生物技术药物质量控制

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1、生 物 技 术 药 物 质 量 控 制 概 述v 利 用 人 体 内 的 天 然 物 质 治 疗 人 类 的 疾 病 或 达 到 某种 医 学 效 果 一 直 是 医 学 上 的 一 个 重 要 研 究 领 域 。v 20世 纪 70年 代 以 来 产 生 了 DNA重 组 技 术 ， 这 种 新技 术 是 现 代 生 物 技 术 的 主 体 ， 近 年 来 首 先 在 医 药领 域 获 得 了 飞 速 发 展 。 生 物 技 术 的 应 用 2/3用 于 医药 ， 生 物 技 术 新 型 药 物 和 疫 苗 已 有 50多 种 产 品 投放 市 场 ， 400多 种 正 在 进 行 临 床

2、试 验 ， 2000多 种在 临 床 前 研 究 。v 据 报 道 ， 国 外 6500万 人 接 受 重 组 乙 肝 疫 苗 、 100万 人 接 受 t-PA治 疗 ， 超 过 50万 人 使 用 EPO， 每 天约 有 1000万 人 接 受 重 组 人 胰 岛 素 的 治 疗 。 v生 物 技 术 产 品 的 生 产 和 管 理 按 生 物 制 品的 要 求 进 行 ， 不 仅 对 最 终 产 品 的 质 量 实施 有 效 控 制 ， 而 且 特 别 重 视 对 生 产 工 艺的 全 过 程 进 行 质 量 控 制 ,其 中 包 括 对 每 个生 产 步 骤 的 验 证 、 质 量 检

3、 定 （ QC） 、 质量 保 证 部 （ QA） 对 生 产 和 质 量 检 定 的 全过 程 进 行 严 格 的 管 理 。 1、 概 念 ：2、 分 类 生 物 技 术 药 物重 组 DNA药 物重 组 蛋 白 质 药 物采 用 DNA重 组 技 术 或 其 他 新 生物 技 术 生 产 的 治 疗 和 预 防 药物 。 1、 重 组 蛋 白 质 或 重 组 多 肽 药 物 包 括 ： 细 胞 因 子 类 ： rIFN、 IL-2、 EPO等 ； 抗 细 胞 素 治 疗 ： CD4可 溶 性 受 体 等 ； 重 组 溶 血 栓 类 ： rSK、 rSAK等 ； 人 源 化 单 克 隆 抗

4、 体 制 剂 ； 重 组 疫 苗 和 菌 苗 制 剂 。 2、 重 组 DNA药 物 包 括 ：v寡 核 苷 酸 药 物 ： 反 义 核 酸 等 ；v基 因 药 物 ： 腺 病 毒 -IL-2、 腺 相 关 病 毒 -凝 血 因 子 ； 腺 病 毒 - P53v细 胞 治 疗 制 剂 ： 抗 原 致 敏 的 人 树 突 状 细胞 vDNA疫 苗 ： 治 疗 乙 型 肝 炎 、 爱 滋 病 的 核 酸疫 苗 等 。 我 国 生 物 技 术 药 物 质 量 标 准 研 究 现 状v现 代 医 药 生 物 技 术 的 发 展 以 及 人 类 基 因 组 计 划的 完 成 和 遗 传 病 基 因 的

5、不 断 发 现 ， 对 医 药 领 域产 生 了 巨 大 影 响 。v自 1982年 第 一 个 基 因 重 组 药 物 重 组 胰 岛 素 上市 以 来 ， 全 世 界 约 有 60余 种 重 组 产 品 开 发 成 功 ，包 括 基 因 工 程 药 物 、 基 因 工 程 抗 体 ， 重 组 疫 苗 、反 义 核 苷 酸 药 物 、 基 因 治 疗 药 物 、 DNA疫 苗 。v 我 国 在 “ 七 五 ” 、 “ 八 五 ” 、 “ 九 五 ” 期 间 国家 “ 863”高 技 术 项 目 支 持 下 ， 先 后 建 立 一 系 列基 因 重 组 制 品 质 量 标 准 和 质 控 方

6、法 ， 共 完 成 国家 一 类 、 二 类 新 药 20余 种 产 品 的 质 量 标 准 研 究 。 生 物 技 术 药 物 质 量 标 准 研 究 的 依 据一 、 主 要 依 照 重 组 DNA产 品 质 量 控 制 要 点 、 中 国 生 物 制 品 规 程 、 中 国 药 典 等 要 求进 行 。二 、 参 考 世 界 卫 生 组 织 （ WHO） 和 美 国 FDA颁布 的 指 南 、 ICH文 件 和 欧 洲 药 典 。检 定 标 准 、 检 定 方 法 ： 准 确 可 靠 、 切 实 可 行 ；保 证 产 品 安 全 、 有 效 。 生 物 技 术 药 物 质 量 标 准 研

7、 究 的 内 容1、 目 标 产 品 的 均 一 性2、 建 立 目 标 产 品 生 物 学 活 性 或 免 疫 学 效 价 测 定 方 法3、 研 究 建 立 目 标 产 品 的 免 疫 学 活 性 的 测 定 方 法 及 质控 标 准4、 研 究 建 立 国 家 标 准 品 或 参 考 品5、 建 立 目 标 产 品 生 产 相 关 杂 质 的 限 量 分 析 方 法 和 标准6、 制 定 出 保 证 上 述 生 物 技 术 产 品 临 床 安 全 、 有 效 、与 WHO标 准 相 一 致 的 质 量 控 制 标 准 和 规 范 化 的 检定 方 法 研 究 建 立 灵 敏 、 稳 定

8、的 理 化 性 质 、 纯度 、 含 量 的 测 定 方 法 及 质 控 标 准 。 研 究 建 立 目 标 产 品 的 生 物 学 功 效 的 测定 方 法 及 质 控 标 准 ； 建 立 用 于 药 物 生 物 学功 效 检 定 用 的 细 胞 系 和 动 物 模 型 。 运 用 生 化 标 准 化 原 则 ， 以 WHO国 际标 准 品 为 对 照 ， 研 制 出 国 家 标 准 品 或 参考 对 照 品 。 在 效 价 定 义 上 要 求 与 国 际 单位 一 致 ； 没 有 国 际 标 准 品 的 新 药 ， 则 根据 标 准 品 要 求 自 行 研 制 国 家 参 比 品 。 外

