫功能的作用，会导致球蛋白合成减少。球蛋白浓度如低于10g/L 时，可怀疑为无 球蛋白血症。3. 清蛋白与球蛋白比值 (A/G) 临床上常用 A/G 值衡量肝病的严重程度，当 A/G值小于 l 时，称比值倒置，为慢性肝炎或肝硬化的特征之一。【方法评价】1. 高胆红素血症和溶血标本对本法不产生干扰。严重高脂血症可使结果偏高，应采用标本空白校正。若标本混浊，可做标本空白 ( 血清 0.02ml ，加琥珀酸缓冲液4ml) ，用测定管吸光度减去标本空白管吸光度后

25、再计算结果。2. BCG 系一种 pH指示剂，它受酸、碱影响较大，所用器材必须清洁，无酸、碱污染。3.BCG试剂的 pH必须严格控制在pH4.15?0.05 ，pH升高可使染料空白增高，与清蛋白结合率下降。所以，控制反应液的pH是本法测定的关键。4.BCG与蛋白质结合的特异性较低。它不仅与清蛋白结合呈色，还与血清中其它蛋白质呈色，其中以 球蛋白、运铁蛋白 ( 属 球蛋白 ) 、触珠蛋白 ( 属 12 球蛋白 ) 最为明显， BCG与不同蛋白质的反应速率不同，与清蛋白可立即发生反应( 快反应 ) ，与其它蛋白质反应较慢( 慢反应 ) 。实验证明，血清与BCG试剂一经混合，“慢反应”即可发生，约持续1h 才完成。5. Brij-35 是一种非离子去垢剂，它可增强 BCG清-蛋白复合物的溶解度，消除 BCG同清蛋白反应时可能产生的沉淀，它的浓度高于或低于所指定的浓度时，均导致敏感度降低和直线性丧失，对测定结果有较大影响。故其配制浓度和所加试剂量一定要准确。当 60g/L 清蛋白标准液与 BCG试剂作用后，溶液在光径 1cm、波长 630nm6. 时，测定的吸光度应为 0.811?0.035 ，若达不到此值，表示 BCG试剂灵敏度较差。7. 本法灵敏度高，操作简便，重复性好，并可用于自动化分析技术。8. 线性范围为 10,60 g/L ， CV,3%。