分子生物学常用技术

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1、分 子 生 物学 常 用 技术 第 十 七 章 分 子 生 物 学 常 用 技 术 凝胶电泳 分子杂交 聚合酶链反应(PCR)技术 DNA的物理图谱 DNA序列测定 基因芯片 第 一 节 凝 胶 电 泳(gel electrophoresis)电泳概念基本原理 Q 6r : 迁移率 Q : 电荷量 r : 粒子半径（分子量） : 介质粘度 电泳的用途分离鉴定纯度测定分子量凝胶电泳的种类琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 一 、 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳(agarose gel electrophoresis) 分离核酸原理 操作要点 应用范围 （ 一 ） 分 离 核 酸 原 理 电荷效应 分

2、子筛效应 分子构象 1. 电 荷 效 应 核酸是两性电解质 pH = 3.5 , 正电荷 pH = 8.08.3 , 负电荷，正极 2.分 子 筛 效 应 小分子移动快 ，大分子移动慢 3. 分 子 构 象闭环超螺旋线状DNA开环DNA +- （ 二 ） 操 作 要 点支持物 凝胶浓度的选择 DNA分子量标准 电泳缓冲液 样品制备 电泳条件 DNA电泳染色 DNA片段的回收 1. 支 持 物 商 品 化 的 琼 脂 糖 琼 脂 糖 种 类普通低熔点高纯高筛分熔点8090 几十V/cm温度：1525 潜 水 电 泳 7.电 泳 染 色 溴乙锭(ethidium bromide, EB) 结构及染

3、色原理 染色方法加入凝胶液中 电泳结束后染色 EB染 色 原 理 紫 外 灯 下 显 色 8. DNA片 段 的 回 收低熔点琼脂糖法 透析袋电洗脱法(5kb) DEAE-纤维素膜法(0.55kb) （ 三 ） 应 用 范 围 DNA的分离、纯化和鉴定 限制性酶切图谱分析 重组体的分离、鉴定 杂交分析 PCR产物的分离鉴定 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 二 、 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳(polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE) 分离原理 操作要点 优点 应用范围 （ 一 ） 分 离 原 理 电荷效应 分子筛效应 PAGE支 持 物单体丙烯酰胺(

4、Acr) 交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis) 催化剂过硫酸胺(AP) 加速剂N,N,N,N-四甲基乙二胺(TEMED) 聚丙烯酰胺凝胶 （ 二 ） 操 作 要 点凝胶的分类 凝胶浓度的选择 凝胶液的配制 凝胶中DNA的检测DNA片段的回收 1. 凝 胶 的 分 类非变性凝胶：dsDNA变性凝胶: ssDNA尿素甲酰胺SDS 2. 凝 胶 浓 度 的 选 择 3. 凝 胶 液 的 配 制 试剂(ml)制备浓度(%) 3.5 5.0 8.0 12 2030%Acr 11.6 16.6 26.6 40.0 66.6ddH2O 67.7 62.7 52.7 39.3 12.75XTBE 20.0 20.0

5、 20.0 20.0 20.010%AP 0.7 0.7 0.7 0.7 0.7TEMED 35ul/100ml PAGE装 置 电 泳 4. 凝 胶 中 DNA的 检 测溴乙锭染色法 银盐染色法 甲醛 还原放射自显影法 Ag+DNA Ag（黑褐色） 5.DNA片 段 的 回 收压碎浸泡法 1kb 纯度高，回收率低 （ 三 ） PAGE优 点机械强度好、化学稳定性高分辨率高 载样量大 回收的DNA纯度高 （ 四 ） PAGE应 用 范 围分离、纯化和鉴定RNA和小分子DNA DNA序列分析 PCR产物鉴定 蛋白质的检测和分析 第 二 节 分 子 杂 交分子杂交的基本原理固相支持物探针几种常用杂

6、交技术 一 、 分 子 杂 交 的 基 本 原 理 核酸的变性和复性 分子杂交 DNA-DNA DNA-RNA 杂 交 条 件 靶分子 探针 杂交袋 杂交炉 杂 交 种 类被检核酸种类和方法 原位杂交斑点杂交Southern杂交Northern杂交Western杂交 反应介质 液相杂交 固相杂交() 二 、 固 相 支 持 物 固相支持物的特性结合能力强不影响杂交反应结合牢固 非特异性吸附少 机械性能良好 固 相 支 持 物 的 种 类 硝酸纤维素滤膜 (nitrocellulose filter membrane) 尼龙膜(nylon membrane) 1.硝 酸 纤 维 素 滤 膜 特点