9、源 DNA、 菌 体 蛋 白 质 、 细 菌 内 毒素 以 及 病 毒 、 支 原 体 、 细 菌 等 在 工 艺 中加 入 有 害 物 质 的 检 测 。 重 组 产 品 质 量 控 制 上 存 在 的 难 点v 建 立 重 组 药 物 的 生 物 学 活 性 测 定 方 法 ；v 理 化 测 定 标 准 品 的 稳 定 性 ；v 人 源 化 单 抗 中 的 人 源 化 程 度 检 测 方 法 及 标 准 研 究 ；v 重 组 人 白 蛋 白 等 大 剂 量 重 组 产 品 安 全 性 评 价 问 题 ；v 反 义 核 酸 药 物 理 化 特 性 测 定 和 效 力 测 定 ， 即 如 何

10、评价 反 义 核 酸 的 体 内 及 体 外 活 力 ；v 基 因 治 疗 药 物 的 安 全 性 评 价 包 括 反 转 录 病 毒 、 生 物分 布 和 效 力 测 定 ；v DNA疫 苗 的 安 全 性 和 效 力 检 测 方 法 研 究 ； v 干 细 胞 治 疗 产 品 的 质 量 标 准 的 建 立 （ 干 细 胞 鉴 定 及活 力 测 定 ） 。 我 国 基 因 工 程 产 品 安 全 管 理法 规 和 技 术 指 南 传 代 细 胞 系 生 产 生 物 制 品 的 规 程 人 用 鼠 源 性 单 克 隆 抗 体 质 量 控 制 要 点 预 防 用 新 生 物 制 品 临 床 研

11、 究 的 技 术 要 求 人 用 重 组 DNA制 品 质 量 控 制 要 点 人 的 体 细 胞 治 疗 申 报 临 床 试 验 指 导 原 则 人 基 因 治 疗 申 报 临 床 试 验 指 导 原 则 药 理 毒 理 检 查 指 导 原 则 药 品 生 产 质 量 管 理 办 法 药 品 注 册 管 理 办 法 生 物 技 术 药 物 的 质 量 控 制生 物 技 术 药 物 的 特 点 ：1、 来 源 ： 活 的 生 物 体 （ 细 菌 或 细 胞 ） ；2、 结 构 ： 复 杂 （ 包 括 组 成 、 空 间 结 构 ） ；3、 生 产 ： 涉 及 生 物 材 料 和 生 物 学 过

12、 程 （ 发 酵 、 细 胞 培 养 ， 分 离 纯 化 等 ） ， 有 其 固 有 的 易 变 性 。 生 物 技 术 药 物 的 质 量 控 制质 量 控 制 包 括 两 个 方 面 ：1、 生 产 过 程 中 质 量 控 制 GMP（ 硬 件 、 软 件 ）2、 最 终 目 标 产 品 的 质 量 控 制 （ 方 法 学 研 究 ） 质 量 控 制 方 法 学 研 究 具 体 内 容一 、 生 物 学 活 性 测 定 和 比 活 性二 、 蛋 白 质 纯 度 检 查三 、 蛋 白 质 含 量 测 定四 、 蛋 白 质 药 物 理 化 性 质 的 鉴 定五 、 蛋 白 质 的 二 硫 键

13、分 析六 、 对 糖 蛋 白 的 特 殊 要 求七 、 残 余 杂 质 检 查八 、 安 全 性 及 其 他 检 测 项 目九 、 生 物 技 术 药 物 待 测 样 品 保 存 一 、 生 物 学 活 性 测 定 和 比 活 性1、 意 义 ：1） 基 因 工 程 产 品 的 化 学 本 质 为 蛋 白 质 、 多 肽 ，其 活 性 由 产 品 的 氨 基 酸 序 列 或 其 空 间 结 构 所 形 成 的 活 性 中 心 所 决 定 的 ， 与 其 绝 对 质 量 不 一 致 。2） 基 因 工 程 产 品 的 生 物 学 活 性 与 药 效 学 基 本 相一 致 。3） 利 用 生 物

14、学 活 性 建 立 的 测 定 效 价 体 系 ， 是 给药 品 定 量 的 依 据 ， 保 证 产 品 药 效 的 重 要 手 段 。 效 价 测 定 一 般 原 则1、 国 际 通 用 方 法 ；2、 测 定 结 果 须 用 国 际 或 国 家 标 准 品校 正 ， 以 国 际 单 位 表 示 。 生 物 学 活 性 测 定 方 法 分 类1） 体 外 细 胞 培 养 测 定 法 a、 促 进 细 胞 生 长 作 用 （ G-CSF:NFS-60） b、 抑 制 细 胞 生 长 作 用 (TNF:L929) c、 间 接 保 护 细 胞 作 用 (IFN:VISH;VSV)2） 离 体 动

15、 物 器 官 测 定 法 采 用 家 兔 主 动 脉 条 测 定 重 组 脑 利 钠 肽 生物 活 性 。3） 体 内 测 定 法4） 生 化 酶 促 反 应 测 定 法5） 免 疫 学 活 性 测 定 法 v取 兔 离 体 动 脉 条 剪 成 约 1.5cm 长 、 2 3 mm 宽 的 螺 旋 环 ， 悬 挂 于 含 10mL通 氧 的 37 台 氏液 (取 NaC1 8.0 g、 KC1 0.2 g、 CaCl 20.2g、NaH2PO40.05g、 MgSO4 7H2O 0.1g、 NaHCO3 1.0 g、 Glucose 1.0g用 蒸 馏 水 配 成 1 000 mL的 溶 液

16、， 置 于 玻 璃 或 塑 料 瓶 中 ， 用 1 mol L-1 NaOH 溶 液 调 pH 至 7.4)的 麦 氏 浴 槽 中 ， 加 负荷 1g， 稳 定 1h， 期 间 每 20min换 1次 台 氏 液 ： 连 接 多 导 记 录 仪 ， 调 节 灵 敏 度 ， 记 录 血 管 的张 力 变 化 。 v待 张 力 曲 线 基 线 稳 定 后 ， 加 入 1.25 mg mL-1盐酸 去 氧 肾 上 腺 素 溶 液 0.05 mL于 麦 氏 浴 槽 中 使 其终 浓 度 为 6.25 10-5 mg mL-1 ， 曲 线 升 高 至 最高 并 稳 定 后 ， 开 始 按 累 计 浓 度

