影响体外受精效果的因素

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1、影 响 体 外 受 精 效 果 的 因 素 历 史 与 背 景 1878年 ， 德 国 科 学 家 Schenk将 体 内 成 熟 的 家 兔和 豚 鼠 卵 子 与 附 睾 精 子 放 入 子 宫 液 中 培 养 ， 观察 到 第 二 极 体 排 出 和 卵 裂 现 象 。 1944年 ， Pock和 Menkin进 行 人 卵 的 体 外 受 精实 验 。 1945年 ， 美 籍 华 人 张 明 觉 成 功 进 行 了 兔 的 体 外受 精 实 验 。 1959年 ， 美 籍 华 人 张 明 觉 利 用 获 能 处 理 的 家 兔精 子 进 行 体 外 受 精 实 验 ， 获 得 了 世 界

2、 上 第 一 批体 外 受 精 的 试 管 小 兔 。 IVF的 意 义1. 可 利 用 屠 宰 场 的 卵 巢 生 产 大 量 价 廉 质 优 的 胚胎 ， 可 解 决 胚 胎 移 植 的 胚 胎 来 源 问 题 。2. 可 使 因 生 殖 道 疾 病 而 无 繁 殖 能 力 的 优 良 母 牛仍 能 繁 殖 一 定 数 量 的 后 代 。3. 可 结 合 活 体 采 卵 技 术 ， 充 分 发 挥 优 良 母 牛 的繁 殖 潜 力 。4. 可 开 发 利 用 大 量 的 腔 前 卵 母 细 胞 ， 进 一 步 挖掘 良 种 母 牛 的 繁 殖 潜 力 。 IVF的 意 义5. 可 使 未

3、成 熟 的 牛 犊 繁 殖 后 代 ， 大 大 缩 短 育 种的 世 代 间 隔 。6. 可 结 合 精 子 分 离 技 术 生 产 预 知 性 别 的 胚 胎 ，达 到 了 控 制 性 别 的 目 的 。7. 可 为 核 移 植 和 基 因 转 移 提 供 丰 富 的 实 验 材 料和 必 要 的 辅 助 手 段 ， 加 速 其 研 究 的 进 展 。8. 可 作 研 究 的 手 段 ， 加 深 人 们 对 卵 母 细 胞 发 生与 成 熟 ， 精 子 的 获 能 与 受 精 以 及 胚 胎 的 早 期发 生 等 理 论 问 题 的 认 识 . 体 外 受 精 技 术由 卵 母 细 胞 成

4、熟精 子 获 能受 精受 精 卵 体 外 培 养胚 胎 移 植 程 序 组 成 的 完 整 系 统 . 精 子 获 能capacitation一 般 认 为 ， 雄 性 动 物 产 生 的 精 子 必 须 在 雌性 生 殖 道 内 停 留 一 定 的 时 间 ， 发 生 一定 的 生 理 变 化 后 才 能 具 备 受 精 能 力 。 此 过程 称 为 精 子 获 能 。 精 子 的 获 能 过 程 是多 时 相 ， 多 步 骤 的 复 杂 过 程 。 获 能 阶 段第 一 阶 段 ： 获 能 的 第 一 阶 段 是 脱 出 精 子 表 面 的 抗 原 物 质 和 去 能 因 子 ， 增 强

5、了 膜 通 透性 。 此 过 程 在 一 定 程 度 是 可 逆 。 第 二 阶 段 ： 是 精 子 细 胞 膜 蛋 白 变 化 ， 即 发 生 顶 体 反应 。 此 过 程 是 不 可 逆 的 结 构 上 的 获 能 。 精 子 获 能 方 法 有 两 种 ： 即 体 内 获 能 和体 外 获 能 。 休 内 获 能是 从 交 配 母 畜 的 子 宫 内 冲 取 精 子 用 于 受 精 。 体 外 获 能分 两 步 ：一 ： 精 子 洗 涤 。 离 心 以 除 去 杂 质 ， 精 清 ，死 精 子 ， 低 活 力 的 精 子 ， 冻 精 保 护 液 及稀 释 液 。二 ： 获 能 处 理 ，

6、 主 要 是 使 用 离 子 强 度 液（ His)， 钙 离 子 载 体 ， 肝 素 （ 10100ug/ml, 15min)等 。 精 子 体 外 获 能 的 主 要 方 法1) 高 渗 溶 液 处 理 法 ： 受 精 前 用 360mOm的 高 渗溶 液 处 理 精 子 30分 钟 ， 然 后 进 行 受 精 。2) 肝 素 处 理 法 ： 用 含 100mg/ml肝 素 的 受 精 液 。3) 用 Ca2+载 体 A23187提 高 精 子 内 部 Ca2+的 浓 度 。4) 与 血 清 白 蛋 白 的 溶 液 长 时 间 孵 育 5) 与 含 有 卵 泡 液 的 培 养 液 进 行

7、孵 育 体 外 受 精 的 培 养 系 统目 前 通 常 采 用 的 受 精 系 统 由 微 滴 法 和 微 孔 板 法 。1. 微 滴 法 ： 液 滴 体 积 通 常 为 30 50ml， 上 覆 石蜡 油 。 该 法 的 优 点 是 受 精 效 果 好 ， 精 子 利 用率 高 ； 缺 点 是 需 用 石 蜡 油 ， 比 较 麻 烦 。2. 微 孔 板 法 ： 受 精 液 体 积 通 常 为 0.5 0.8ml，上 覆 石 蜡 油 或 不 加 石 蜡 油 。 该 法 的 优 点 是 操作 简 单 ， 一 次 可 受 精 大 量 的 卵 子 ； 缺 点 是 精子 的 利 用 率 相 对 较