7、吸附ssDNA和RNA 杂交信号本底低 不足不适于重复杂交滤膜较脆 不适于电转移印迹法 对DNA小片段(缺口翻译 操作简便 DNA/cDNA 探针 DNA的 5 末 端 标 记 (5 end labeling) 碱性磷酸酶T4多核苷酸激酶 标记原理 制备寡核苷酸探针 制备短的DNA/RNA探针 DNA的 5末 端 标 记 四 、 Southern 杂 交Southern blotting/DNA blotting1975年，Edwen Southern等印迹(blotting) : 转移 blot: a spot or mark, esp. of ink blotting 1. 印 迹 的 方

8、 法 毛细管转移法 电转移法 真空转移法 毛 细 管 转 移 法 电 转 移 法 真 空 转 移 法 2. Southern 杂 交 的 步 骤 3. Southern 杂 交 的 应 用基因的定性及定量分析基因的酶切图谱分析基因突变分析 RFLP 五 、 Northern 杂 交 RNA blotting 步骤 总RNA/mRNA变性电泳分离转移杂交放射自显影/化学显色 应用检测组织/细胞中mRNA的大小、量 比较不同组织/细胞中基因的表达情况 Northern 杂 交 六 、 Western 杂 交免疫印迹(immunoblotting) SDS-PAGE转移蛋白第一抗体标记的第二抗体(探

9、针)检测 应用-蛋白质的定性定量分析 免 疫 印 迹 Southern,Northern 34kb , 34min; 10kb,15min循环次数: 2535 四 、 PCR的 种 类反转录PCR原位PCR(in situ PCR)实时PCR(real time PCR)重组PCR(recombinant PCR)锚定PCR(anchored PCR)反向PCR(inverse PCR) 原 位 PCR原位杂交PCR程序 固定细胞/组织样品PCR前处理PCR扩增原位杂交及检测 实 时 PCR的 原 理 五 、 PCR的 应 用分子生物学研究临床医学 分 子 生 物 学 研 究基因克隆 DNA序

10、列测定基因的体外定点突变 突变分析(PCR-SSCP) 基因定量 临 床 医 学病原体诊断 遗传病的基因诊断 肿瘤检测 法医学 第 四 节 DNA序 列 测 定 Sanger 双脱氧链终止法(1977) Maxam-Gilbert化学裂解法(1977) Sanger 双 脱 氧 链 终 止 法 原理DNA复制 反应条件 模板引物 dNTP（其中一种带放射性标记） ddNTP DNA聚合酶 DNA的 复 制 2 ,3 -双 脱 氧 核 苷 酸(ddNTP) DNA测 序 操 作 DNA自 动 测 序 DNA自 动 测 序 仪 第 六 节 生 物 芯 片 (Biochip) 20世纪90年代末生物

11、分子之间相互作用的特异性种类 细胞芯片、组织芯片、微生物芯片、基因芯片、蛋白质芯片 基 因 芯 片 概念 种类 应用领域 表达谱基因芯片及其检测原理 应用举例 什 么 是 基 因 芯 片 ？ 基因芯片(Gene chip, DNA chip),又称为DNA微阵列(DNA Microarray)，是指固定在载体上的高密度DNA微点阵。具体地说就是将大量寡核苷酸或cDNA有序地、高密度地排列在玻璃、硅等固相载体上。 基 因 芯 片 芯 片 的 制 备 基 因 芯 片 的 种 类表达谱基因芯片 诊断芯片 检测芯片 基 因 芯 片 的 应 用 领 域基 因 芯 片基因表达谱疾病诊断药物筛选新基因寻找 测序基因分型基因突变 表达谱基因芯片及其检测原理研究在不同组织或细胞、不同发育阶段中基因的表达差异，进而阐明基因的功能 检 测 原 理 表 达 谱 基 因 芯 片 应 用 举 例用基因表达谱芯片研究人正常和肝细胞癌中差异表达的基因 肿瘤的分型及预测 1999年，Gulop等 急性白血病的分型 AML(13/10) ALL(25/24)