17、 给 药 法 (曲 线 稳 定后 对 倍 增 加 样 品 浓 度 为 ： 6.25 10-5 8.0 10-2 RU mL )加 入 重 组 人 脑 利 钠 肽 对 照 品 ， 记 录 血 管的 张 力 变 化 。 完 成 上 述 给 药 后 ， 洗 脱 并 稳 定 1 h，期 问 每 20 min换 1次 台 氏 液 。 待 基 线 稳 定 后 ， 按测 定 对 照 品 的 方 法 测 定 待 测 样 品 ， 记 录 测 定 结 果 。计 算 对 照 品 和 各 实 验 样 品 的 半 效 稀 释 倍 数 ， 按 下式 计 算 样 品 效 价 ： 样 品 效 价 =对 照 品 效 价 样 品

18、半 效 稀 释 倍 数 对 照 品 半 效 稀 释 倍 数 利 用 动 物 体 内 某 些 指 标 变 化 ， 定 出产 品 的 单 位 ， 如 EPO活 性 测 定 ， 体 内 注 射EPO后 ， 计 算 小 鼠 网 织 红 细 胞 增 加 的 数 量与 标 准 品 比 较 ， 确 定 其 活 性 单 位 。 基 于 产 品 与 某 种 物 质 的 结 合 或 产 品本 身 的 化 学 反 应 为 原 理 设 计 ， 具 有 简 便 、精 确 、 稳 定 等 特 点 ， 如 重 组 链 激 酶 、 葡激 酶 生 物 活 性 测 定 ， 链 激 酶 、 葡 激 酶 和纤 溶 酶 原 （ h-p

19、lg） 结 合 形 成 复 合 物 激 活游 离 h-plg原 为 有 活 性 的 纤 溶 酶 。 利 用 制 品 免 疫 原 性 ， 制 备 相 应 单 克 隆 抗体 或 多 克 隆 抗 体 ， 采 取 ELISA 法 测 定 其 含 量 。 生 物 学 活 性 测 定 方 法 选 择体 内 测 定 和 体 外 测 定 方 法 a、 体 内 测 定 ： 即 整 体 动 物 测 定 ， 能 为 较 大范 围 的 重 组 产 品 的 效 价 提 供 有 用 信 息 ， 但 费 时 、昂 贵 、 难 操 作 及 同 时 存 在 伦 理 问 题 ， 大 多 数 情况 下 倾 向 于 选 择 体 外

20、测 定 方 法 。 b、 体 外 测 定 ： 可 使 用 分 离 的 器 官 或 组 织 、原 代 细 胞 或 传 代 细 胞 系 ， 目 前 最 常 用 方 法 是 连续 生 长 、 因 子 依 赖 的 、 克 隆 化 的 细 胞 系 的 方 法 ，其 测 定 结 果 比 较 准 确 、 重 现 性 好 、 经 济 、 容 易使 用 和 便 于 统 计 分 析 。 生 物 学 活 性 测 定 方 法 选 择2、 定 量 、 半 定 量 、 定 性 方 法 a、 通 过 研 究 首 先 选 择 能 够 定 量 评 价 的 方法 ， 最 好 的 选 择 是 背 景 较 低 的 反 应 ， 并 且

21、对 相 关 产 品 有 陡 峭 的 、 可 重 复 的 剂 量 -反 应曲 线 ； 其 次 考 虑 半 定 量 方 法 （ 如 NGF） ， 最后 考 虑 定 性 （ 如 BMP） 方 法 。 b、 对 生 产 工 艺 稳 定 ， 生 物 学 活 性 测 定 方法 复 杂 ， 可 采 用 其 他 替 代 方 法 （ 如 重 组 人生 长 激 素 用 HPLC定 量 方 法 代 替 复 杂 生 物 活性 测 定 方 法 ） 。 细 胞 培 养 法 中 细 胞 染 色 标 记 方 法 3H-thymidine、 BrdU 是 反 映 DNA合 成 、 增 殖 细 胞数 的 比 例 的 。 BrdU

22、： 首 先 用 BrdU做 标 记 ， 固 定 细胞 ， 用 核 苷 酸 酶 处 理 后 使 过 氧 化 物 酶 结 合 抗 BrdU抗体 发 生 反 应 。 MTT（ 四 氮 唑 盐 ） ： 其 在 活 细 胞 的 线 粒 体 中 可 以定 量 地 被 琥 珀 酸 脱 氢 酶 还 原 为 难 溶 性 的 蓝 紫 色 结 晶物 MTT formazan,二 甲 基 亚 砜 （ DMSO） 和 酸 化 的 异 丙醇 或 酸 化 的 SDS均 能 溶 解 紫 色 结 晶 物 ， 通 过 比 色 法 测定 MTT formazan的 量 可 以 反 映 线 粒 体 电 子 传 递 系 统机 能 ，

23、间 接 表 示 细 胞 的 生 长 状 态 。 Alamar Blue： 氧 化 型 Alamar Blue（ 600nm）可 被 活 细 胞 中 的 线 粒 体 酶 还 原 ， 还 原 后 染 料（ 570nm） 发 生 颜 色 和 荧 光 改 变 ， 颜 色 和 荧 光 的深 浅 与 活 细 胞 数 成 正 比 ， 可 用 分 光 光 度 计 或 荧光 检 测 仪 检 测 。 Crystal violet： 染 活 细 胞 后 ， 在 比 色 计中 测 定 光 吸 收 值 （ A） ， A值 与 着 染 色 细 胞 数 成正 比 。 几种细胞培养测定方法比较 3H -thymidine B

