微生物遗传变异和育种

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1、 表 型 饰 变 ：表 型 的 差 异 只 与 环 境 有 关特 点 ： 暂 时 性 、 不 可 遗 传 性 、 表 现 为 全 部 个 体 的 行 为遗 传 型 变 异 （ 基 因 变 异 、 基 因 突 变 ） ：遗 传 物 质 改 变 ， 导 致 表 型 改 变特 点 ： 遗 传 性 、 群 体 中 极 少 数 个 体 的 行 为 （ 自 发 突 变 频 率 通 常 为 10 -6-10-9） 基 因 是 生 物 体 内 具 有 自 主 复 制 能 力 的 最 小 遗 传 功能 单 位 ， 其 物 质 基 础 是 一 条 以 直 线 排 列 、 具 有 特定 核 苷 酸 序 列 的 核

2、酸 片 段 。 基 因 组 是 指 存 在 于 细 胞 或 病 毒 中 的 所 有 基 因 。 由于 现 在 发 现 许 多 非 编 码 序 列 具 有 重 要 的 功 能 ， 因此 目 前 基 因 组 的 含 义 实 际 上 是 指 细 胞 中 基 因 以 及非 基 因 的 DNA序 列 组 成 的 总 称 ， 包 括 编 码 蛋 白 质的 结 构 基 因 、 调 控 序 列 以 及 目 前 功 能 还 尚 不 清 楚的 DNA序 列 。 第 二 节 微 生 物 的 基 因 组 结 构 原 核 生 物 基 因 的 特 点 遗 传 信 息 的 连 续 性 功 能 相 关 的 结 构 基 因 组

3、 成 操 纵 子 结 构 结 构 基 因 的 单 拷 贝 及 rRNA基 因 的 多 拷 贝 基 因 组 的 重 复 序 列 少 而 短 真 核 生 物 的 基 因 的 特 点 基 因 的 不 连 续 性 ： 内 含 子 、 外 显 子 。 转 录 和 转 译 在 细 胞 中 有 空 间 分 隔 。 高 度 拷 贝 和 重 复 顺 序 ： 遗 传 丰 余 (genetic redundancy) 。2、 单 细 胞 真 核 微 生 物 啤 酒 酵 母 基 因 组 质 粒 ： 游 离 于 原 核 生 物 基 因 组 以 外 ， 具 有 独 立复 制 能 力 的 细 胞 质 遗 传 因 子 ， 存

4、 在 于 各 种 微 生物 细 胞 中 。 转 座 子 ： 位 于 染 色 体 或 质 粒 上 的 一 段 能 改 变 自身 位 置 的 DNA序 列 ， 广 泛 分 布 于 原 核 和 真 核 细胞 中 。 第 二 节 质 粒 和 转 座 因 子质 粒 和 转 座 因 子 都 是 细 胞 中 除 染 色 体 以 外 的 遗 传 因 子 。 致 育 因 子 （ F质 粒 ） ： 大 肠 杆 菌 等 部 分 细 菌 内 存 在 ， 决 定 其 性 别 并 具有 转 移 能 力 的 质 粒 。 （ F+， F-， Hfr， F） 抗 性 因 子 （ R质 粒 ） ： 表 现 为 抗 药 性 和 抗

5、 重 金 属 两 类 。 Col质 粒 ： 细 菌 素 ： 部 分 细 菌 由 质 粒 编 码 的 蛋 白 质 产 生 的能 抑 制 或 杀 死 其 他 近 源 细 菌 的 代 谢 产 物 。用 于 “ 残 害 手 足”根 据 质 粒 编 码 的 功 能 和 赋 予 宿 主 的 表 型 效 应 分 类 : 毒 性 质 粒 ： 质 粒 具 有 编 码 毒 素 的 基 因 ， 引 起 致病 菌 的 致 病 性 。 Ti质 粒 ： 诱 癌 质 粒 ， 导 致 植 物 产 生根 癌 ， 膨 大 等 现 象 ； 用 于 植 物 基 因工 程 。 Ri质 粒 ： 发 根 质 粒 ， 诱 发 双 子 叶 植