24、rdU MTT Alamar Blue靶向物 DNA合成系统 线粒体电子传递系统检出细胞的状态 增殖 增殖、生存检出法 放射活性 色素、荧光 色素 色素、荧光抽出的必要性 + + + -其他试剂的必要性 + + + -成本（以MTT为1时）60 80-100（试剂盒） 1 2缺点 使用同位素 不适合 检出大量未增殖 检出未增 浮游细胞 细胞，处理时费力 殖活细胞 生 物 学 活 性 测 定 分 析 方 法 1、 用 能 诱 导 50%最 大 反 应 的 待 测 样 品 最 高 稀 释 度作 为 参 考 效 价 （ 或 滴 度 ） ， 或 以 此 稀 释 度 中 所 含 样品 的 量 为 1单

25、位 ， 即 以 此 稀 释 度 的 倒 数 为 待 测 样 品所 含 的 单 位 数 。 2、 比 较 已 知 浓 度 或 活 性 单 位 样 品 标 准 品 和 待 测样 品 的 实 验 结 果 。 活 性 标 准品 待 测 样 品 稀 释 度a bA值 生 物 学 测 定 基 本 模 式 图 蛋 白 质 药 物 的 比 活 性 测 定 的 意 义1、 比 活 性 ： 每 毫 克 蛋 白 质 的 生 物 学 活 性 单 位 。2、 蛋 白 质 的 空 间 结 构 不 能 常 规 测 定 ， 而 它 的 改 变（ 如 二 硫 键 的 错 误 配 对 ） 可 影 响 蛋 白 质 的 生 物 学

26、活性 ， 从 而 影 响 药 效 ， 比 活 性 可 以 反 映 此 种 情 况 。3、 比 活 性 可 反 映 产 品 生 产 工 艺 的 稳 定 情 况 ， 可 比 较不 同 表 达 体 系 、 不 同 生 产 厂 家 生 产 同 一 产 品 时 的 质量 情 况 。4、 比 活 性 是 重 组 蛋 白 质 药 物 不 同 于 化 学 药 的 一 项 重要 指 标 ， 也 是 进 行 成 品 分 装 的 重 要 定 量 依 据 。 生 物 活 性 测 定 标 准 范 围 确 定1、 使 用 验 证 过 的 测 定 和 分 析 方 法 ， 并 提 供用 此 方 法 的 效 价 测 定 平 均

27、 值 和 单 测 定 一 批 误差 的 可 信 限 范 围 。2、 对 于 成 品 的 生 物 活 性 测 定 标 准 ， 要 根 据不 同 方 法 的 特 点 规 定 相 当 标 示 量 的 范 围 ， 目前 ， 生 物 活 性 的 测 定 方 法 有 四 类 ： 动 物 基 础 、细 胞 基 础 、 生 化 （ 酶 ） 法 、 特 异 （ 免 疫 、 受体 ） 结 合 法 。 不 同 生 物 活 性 测 定 方 法 的 规 定 标 准 表 测 定 方 法 规 定 标 准动 物 基 础 的 生 物 活 性 测 定 70% 130%标 示 量细 胞 基 础 的 生 物 活 性 测 定 80%

28、120%标 示 量体 外 酶 法 的 生 物 活 性 测 定 85% 115%标 示 量受 体 结 合 的 生 物 活 性 测 定 85% 115%标 示 量 生 物 学 活 性 效 价 测 定 过 程 中标 准 品 的 作 用1、 生 物 学 活 性 测 定 变 异 范 围 大 ， 同 样 制 品 在 不同 实 验 室 测 定 结 果 差 异 很 大 ， 必 须 有 一 个 统 一的 标 准 。2、 标 准 品 的 使 用 ， 最 大 限 度 地 减 少 实 验 室 之 间和 各 种 影 响 测 定 因 素 地 干 扰 。 二 、 蛋 白 质 纯 度 检 查1、 蛋 白 质 纯 度 检 查

29、是 重 组 蛋 白 质 药 物 地 重 要 指标 之 一 。2、 按 WHO规 定 必 须 用 HPLC和 非 还 原 SDS-PAGE两 种方 法 测 定 ， 其 纯 度 都 应 达 到 95%以 上 ， 有 的 甚 至要 求 达 到 99%以 上 。3、 纯 度 的 检 查 通 常 是 在 原 液 中 进 行 。4、 方 法 ： 非 还 原 SDS-PAGE电 泳 法 、 HPLC法 、 毛细 管 电 泳 。 非 还 原 SDS-PAGE电 泳 法 ： 1、 银 染 加 样 量 5ug （ 1 10ng） 2、 考 马 斯 亮 蓝 R-250 加 样 量 10ug （ 100ng） 结 果

30、 ： 无 明 显 杂 蛋 白 带 出 现 ； 目 标 蛋白 量 应 不 低 于 总 蛋 白 量 的 95%或 98%。 蛋白 质 样 品 在 荷 质 比 均 一 。 HPLC法 ： 分 子 筛 、 反 相 层 析 ， 离 子 交换 层 析 ， 尽 量 采 用 与 SDS-PAGE原 理 不 同的 反 相 或 离 子 交 换 层 析 ， 不 主 张 用 分 子筛 分 析 。 毛 细 管 电 泳 ： 简 便 、 快 速 、 灵 敏 度 和分 辨 率 高 ； 价 格 高 、 重 现 性 差 。 几 种 检 定 重 组 蛋 白 纯 度 方 法 的 比 较特 性 HPLC SDS-PAGE、 IEF C

31、E分 离 机 制 极 性 、 非 极 性 分 配 ， 电 荷 、 等 电 点 电 荷 等 分 子 大 小 、 离 子 交 换 分 析 所 需 时 间 10 120min 几 小 时 10 30min 分 辨 力 好 好 好样 品 体 积 10 50ul 1 50ul 1 50nl 灵 敏 度 范 围 ng ug ng ug pg 定 量 准 确 性 + +分 析 方 式 紫 外 、 荧 光 、 折 射 紫 外 （ 可 见 、 荧 光 ） 同 HPLC 电 化 学 、 放 射 性 银 染 、 放 射 自 显 影仪 器 价 格 中 高 低 中 高日 常 消 耗 低 高 低自 动 化 中 高 低 中

32、 高人 力 操 作 低 高 低 制 备 级 中 中 微 量 级 制备收 集 样 品 可 以 可 以 较 困 难 用 于 研 究 蛋 白 质 纯 度 的 方 法 和 机 制 方 法 分 析 机 制 反 相 HPLC 疏 水 性 疏 水 性 相 互 作 用 HPLC 疏 水 性 毛 细 管 电 泳 荷 质 比 离 子 交 换 HPLC 电 荷 等 电 聚 焦 电 荷 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 电 荷 比 SDS聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 电 荷 ， 分 子 大 小 分 子 排 阻 HPLC 分 子 大 小 质 谱 测 量 法 分 子 大 小 三 、 蛋 白 质 含 量 测 定1、

33、 此 项 目 主 要 用 于 原 液 比 活 性 计 算 和 成 品 规 格的 控 制 。2、 可 根 据 物 理 化 学 性 质 采 用 Folin-酚 试 剂 法（ Lowry法 ） 、 染 色 法 （ Bradford法 ） 、 双 缩 脲法 、 紫 外 吸 收 法 、 HPLC法 和 凯 氏 定 氮 等 方 法 。 灵 敏 范 围 ： 5 100ug/ml；优 点 ： 简 便 、 灵 敏 度 较 高 ； 不 同 蛋 白 质间 的 变 异 少 ；缺 点 ： 受 多 种 物 质 干 扰 ， 反 应 速 度 慢 ，某 些 试 剂 不 稳 定 。 Bradford法 是 采 用 考 马 斯 亮

34、 蓝 -G250与 蛋白 质 结 合 的 原 理 ， 迅 速 、 灵 敏 的 定 量 测 定蛋 白 质 的 方 法 ； 灵 敏 范 围 ： 25 200ug/ul，需 要 时 间 ： 10min。 灵 敏 范 围 ： 0.2 2mg/ml简 单 、 省 时受 光 吸 收 物 质 影 响蛋 白 浓 度 （ mg/ml）1.55A280-0.76A260 蛋 白 质 常 用 的 定 量 方 法 的 比 较方 法 所 需 蛋 白 质 破 坏 蛋 白 质 /蛋 白 技 术 方 法 的 变 异 的 量 （ mg/ml） 与 否 质 变 化 情 况 复 杂 性 系 数 （ %）双 缩 脲 0.5 5 是

35、少 简 单 、 快 速 5Lowry 0.05 5 是 中 等 显 色 慢 、 试 剂 多 5凯 氏 定 氮 0.05 3 是 少 干 扰 、 复 杂 、 慢 0.154紫 外 吸 收 法 0.05 2 否 大 简 单 、 快 速 、 0.439（ 280nm） 干 扰 物 质 多染 料 结 合 法 0.01 0.05 是 中 等 简 单 、 快 速 3.75荧 光 法 0.001 0.01 否 中 等 较 易 3.75 四 、 蛋 白 质 药 物 理 化 性 质 的 鉴 定v 特 异 性 鉴 别 试 验v 相 对 分 子 质 量 测 定v 等 电 点 测 定v 肽 图 分 析v 吸 收 光

36、谱v 氨 基 酸 组 成 分 析v N末 端 和 C末 端 氨 基 酸 测 序 特 异 性 鉴 别 试 验v 主 要 确 定 蛋 白 质 的 抗 原 性v 免 疫 学 方 法 （ 免 疫 印 迹 、 斑 点 免 疫 、 免 疫 电 泳 、 免疫 扩 散 ） ： 根 据 抗 原 抗 体 特 异 性 反 应 建 立 的 方 法 。v 抗 体 中 和 活 性 抑 制 法 ： 此 法 可 用 于 原 液 和 成 品 的 鉴别 试 验 ， 该 方 法 简 便 易 行 、 要 求 抗 体 必 须 为 中 和 抗体 。 相 对 分 子 质 量 测 定v 还 原 型 SDS-PAGE： 蛋 白 质 在 SDS

37、和 -巯 基 乙 醇 存在 下 沸 水 浴 5min， 形 成 表 面 带 大 量 负 电 荷 的 杆 状分 子 ， 降 低 了 分 子 形 态 和 电 荷 的 影 响 ， 在 电 泳 过程 中 蛋 白 迁 移 率 基 本 只 与 其 相 对 分 子 质 量 相 关 。v 凝 胶 过 滤 （ 分 子 筛 ） 法 ： 根 据 蛋 白 分 子 大 小 和 性状 进 行 测 定 。 等 电 点 测 定v 重 组 蛋 白 质 药 物 的 等 电 点 往 往 是 不 均 一 的 ，但 在 生 产 过 程 中 批 与 批 之 间 的 电 泳 结 果 应 一 致 ，以 说 明 其 生 产 工 艺 的 稳 定

38、 性 。v 方 法 ： 等 电 聚 焦 电 泳 法 (IEF) 毛 细 管 电 泳 法 。 肽 图 分 析v 肽 图 分 析 可 作 为 与 天 然 产 品 或 参 考 品 的 蛋 白质 一 级 结 构 做 精 密 比 较 的 手 段 。v 蛋 白 质 一 般 经 化 学 裂 解 法 及 蛋 白 酶 裂 解 后 用HPLC、 SDS-PAGE电 泳 法 、 质 谱 法 测 定 。v 同 种 产 品 不 同 批 次 的 肽 图 的 一 致 性 是 工 艺 稳定 性 的 验 证 指 标 。 吸 收 光 谱v对 某 一 重 组 蛋 白 质 来 说 ， 其 最 大 吸 收 波长 是 固 定 的 。v在

39、 生 产 工 程 中 每 批 产 品 的 紫 外 吸 收 光 谱应 当 一 致 。v重 组 产 品 一 级 结 构 不 含 芳 香 族 氨 基 酸 ，可 不 做 紫 外 吸 收 光 谱 测 定 。 氨 基 酸 组 成 分 析v采 用 微 量 氨 基 酸 自 动 分 析 仪 测 定 ， 包 括 蛋白 质 水 解 ， 自 动 进 样 、 氨 基 酸 分 析 、 定 量分 析 报 告 等 。v有 柱 前 衍 生 法 和 柱 后 反 应 法 ， 前 者 是 氨 基酸 先 和 荧 光 试 剂 作 用 生 成 衍 生 物 ， 然 后 用色 谱 柱 进 行 分 离 ， 检 测 氨 基 酸 衍 生 物 的 荧