6、物 患 毛 根 瘤 ， 大 量 称 为 毛 状 根 的 不定 根 。 月 季 根 癌 代 谢 质 粒 质 粒 上 携 带 有 降 解 某 些 基 质 的 酶 的 基 因 。 仅 在 假 单 胞 菌 （ Pseudomonas） 中 发 现 。具 有 降 解 复 杂 有 毒 化 合 物 的 能 力 。 “ 超级 菌 ” 。 它 们 存 在 的 生 物 学 意 义 ， 目 前 几 乎 不 了 解 。在 应 用 上 ， 很 多 隐 秘 质 粒 被 加 以 改 造 作 为 基 因 工 程 的 载 体（ 一 般 加 上 抗 性 基 因 ） 隐 秘 质 粒 隐 秘 质 粒 不 显 示 任 何 表 型 效

7、应 ， 它 们 的 存 在 只 有通 过 物 理 的 方 法 ， 例 如 用 凝 胶 电 泳 检 测 细 胞 抽 提液 等 方 法 才 能 发 现 。三 、 质 粒 的 不 亲 和 性能 在 同 一 种 细 菌 中 并 存 的 质 粒 属 于 不 同 的 不 亲 和 群 ，反 之 同 一 不 亲 和 群 。 第 四 节 基 因 突 变 和 修 复 基 因 突 变 ： 基 因 内 部 遗 传 结 构 或 DNA序 列 的 任 何改 变 ,包 括 一 对 或 少 数 几 对 碱 基 的 缺 失 、 插 入 或 置换 ， 泛 指 遗 传 物 质 的 分 子 结 构 或 数 量 突 然 发 生 的可

8、遗 传 的 变 化 ， 可 自 发 或 诱 导 产 生 。突 变 率 （ mutation rate） 细 胞 在 每 一 世 代 中 发 生 某 一 性 状 突 变 的 几 率 。 某 一 基 因 的 突 变 一 般 是 独 立 发 生 的 ， 他 的 突 变 率 不 影 响 其 他基 因 的 突 变 。 通 常 突 变 发 生 的 几 率 为 10 -6 10-9 一 、 基 因 突 变 的 类 型 及 其 分 离碱 基 变 化 类 型 ： 同 义 突 变 、 错 义 突 变 、 无 义 突 变 、 移 码 突 变突 变 株 的 表 型 变 化 ： 营 养 缺 陷 型微 生 物 遗 传 学

9、 中 重 要 的 选 择 标 记 和 育 种 手 段 。hisC-和 hisC+ 影 印法 分离 营养 缺 陷 型 抗 药 性 突 变 型 strr 和 ampr 条 件 致 死 突 变 型 常 用 的 条 件 致 死 突 变 是 温 度 敏 感突 变 ， 用 ts 表 示 。 形 态 突 变 型 细 胞 和 菌 落 形 态 、 颜 色 、 噬 菌 斑 等 DNA重 组 技 术 中 的 蓝 白 筛 选 。 产 量 突 变 型 1.自 发 性2.不 对 应 性 细 胞 可 自 发 的 产 生 突变突 变 性 状 与 引 起 突 变的 原 因 间 无 直 接 对 应关 系3.稀 有 性 突 变 几

10、 率 为 10-6 10-9 5.独 立 性4.规 律 性 诱 变 剂 的 使 用 可 大 大提 高 突 变 几 率6.可 诱 变 性7.遗 传 和 可 逆 性 正 向 突 变 /回 复 突 变二 、 基 因 突 变 的 分 子 基 础 分 子 基 础 由 腺 嘌 呤 碱 基 互 变 异 构 导 致 的 自 发 突 变（ ）DNA聚 合 酶 产 生 的 错误 、 DNA物 理 损 伤 、重 组 和 转 座 等 。转 换 、 颠 换RNA基 因 组 的 突 变 ：RNA复 制 酶RNA修 复 机 制 诱 发 突 变 通 过 物 理 、 化 学 和 生 物 因 子 能 够 提 高 其 突 变 频