40、光 ； 后 者 是 氨 基 酸 先 用 色 谱 柱 分 离 ， 再 与茚 三 酮 、 荧 胺 等 试 剂 显 色 后 进 行 分 析 检 测 。 N-末 端 和 C-末 端 氨 基 酸 测 序v作 为 重 组 蛋 白 质 和 肽 的 重 要 鉴 别 指 标 ，一 般 要 求 至 少 测 定 N-末 端 15个 氨 基 酸 、C-末 端 1 3氨 基 酸 。 五 、 蛋 白 质 的 二 硫 键 分 析v二 硫 键 和 巯 基 与 蛋 白 质 的 生 物 活 性 密 切相 关 ， 发 生 错 误 配 对 ， 不 但 活 性 降 低 而且 会 引 起 抗 原 性 增 加 。 六 、 对 糖 蛋 白

41、的 特 殊 要 求v评 价 用 生 物 技 术 方 法 生 产 的 糖 蛋 白 时 ，应 考 虑 糖 基 化 位 点 的 上 调 或 下 调 及 其 对生 物 活 性 、 代 谢 、 稳 定 性 、 溶 解 性 的 影响 。 每 一 种 真 核 细 胞 具 有 其 独 特 的 糖 基化 能 力 称 为 它 的 糖 类 型 ， 通 过 基 因 工 程方 法 将 一 种 糖 蛋 白 在 不 同 细 胞 中 表 达 ，可 以 导 致 生 产 不 同 类 型 的 糖 蛋 白 ， 即 使在 相 同 的 细 胞 类 型 中 ， 也 可 能 会 出 现 糖形 成 时 由 于 一 些 寡 糖 的 精 细 结

42、构 不 同 等而 产 生 截 然 不 同 的 糖 蛋 白 。 七 、 残 余 杂 质 检 测 1、 对 残 余 杂 质 进 行 限 制 的 意 义 a、 残 余 杂 质 可 能 具 有 毒 性 ， 引 起 安 全性 问 题 ； b、 可 能 影 响 产 品 的 生 物 学 活 性 和 药 理作 用 ， 或 使 产 品 变 质 ； c、 反 映 产 品 生 产 工 艺 的 稳 定 性 。 残 余 杂 质 检 测 2、 残 余 杂 质 分 类 a、 外 来 污 染 物 ： 微 生 物 、 热 原 、 细 胞成 分 （ 蛋 白 质 、 DNA等 ） 、 培 养 基 成 分 、纯 化 步 骤 引 入

43、的 成 分 （ 亲 和 柱 中 的 抗 体 、增 溶 用 的 SDS） 等 ； b、 与 产 品 相 关 的 杂 质 ： 突 变 物 、 错 误裂 解 物 ， 二 硫 化 物 异 构 体 、 二 聚 体 和 多聚 体 ； 化 学 修 饰 形 态 （ 脱 酰 氨 基 或 氧 化形 式 、 其 他 降 解 产 物 ） 残 余 杂 质 检 测 内 容v宿 主 细 胞 蛋 白 含 量v宿 主 细 胞 DNAv鼠 源 型 IgG含 量 （ 10ng/剂 量 ）v蛋 白 A含 量v小 牛 血 清 残 留 量v残 余 抗 生 素 （ 氨 苄 西 林 ）v内 毒 素 含 量 （ LAL）v产 品 相 关 物

44、质v其 他 杂 质 （ 加 入 的 离 子 、 SDS、 甲 醛等 ） 宿 主 细 胞 蛋 白 含 量v以 双 抗 体 夹 心 ELISA为 宜 ， 尽 量 不 用 斑点 免 疫 。v常 采 用 5种 最 常 用 的 E.coli菌 株 混 和 作为 ELISA测 菌 体 蛋 白 含 量 的 通 用 标 准 。v不 同 表 达 体 系 对 菌 体 蛋 白 含 量 标 准 不 同 。 来 自 E.coli菌 株 的 产 品 为 不 大 于 0.1%；来 自 CHO细 胞 的 产 品 为 不 大 于 0.05%。 宿 主 细 胞 DNAv测 定 方 法 ： 采 用 DNA杂 交 实 验 ， 用 固

45、 相 斑点 杂 交 法 ， 以 地 高 辛 标 记 检 测 试 剂 盒 或者 用 同 位 素 标 记 DNA探 针 进 行 测 定 ， 必 须提 供 相 应 宿 主 细 胞 DNA标 准 品 。v现 行 生 物 制 品 规 程 对 宿 主 细 胞 DNA残 留 量标 准 作 了 相 应 调 整 ： 由 小 于 100pg/剂 量 调 整 为 小 于 10ng/剂 量 。v宿 主 细 胞 DNA只 作 为 一 种 细 胞 污 染 因 素 不作 为 一 种 危 险 因 素 。 安 全 性 及 其 他 检 测 项 目v无 菌 试 验v热 源 试 验v异 常 毒 性 试 验v免 疫 原 性 检 查v水

46、 分 、 装 量 、 pH检 测 生 物 技 术 药 物 待 测 样 品 保 存v 生 物 技 术 药 物 大 多 为 具 有 生 物 活 性 的 蛋 白质 、 多 肽 ， 易 受 环 境 条 件 的 影 响 。v 根 据 不 同 产 品 原 液 与 成 品 、 冻 干 与 液 体 制剂 的 不 同 要 求 ， 可 选 择 在 20 、 80 、4 和 常 温 条 件 下 保 存 。v冷 冻 保 存 的 原 液 样 品 最 好 分 成 小 包 装 保 存 ，避 免 反 复 冻 溶 。 检 定 方 法 的 验 证v检 定 方 法 的 验 证 就 是 根 据 方 法 的 需 要 测定 该 方 法

47、的 专 属 性 、 准 确 性 、 精 密 性 、直 线 性 、 测 定 范 围 、 测 定 限 度 、 测 量 限度 、 特 异 性 和 耐 用 性 （ 或 可 靠 性 ） 等 几个 指 标 中 的 一 个 或 几 个 。 对 于 理 化 测 定方 法 已 有 了 确 定 的 要 求 和 判 定 标 准 ， 而生 物 学 测 定 的 结 果 具 有 更 大 的 可 变 性 ，一 般 要 使 用 动 物 或 细 胞 ， 这 些 有 机 体 本身 就 具 有 较 大 的 可 变 性 ， 因 此 生 物 学 测定 的 要 求 和 合 格 标 准 要 松 一 些 。 验 证 时 应 考 虑 的 问