11、率， 这 一 类 物 质 称 为 诱 变 剂 。常 用 的 诱 变 剂 ： 碱 基 类 似 物 ： 碱 基 错 配 插 入 染 料 ： 移 码 突 变 直 接 与 DNA碱 基 起 化 学 反 应 的 诱 变 剂 ： EMS、 DES、 NTG 辐 射 和 热 ： 置 换 突 变 、 SOS错 误 倾 向 修 复 生 物 诱 变 因 子 ： 转 座 子 Ames实 验 诱 变 剂 与 致 癌 物 质“ 生 物 化 学 统 一 性 ” 法 则 ： 人 和 细 菌 在 DNA的 结 构 及 特 性 方 面 是 一 致 的 ， 能 使 微 生物 发 生 突 变 的 诱 变 剂 必 然 也 会 作 用

12、 于 人 的 DNA， 使 其 发 生 突变 ， 最 后 造 成 癌 变 或 其 他 不 良 的 后 果 。美 国 加 利 福 尼 亚 大 学 的 Bruce Ames教 授 于 1966年 发 明 ，因 此 称 为 Ames试 验检 测 鼠 伤 寒 沙 门 氏 菌 (Salmonella typhmurium)组 氨 酸 营 养 缺 陷 型 菌 株 (his -)的 回 复 突 变 率 。 Ames试 验 潜 在 的 某 种化 学 诱 变 剂使 得 回 复 突变 作 用 增 强 UV导 致 遗 传 物 质 产 生 嘧 啶 二 聚 体 （ TT、TC、 CC） ， 造 成 局 部 DNA分 子

13、 无 法 配 对 ，引 起 微 生 物 的 死 亡 或 突 变 。 一 般 微 生 物 具 有 光 复 活 作 用 ： 光 解 酶 Phr 在 利 用 UV进 行 诱 变 育 种 等 工 作 时 ， 应 在 红光 灯 下 进 行 照 射 和 后 继 操 作 ， 并 放 置 在 黑暗 条 件 下 培 养 。三 、 DNA损 伤 的 修 复1、 光 复 活 作 用 2、 切 除 修 复 暗 修 复 ， 细 胞 的 主 要 修复 系 统 ， 涉 及 UvrA、 UvrB、 UvrC、 UvrD 3、 重 组 修 复4、 SOS修 复DNA分 子 在 遇 到 较 大 范 围 的 重 大 损 伤 时 ，

14、 诱 导 产 生的 一 种 应 急 机 制 。越 过 损 伤 直 接 进 行 的 修 复 。 第 五 节 细 菌 基 因 转 移 和 重 组微 生 物 可 通 过 多 种 途 径 进 行 水 平 方 向 的 基 因 转 移 ，这 种 基 因 的 转 移 与 交 换 是 生 物 进 化 的 动 力 之 一 。接 合 (conjugation)：细 胞 与 细 胞 的 直 接 接 触 （ 由 F因 子 介 导 ）转 导 (transduction)： 由 噬 菌 体 介 导自 然 遗 传 转 化 (natural genetic transformation)：游 离 DNA分 子 + 感 受 态

15、 细 胞 一 、 细 菌 的 接 合 作 用 (conjugation)通 过 细 胞 与 细 胞 的 直 接 接 触而 产 生 的 遗 传 信 息 的 转 移 和重 组 过 程1.实 验 证 据 1946年 ， Joshua Lederberg 和 Edward L.Taturm细 菌 的 多 重 营 养 缺 陷 型 杂 交 实 验 2. 机 制(大 肠 杆 菌 的 接 合 机 制 )接 合 作 用 是 由 一 种 被 称 为 F因 子 的 质 粒 介 导F因 子 的 分 子 量 通 常 为 5 107， 上 面 有 编 码 细 菌 产 生 性 菌 毛（ sex pili） 及 控 制 接