48、题v首 先 要 确 定 方 法 的 适 用 性 ， 该 方 法 首 先 可 以得 到 可 重 复 的 、 可 信 的 实 验 结 果 ， 要 考 虑 在以 下 几 个 参 数 ： 准 确 性 、 精 确 性 、 灵 敏 性 、特 异 性 和 耐 用 性 （ 可 靠 性 ） 。 第 二 ， 要 与 已知 的 方 法 进 行 对 比 试 验 ， 以 考 查 二 者 间 的 相互 关 系 。 如 果 在 该 实 验 室 内 无 可 对 比 的 老 方法 ， 则 首 先 建 立 标 准 的 方 法 ， 用 含 一 定 范 围浓 度 的 样 品 进 行 测 定 ， 以 标 准 方 法 所 得 结 果作

49、为 标 准 ， 用 统 计 学 的 方 法 进 行 对 比 处 理 ，得 出 二 种 方 法 间 的 相 关 系 数 。 对 于 一 个 新 建立 的 方 法 则 需 要 进 行 协 作 研 究 对 其 适 用 性 进行 验 证 。 验 证 中 需 测 定 的 参 数v1、 专 属 性 /特 异 性 （ selectivity/specificity） 是 指 当 检 测 方 法 对 测 试 样 品 中 含 有 制 品中 应 有 的 其 他 化 合 物 时 ， 测 定 待 测 物 的 能力 。 本 参 数 用 于 鉴 别 试 验 、 浓 度 或 效 力 试验 和 纯 度 试 验 的 测 定 ，

50、 以 确 定 使 用 该 检 测方 法 所 测 定 的 结 果 是 否 准 确 地 反 映 了 制 品的 鉴 别 、 效 价 或 纯 度 。 特 异 性 就 象 准 确 性一 样 ， 一 般 用 偏 差 或 测 定 值 与 已 知 值 之 间的 错 误 率 （ %） 来 表 示 。 2、 直 线 性 （ linearity） 是 测 定 结 果 与 样 品 中 测 试 物 浓 度 的 线性 关 系 ， 该 参 数 的 测 定 将 确 定 检 测 方 法的 测 量 范 围 ， 它 可 以 表 示 为 回 归 直 线 的斜 率 和 离 散 性 ， 或 者 相 关 系 数 R和 测 定系 数 R2

51、。 3、 测 量 范 围 （ Range）是 指 当 准 确 性 和 精 密 性 都 能 达 到 要 求 时 所能 测 得 的 样 品 中 待 检 物 的 最 高 和 最 低 浓 度范 围 ， 它 就 是 测 定 直 线 性 的 上 下 限 ， 如 果剂 量 和 反 应 间 的 关 系 不 成 直 线 ， 测 量 范 围可 以 通 过 校 正 曲 线 来 测 得 。 在 中 华 人 民共 和 国 药 典 中 规 定 测 量 范 围 是 指 能 达 到一 定 精 密 度 、 准 确 性 和 直 线 性 ， 测 定 方 法适 用 的 高 低 限 度 或 量 的 区 间 。 4、 准 确 性 （ a

52、ccuracy） 表 示 测 定 值 与 真 实 值 之 间 的 一 致 性 或 接 近 的程 度 。 一 般 采 用 填 加 和 回 收 试 验 来 测 定 准 确性 ， 即 将 已 知 量 的 样 品 加 到 空 白 中 进 行 测 定 ，比 较 测 定 值 与 真 实 值 之 比 。 准 确 性 一 般 表 示为 偏 差 或 测 定 值 与 真 值 之 间 的 错 误 率 （ 回 收率 ） （ 即 测 定 值 /真 实 值 100%） 。 一 般 对 于生 物 制 品 而 言 ， 因 为 没 有 纯 的 标 准 品 ， 所 以准 确 性 不 太 实 用 。 生 物 制 品 测 定 时 一

53、 般 与 同时 进 行 的 参 考 品 进 行 比 较 而 得 ， 此 时 的 合 格标 准 一 般 是 测 定 出 的 参 考 品 值 的 合 格 范 围 或样 品 与 参 考 品 之 间 的 比 值 。 5、 精 密 性 （ precision） 表 示 测 定 值 之 间的 一 致 性 或 接 近 的 程 度 ， 一 般 表 示 为 变 异系 数 (CV%)， 变 异 系 数 即 是 测 定 值 的 标 准差 与 测 定 值 的 比 值 。 精 密 性 分 几 种 ： 一 种是 实 验 内 的 精 密 性 （ 即 重 复 性 ） ， 它 是在 同 一 次 试 验 内 同 一 个 样 品

54、多 次 测 定 结 果间 的 变 异 系 数 。 另 一 种 是 试 验 间 的 精 密 性 ，它 是 在 同 一 实 验 室 内 不 同 次 试 验 间 对 同 一样 品 多 次 测 定 结 果 间 的 变 异 系 数 。 实 验 室之 间 的 精 密 性 即 重 现 性 一 般 可 通 过 协 作 研究 得 到 ， 此 参 数 不 适 合 生 产 设 施 的 验 证 。 6、 测 定 限 度 （ Limit of Detection） 是 指 能 够 测 定 出 的 样 品 中 测 试 物 的 最 低量 。 该 量 并 不 一 定 要 定 量 测 出 其 准 确 的含 量 或 浓 度 ，

55、LOD是 检 查 限 度 实 验 中 最 重要 的 一 个 参 数 。 7、 测 量 限 度 （ Limit of Quantitation）是 指 在 准 确 性 和 精 密 性 都 能 达 到 要 求 时能 够 定 量 测 定 出 的 样 品 中 测 试 物 的 最 低量 。 LOQ是 检 查 测 定 药 品 中 不 纯 物 方 法 的一 个 参 数 。 8、 耐 用 性 （ robustness/ruggedness） 是 通 过 有 效 地 改 变 实 验 方 法 的 参 数 ， 来 测定 此 改 变 对 试 验 结 果 的 影 响 ， 即 实 验 结 果不 受 影 响 的 承 受 程