16、合 过 程 进 行 的 20多 个 基 因 。含 有 F因 子 的 细 胞 ： “ 雄 性 ” 菌 株 （ F +） ， 其 细 胞 表 面 有 性 菌 毛 不 含 F因 子 的 细 胞 ： “ 雌 性 ” 菌 株 （ F-） ， 细 胞 表 面 没 有 性 菌 毛 F因 子 的 四 种 细 胞 形 式a） F-菌 株 ， 不 含 F因 子 ， 没 有 性 菌 毛 ， 但 可 以 通 过 接 合 作 用 接 收 F因 子 而 变 成 雄 性 菌 株 （ F+） ；b） F+菌 株 ， F因 子 独 立 存 在 ， 细 胞 表 面 有 性 菌 毛 。c） Hfr菌 株 ， F因 子 插 入 到

17、染 色 体 DNA上 ， 细 胞 表 面 有 性 菌 毛 。d） F 菌 株 ， Hfr菌 株 内 的 F因 子 因 不 正 常 切 割 而 脱 离 染 色 体 时 ， 形 成 游 离 的 但 携 带 一 小 段 染 色 体 基 因 的 F因 子 ， 特 称 为 F因 子 。 细 胞 表 面 同 样 有 性 菌 毛 。 Hfr菌 株 的 F因 子 插 入 到 染 色 体 DNA上 ， 因 此 只 要 发 生 接 合 转 移 过程 ， 就 可 以 把 部 分 甚 至 全 部 细 菌 染 色 体 传 递 给 F-细 胞 并 发 生 重 组， 由 此 而 得 名 为 高 频 重 组 菌 株 。2）

18、Hfr F-杂 交 染 色 体 上 越 靠 近 F因 子 的 先 导 区 的 基 因 ， 进 入 的 机 会就 越 多 ， 在 F-中 出 现 重 组 子 的 的 时 间 就 越 早 ， 频 率 也 高 。F因 子 不 易 转 入 受 体 细 胞 中 ， 故 Hfr F -杂 交 后 的 受 体 细 胞 （ 或 称 接 合 子 ） 大 多数 仍 然 是 F-。 3） F F-杂 交Hfr菌 株 内 的 F因 子 因 不 正 常 切 割 而 脱 离 染 色 体 时 ，形 成 游 离 的 但 携 带 一 小 段 染 色 体 基 因 的 F因 子 ，特 称 为 F因 子 。F F-与 F+ F-的

19、不 同 ： 给 体 的部 分 染 色 体 基 因 随 F一 起 转 入 受 体 细 胞a） 与 染 色 体 发 生 重 组 ；b） 继 续 存 在 于 F因 子 上 ， 形 成 一 种 部 分 二 倍 体 ； 细 胞 基 因 的 这 种 转 移 过 程 又 常 称 为 性 导 （ sexduction） 、 F因 子 转 导（ F-duction） ， 或 F因 子 媒 介 的 转 导 （ F-mediated transduction） 。 二 、 细 菌 的 转 导 （ transduction）由 噬 菌 体 介 导 的 细 菌 细 胞 间 进 行 遗 传 交 换 的 一 种 方 式 ：

20、 一 个 细 胞 的 DNA通 过 病 毒 载 体 的 感 染 转 移 到 另 一 个 细 胞 中能 将 一 个 细 菌 宿 主 的 部 分 染 色 体 或 质 粒 DNA带 到 另 一 个 细 菌 的 噬 菌 体 称 为 转 导 噬 菌 体细 菌 转 导 的 二 种 类 型 ： 普 遍 性 转 导局 限 性 转 导 1、 普 遍 性 转 导 （ generalized transduction）噬 菌 体 可 以 转 导 给 体 染 色 体 的 任 何 部 分 到 受 体 细 胞 中 的 转 导 过 程(1) 意 外 的 发 现1951年 ， Joshua Lederberg和 Norton