56、 度 。 参 数 的 改 变 可 以 是室 温 或 培 养 温 度 ， 或 湿 度 、 或 改 变 培 养 时间 ， 或 对 试 剂 的 pH进 行 较 小 范 围 的 调 整 等 。在 每 种 试 验 条 件 下 ， 对 准 确 性 、 精 密 性 、或 其 他 参 数 进 行 测 定 ， 以 确 定 试 验 方 法 的耐 受 或 承 受 能 力 。 不 同 测 定 方 法 应 进 行 的 验 证 的 参 数 参 数 鉴 别 试 验 杂 质 检 查 效 价测 定 组 成 测 定 定 量 限 度 准 确 性 + + + 精 确 性 + + + 耐 用 性 + + + + + 直 线 性 和测

57、定 范 围 + + + 选 择 性 或特 异 性 + + + + + 测 定 限 度 + + 测 量 限 度 + 生 物 测 定 的 特 殊 性 由 于 生 物 测 定 的 持 续 性 、 复 杂 性 、 以 及 参考 品 和 样 品 贮 存 时 间 较 长 的 特 性 ， 除 了 上 述验 证 参 数 外 ， 对 于 生 物 测 定 有 另 外 几 个 参 数也 非 常 重 要 ， 包 括 ： 1、 试 验 顺 序 （ front-to-back test） 的 影响 ： 它 是 测 定 在 一 个 较 复 杂 的 试 验 中 ， 先 测和 后 测 对 试 验 参 数 的 影 响 。 这 是

58、 由 于 它 们 相对 于 对 照 品 的 测 定 时 间 不 一 样 而 造 成 的 。 生 物 测 定 的 特 殊 性 2)冻 融 稳 定 性 的 影 响 ： 将 样 品 反 复 冻 融 ，以 确 定 对 测 定 结 果 的 影 响 。 3） 批 间 的 精 密 性 ： 测 定 不 同 批 细 胞 、 血清 、 或 其 他 具 有 较 高 变 化 性 的 物 质 对 测定 方 法 精 确 性 的 影 响 。 生 物 技 术 药 物 生 物 学 活 性测 定 方 法 的 验 证 生 物 学 活 性 测 定 验 证 应 考 虑 的 问 题 ：1、 生 物 学 活 性 是 相 对 活 性 ， 须

59、 用 标 准 品 或参 比 品 作 对 照 ；2、 样 品 和 标 准 品 的 剂 量 反 应 曲 线 必 须 是 平行 的 ；3、 应 对 方 法 的 变 异 性 进 行 统 计 学 分 析 ， 确定 生 物 学 活 性 可 接 受 的 范 围 ；4、 应 对 引 起 系 统 偏 差 的 某 些 因 素 进 行 综 合分 析 。 几 种 生 物 技 术 药 物 检 验 项 目 表IFN 2b原 液1、 蛋 白 含 量 8、 宿 主 菌 蛋 残 留 量 总 蛋 白 质 的 0.1%2、 等 电 点 4.0 6.7 9、 鼠 IgG含 量 100 ng/剂 量3、 电 泳 纯 度 95.0%分

60、子 量 19.2Kg 10% 10、 残 留 外 源 性 DNA 10ng/剂 量4、 HPLC纯 度 95.0% 11、 残 留 抗 生 素 活 性5、 紫 外 光 谱 扫 描 应 为 278nm 3nm 12、 细 菌 内 毒 素 含 量 10Eu/300万 IU6、 比 活 性 1.0 10 6IU/mg 蛋 白 13、 无 菌 试 验7、 肽 图 几 种 生 物 技 术 药 物 检 验 项 目 表IFN 2b粉 针 剂 IFN 2b注 射 液1、 外 观 性 状 1、 外 观 性 状2、 PH值 6.5 7.6 2、 PH值 6.5 7.63、 水 分 3.0% 3、 装 量 1.0m

61、l4、 无 菌 试 验 4、 无 菌 试 验5、 热 源 试 验 均 低 于 0.60 总 和不 超 过 1.40 5、 热 源 试 验 均 低 于 0.60 总 和不 超 过 1.406、 效 价 测 定 标 示 量 80% 150% 6、 效 价 测 定 标 示 量 80% 150% 7、 异 常 毒 性 7、 异 常 毒 性 几 种 生 物 技 术 药 物 检 验 项 目 表IFN 2b 栓 剂 IFN 2b乳 膏 IFN 2b滴 眼 液外 观 性 状 外 观 性 状 外 观 性 状重 量 差 异 7.5% 装 量 检 查 每 支 装 量 不 得 低于 标 示 量 的 93% PH值 5

62、.0 6.0效 价 测 定 80% 150% 效 价 测 定 80% 150% 效 价 测 定 80% 150%细 菌 100个 /克 细 菌 100个 /克 无 菌 试 验霉 菌 10个 /克 霉 菌 10个 /克 装 量 检 查 每 支 装 量不 低 于 标 示 量 的 93%铜 绿 假 单 胞 菌 不 得 检 出 铜 绿 假 单 胞 菌 不 得 检 出 鉴 别 试 验金 黄 色 葡 萄 球 菌 不 得 检 出 金 黄 色 葡 萄 球 菌 不 得 检 出 栓 剂 融 变 时 限 60分 钟 鉴 别 试 验鉴 别 试 验 几 种 生 物 技 术 药 物 检 验 项 目 表重 组 人 生 长 激 素 原 液 重 组 人 生 长 激 素 粉 针 剂 外 观 性 状 外 观 性 状 含 量 及 高 分 子 蛋 白 4.0% PH值 6.5 8.5 总 相 关 蛋 白 含 量 10.0% 总 相 关 蛋 白 含 量 13.0% 无 菌 试 验 无 菌 试 验 泳 迁 移 率 电 泳 迁 移 率 肽 图 水 分 3.0% 细 菌 内 毒 素 含 量 5Eu/ mg 细 菌 内 毒 素 含 量 5Eu/ mg 含 量 及 高 分 子 蛋 白 含 量 90.0%110.0% ； 高 分 子 蛋 白 6.0%