21、 Zinder为 了 证 实 大 肠 杆 菌 以 外的 其 它 菌 种 是 否 也 存 在 接 合 作 用 ， 用 二 株 具 不 同 的 多 重 营 养 缺 陷 型的 鼠 伤 寒 沙 门 氏 菌 进 行 类 似 的 实 验 ：用 “ U” 型 管 进 行 同 样 的 实 验 时 ， 在 给 体 和 受 体 细 胞不 接 触 的 情 况 下 ， 同 样 出 现 原 养 型 细 菌 ！ 沙 门 氏 菌 LT22A是 携 带 P22噬 菌 体 的 溶 源 性 细 菌 另 一 株 是 非 溶 源 性 细 菌一 个 表 面 看 起 来 的 常 规 研 究 却 导 致一 个 惊 奇 和 十 分 重 要

22、发 现 的 重 要 例 证 ！基 因 的 传 递 很 可 能 是 由 可 透 过 “ U”型 管 滤 板的 P22噬 菌 体 介 导 的（ 普 遍 性 转 导 这 一 重 要 的 基 因 转 移 途 径 的 发 现 ） (2) 转导模型 发 生 频 率： 10-6-10-8 通 过 同 源 重 组形 成 转 导 子 转 导 噬 菌 体 为 什 么 “ 错”将 宿 主 的 DNA包 裹 进 去 ?噬 菌 体 P22的 DNA包 装 酶 酶 也 能 识 别 染 色 体 DNA上 类 似 pac的 位 点并 进 行 切 割 ， 以 “ headful” 的 包 装 机 制 包 装 进 P22噬 菌

23、体 外 壳 ，形 成 只 含 宿 主 DNA的 转 导 噬 菌 体 颗 粒 （ 假 噬 菌 体 ） 。因 为 染 色 体 上 的 pac与P22 DNA的 pac序 列 不完 全 相 同 ， 利 用 效 率较 低 ， 这 种 “ 错 装 ”机 率 一 般 仅 约 10 -6-10-8 形 成 转 导 颗 粒 的 噬 菌 体 可 以 是 温 和 的 也 可 以 是 烈 性 的 ， 但 必 须具 有 能 偶 尔 识 别 宿 主 DNA的 包 装 机 制 并 在 宿 主 基 因 组 完 全 降 解以 前 进 行 包 装 。普 遍 性 转 导 的 基 本 要 求 ： 普 遍 性 转 导 的 三 种 后

24、 果 ：进 入 受 体 的 外 源 DNA通 过 与 细 胞 染 色 体的 重 组 交 换 而 形 成 稳 定 的 转 导 子 流 产 转 导 （ abortive transduction）转 导 DNA不 能 进 行 重 组 和 复 制 ， 但 其携 带 的 基 因 可 经 过 转 录 而 得 到 表 达 。特 点 ： 在 选 择 培 养 基 平 板 上 形 成 微 小 菌 落 外 源 DNA被 降 解 ， 转 导 失 败 。 DNA不 能 复 制 ， 因 此 群 体 中 仅 一 个 细 胞 含 有 DNA，而 其 它 细 胞 只 能 得 到 其 基 因 产 物 ， 形 成 微 小 菌 落

25、 。 2、 局 限 性 转 导 （ specialized transduction）（ 参 见 P219）温 和 噬 菌 体 感 染整 合 到 细 菌 染 色 体 的 特 定 位 点 上宿 主 细 胞 发 生 溶 源 化溶 源 菌 因 诱 导 而 发 生 裂 解 时 ，在 前 噬 菌 体 二 侧 的 少 数 宿 主基 因 因 偶 尔 发 生 的 不 正 常 切割 而 连 在 噬 菌 体 DNA上部 分 缺 陷 的 温 和 噬 菌 体 把 供 体 菌 的 少 数 特 定 基 因 转 移 到 受 体 菌 中 2、 局 限 性 转 导 （ specialized transduction）温 和

26、噬 菌 体 裂 解 时 的不 正 常 切 割 ： 包 含 gal或 bio基 因（ 几 率 一 般 仅 有 10-6）缺 陷 噬 菌 体 在 宿 主 细 胞 内 能 够 象 正 常 的 DNA分 子 一 样 进 行 复 制 、包 装 ， 提 供 所 需 要 的 裂 解 功 能 ， 形 成 转 导 颗 粒 。 但 没 有 正 常 噬 菌 体 的 溶 源 性 和 增 殖 能 力 ， 感 染 受 体 细 胞 后 ， 通 过DNA整 合 进 宿 主 染 色 体 而 形 成 稳 定 的 转 导 子 。 局 限 性 转 导 与 普 遍 性 转 导 的 主 要 区 别 ：a） 被 转 导 的 基 因 共 价

27、 地 与 噬 菌 体 DNA连 接 ， 与 噬 菌 体 DNA一 起 进 行 复 制 、 包 装 以 及 被 导 入 受 体 细 胞 中 。 而 普 遍 性 转 导 包 装 的 可 能 全 部 是 宿 主 菌 的 基 因 。b） 局 限 性 转 导 颗 粒 携 带 特 定 的 染 色 体 片 段 并 将 固 定 的 个 别 基 因 导 入 受 体 ， 故 称 为 局 限 性 转 导 。 而 普 遍 性 转 导 携 带 的 宿 主 基 因 具 有 随 机 性 。2、 局 限 性 转 导 （ specialized transduction） 溶 源 转 变 （ lysogenic convers

28、ion） ：一 个 与 转 导 相 似 又 不 同 的 现 象温 和 噬 菌 体 感 染 细 胞 后 使 之 发 生 溶 源 化 ， 因 噬 菌 体 的 基 因整 合 到 宿 主 染 色 体 上 ， 而 使 后 者 获 得 了 新 性 状 的 现 象 。溶 源 转 变 与 转 导 的 不 同 ？a） 不 携 带 任 何 供 体 菌 的 基 因 ； b） 这 种 噬 菌 体 是 完 整 的 ， 而 不 是 缺 陷 的 ； 三 、 细 菌 的 遗 传 转 化 （ genetic transformation）定 义 ： 同 源 或 异 源 的 游 离 DNA分 子 (质 粒 和 染 色 体 DNA

29、)被 自 然或 人 工 感 受 态 细 胞 摄 取 ， 并 得 到 表 达 的 水 平 方 向 的 基 因 转 移 过 程 。自 然 遗 传 转 化 （ natural genetic transformation）人 工 转 化 （ artificial transformation）感 受 态 细 胞 ： 具 有 摄 取 外 源 DNA能 力 的 细 胞（ petent cell） 自 然 感 受 态 与 人 工 感 受 态 的 不 同 ？自 然 感 受 态 的 出 现 是 细 胞 一 定 生 长 阶 段 的 生 理 特 性 ， 受 细 菌 自 身 的 基 因 控 制 ；人 工 感 受 态

30、 则 是 通 过 人 为 诱 导 的 方 法 ， 使 细 胞 具 有 摄 取 DNA的 能 力 ， 或 人 为 地 将 DNA导 入 细 胞 内 。 （ 该 过 程 与 细 菌 自 身 的 遗 传 控 制 无 关 ！ ） 1、 自 然 遗 传 转 化 （ 简 称 自 然 转 化 ）1928年 ， Griffith发 现 肺 炎 链 球 菌 （ Streptococcus pneumoniae） 的 转 化 现 象目 前 已 知 有 二 十 多 个 种 的 细 菌 具 有 自 然 转 化 的 能 力 。进 行 自 然 转 化 ， 需 要 二 方 面 必 要 的 条 件 ：建 立 了 感 受 态

31、的 受 体 细 胞外 源 游 离 DNA分 子 枯 草 芽 孢 杆 菌 的 自 然 转 化 过 程 （ 革 兰 氏 阳 性 菌 的 转 化 模 型 ） 自 然 转 化 过 程 的 特 点 ：a） 对 核 酸 酶 敏 感 ；c） 转 化 是 否 成 功 及 转 化 效 率 的 高 低 主 要 取 决 于 转 化 （ DNA） 给 体 菌 株 和 转 化 受 体 菌 株 之 间 的 亲 源 关 系 ；d） 通 常 情 况 下 质 粒 的 自 然 转 化 效 率 要 低 得 多 ；提 高 质 粒 的 自 然 转 化 效 率 的 二 种 方 法 ：1） 使 质 粒 形 成 多 聚 体 ， 这 样 进

32、入 细 胞 后 重 新 组 合 成 有 活 性 的 质 粒 的 几 率 大 大 提 高 ；2） 在 质 粒 上 插 入 受 体 菌 染 色 体 的 部 分 片 段 ， 或 将 质 粒 转 化 进 含 有 与 该 质 粒 具 有 同 源 区 段 的 质 粒 的 受 体 菌 -重 组 获 救b） 不 需 要 活 的 DNA给 体 细 胞 ； 噬 菌 体 DNA被 感 受 态 细 胞 摄 取 并 产 生 有 活 性 的 病 毒 颗 粒转 染 (transfection)：现 在 把 DNA转 移 至 动 物 细 胞 的 过 程 也 称 转 染提 纯 的 噬 菌 体 DNA以 转 化 的 （ 而 非

33、感 染 ） 途 径 进 入 细 胞并 表 达 后 产 生 完 整 的 病 毒 颗 粒 。特 点 ： 自 然 遗 传 转 化 的 进 行 涉 及 到 细 菌 染 色 体 上 几 十 个基 因 的 功 能 及 彼 此 间 的 相 互 协 调 ， 因 此 被 认 为 是名 副 其 实 的 细 菌 水 平 基 因 转 移 途 径 。目 前 的 研 究 热 点 ：1） 细 菌 为 什 么 要 耗 费 如 此 多 的 染 色 体 遗 传 资 源 来 进 行 自 然 转 化 ， 即 该 过 程 的 生 物 学 意 义 到 底 何 在 ？ 它 对 细 菌 自 身 有 什 么 好 处 ？ （ 人 们 已 提 出

34、 了 一 些 假 说 ， 但 均 不 圆 满 ）2） 自 然 转 化 过 程 的 很 多 细 节 仍 不 清 楚 ， 包 括 细 菌 如 何 协 调 感 受 态 的 建 立 ， 外 源 DNA进 入 和 重 组 的 具 体 过 程 等 等3） 细 菌 中 具 有 自 然 转 化 能 力 的 范 围 ， 到 底 有 那 些 菌 具 有 自 然 转 化 能 力 ？ 4） 转 化 DNA的 来 源 和 在 自 然 环 境 中 发 生 的 自 然 转 化 2、 人 工 转 化用 CaCl 2处 理 细 胞 ， 电 穿 孔 等 是 常 用 的 人 工 转 化 手 段 。 在 自 然 转 化 的 基 础

35、上 发 展 和 建 立 的 一 项 细 菌 基 因 重 组 手 段 ，是 基 因 工 程 的 奠 基 石 和 基 础 技 术 。不 是 由 细 菌 自 身 的 基 因 所 控 制 ；用 多 种 不 同 的 技 术 处 理 受 体 细 胞 ， 使 其 人 为 地 处 于 一种 可 以 摄 取 外 源 DNA的 “ 人 工 感 受 态 ” 。质 粒 的 转 化 效 率 高 ； 原 生 质 体 融 合 ： 通 过 人 为 的 方 法 ， 使 遗 传 性 状 不 同 的 两个 细 胞 的 原 生 质 体 进 行 融 合 ， 借 以 获 得 兼 有双 亲 遗 传 性 状 的 稳 定 重 组 子 的 过

36、程 。 技 术 路 线 ：亲 本 菌 株 A 亲 本 菌 株 B脱 壁 方 法 ？原 生 质 体 A、 B遗 传 标 记 遗 传 标 记助 融 剂等 渗 培 养 基 ， 再 生 出 菌 落 选 择 培 养 基 ，筛 选 目 标 菌 第 七 节 微 生 物 育 种 一 、 自 发 突 变 与 育 种 （ breeding by spontaneous mutation） 1.从 生 产 中 育 种 仔 细 观 察 ， 做 “ 伯 乐 ” 2.定 向 培 育 优 良 菌 株 卡 介 苗 （ BCG vaccine） ： Bacillus Calmette-Guerin A.CalmetteC.Gu

37、erin 二 、 诱 变 育 种（ breeding by induced mutation） 诱 变 育 种 是 指 利 用 物 理 、 化 学 等 诱 变 剂 处 理 均 匀而 分 散 的 微 生 物 细 胞 群 ， 在 促 进 其 突 变 率 显 著 提高 的 基 础 上 ， 采 用 简 便 、 快 速 和 高 效 的 筛 选 方 法 ，从 中 挑 选 出 少 数 符 合 目 的 的 突 变 株 ， 以 供 科 学 试验 和 生 产 实 践 使 用 。 常 用 的 诱 变 方 法 ： 紫 外 线 化 学 诱 变 剂 诱 变 育 种 的 几 个 原 则1.选 择 简 便 有 效 的 诱 变

38、 剂诱变剂 物 理 诱 变 剂 ：化 学 诱 变 剂 ： 紫 外 线 、 激 光 、 离 子 束 、 r Ray烷 化 剂 、 碱 基 类 似 物 等 2.挑 选 优 良 的 出 发 菌 株 依 靠 经 验3.处 理 单 细 胞 或 单 孢 子 悬 液 应 尽 量 选 用 单 核细 胞 ， 丝 状 菌 应选 用 单 孢 子 。4.选 用 最 适 的 诱 变 剂 量 剂 量 存 活 率曲 线 ， 剂 量诱 变 率 曲 线 5.充 分 利 用 复 合 处 理 的 协 同 效 应 6.利 用 和 创 造 形 态 、 生 理 与 产 量 间 的 相 关 指 标利 用 蛋 白 酶 水解 圈 、 淀 粉

39、酶变 色 圈 、 纤 维素 水 解 圈 等7.设 计 高 效 筛 选 方 案8.创 造 新 型 筛 选 方 法 结 合 具 体 的 目标 ， 大 胆 尝 试， 勇 于 创 新 。 1.营 养 缺 陷 型 突 变 株 的 筛 选筛 选 策 略 2.抗 阻 遏 和 抗 反 馈 突 变 型 G lucose Asp-P ASA Asp Hse Met ThrLys hom- 遗传缺陷位置 解除反馈抑制 PL Pyr AlaAla- Thr- AK 选 育 AECr突 变 株表 型 特 征 ： 当 细 胞 中 已有 大 量 最 终 代 谢 产 物 积累 的 情 况 下 ,仍 能 不 断 地合 成 这

40、一 产 物 。选 育 结 构 类 似 物 抗 性突 变 株 。3.抗 性 突 变 株 三 、 代 谢 工 程 育 种 利 用 基 因 工 程 技 术 对 微 生 物 代 谢 网 络 中 特 定 代 谢 途 径 进行 有 精 确 目 标 的 基 因 操 作 ， 改 变 微 生 物 的 代 谢 调 节 系 统 ，使 目 的 产 物 产 量 大 幅 提 高 的 一 种 育 种 技 术 。 改 变 代 谢 途 径 XDHAraDH耐 高 渗 酵 母 NX-6 醋 酸 杆 菌 属 NAD+NADH ？葡 萄 糖 D-阿 拉 伯 糖 醇 D-木 酮 糖 木 糖 醇 扩 展 代 谢 途 径某 Bacillus subtilis 中 的 合 成 酶 基 因 及 其 上 下 游 基 因 序 列 rbsRKDACB ywsC ywtA ywtB ywtC ywtD 例 1 例 2 P43476bp 构 建 方 案B. subtilis 168 pP43NMK7680bpP43P43PCR MCS多 克 隆 位 点ywsC 、 ywtA ywtB OverlapPCR 构 建 新 的 代 谢 途 径