8、低 ， 受 精 后 的 胚 胎 发 育 率也 不 如 微 滴 法 好 。 卵 母 细 胞 体 外 受 精 的 评 定 体 外 培 养 ： 受 精 后 48小 时 可 检 查 其 受 精 分 裂 率 ， 体外 培 养 7天 后 检 查 囊 胚 发 育 率 ， 培 养 9天后 ， 检 查 囊 胚 的 孵 化 率 。 卵 子 体 外 受 精 的 影 响 因 素精 子 的 来 源1. 取 自 附 睾 的 精 子 比 体 外 采 集 的 精 子 容 易 在 体外 诱 发 获 能 ， 故 通 常 可 获 得 较 高 的 受 精 率 。2. 来 自 不 同 公 畜 的 精 液 在 活 力 、 获 能 及 顶

9、 体 反应 的 难 易 程 度 上 均 存 在 明 显 差 异 。3. 不 同 公 畜 个 体 精 子 的 受 精 分 裂 率 有 差 异 ， 但其 胚 胎 发 育 率 的 差 异 则 更 为 明 显 。4. 同 一 公 畜 个 体 在 不 同 季 节 采 集 的 精 液 ， 其 体外 受 精 效 果 无 明 显 差 异 。 受 精 滴 中 精 子 不 同 平 衡 时 间 以 加 入 精 子 时 间 为 0h(对 照 组 ),分 别 在0h,0.5h,1h,2h,4h随 机 加 入 等 数 卵 母 细 胞到 各 受 精 滴 ,结 果 显 示 :0h,0.5h组 卵 裂 率较 高 ,分 别 为

10、87.7%、 84.7%,与 其 他 组 相比 差 异 显 著 (P0.01);0.5h组 的 囊 胚 率 最高 ,为 67.5%,与 对 照 组 的 57.7%比 较 差 异显 著 (P0.01)。 结 果 表 明 ,受 精 滴 中 精 子经 过 0.5h平 衡 后 ,弱 精 及 死 精 粘 聚 沉 淀 ,余下 活 力 强 的 健 壮 精 子 ,此 时 加 入 牛 卵 母 细胞 受 精 ,可 获 得 较 高 卵 裂 率 及 囊 胚 率 。 (文 国 艺 ,阳 年 生 ;1999年 月 11月 ) 受 精 液 及 其 成 分受 精 液 必 须 有 利 于 精 子 的 获 能 和 卵 子 第 二

11、次 成 熟 分 裂 的 完 成 。 故 通 常 为 成 分 较 为简 单 的 生 理 盐 溶 液 。 最 为 常 用 受 精 液 通 常 为 TALP和 BO， 其 渗 透 压 一般 为 285 295mosm， 内 含 10mM的 乳 酸 钠 、1mM的 丙 酮 酸 钠 和 2mM的 Ca2+， 其 中 Ca2+ 起 关 键 作 用 。 BO液 中 的 NaHCO3浓 度 高 达35.7 mM， 不 含 Hepes， 主 要 用 于 用 A23187作 为 获 能 剂 的 受 精 液 。 TALP的 NaHCO3浓 度通 常 为 25 30 mM， 内 含 5 10mM的 Hepes，主 要

12、 用 于 用 肝 素 作 为 获 能 剂 的 受 精 液 。 受 精 用 液 种 类 的 影 响 应 用 改 良 Tyrodes液 (简 称 T， 对 照 组 )与0.6%BSA-TCM199(简 称 BT)作 为 受 精 液 实验 1)、 这 两 种 受 精 液 的 不 同 配 比 作 为 受 精 液(T， BT分 别 为 3:1、 l:1和 1:3， T为 对 照 组 ，实 验 2)和 在 不 同 受 精 时 间 采 用 不 同 受 精 液 (先用 T， IVF 24h后 改 用 BT或 TCM199+10%发情 牛 血 清 ， 实 验 3)， 对 经 体 外 成 熟 培 养 后 的牛 卵

13、 母 IVF效 果 的 影 响 。 结 果 ， 应 用 成 分 复杂 的 BT作 为 受 精 液 ， 可 以 提 高 受 精 卵 体 外 囊胚 发 育 率 结 果 说 明 ， 在 现 行 使 用 的 、 成 分 简 单 的改 良 Tyrodes受 精 液 中 ， 添 加 一 定 浓 度(25%50%)含 0.6%BSA的 TCM199，作 为 IVM后 的 牛 卵 母 细 胞 体 外 受 精 液 ，可 以 明 显 提 高 体 外 受 精 的 质 量 ， 从 而 提高 胚 胎 的 最 终 产 量 。 (谭 世 俭 ， 卢 克 焕 ， 1994年 6月 ） 受 精 液 中 肝 素 和 咖 啡 因

14、的 组 合 采 用 2种 肝 素 浓 度 (10， 30mg/L)与 3种 咖 啡 因 浓度 (2 .5， 5， 10mmol/L)的 交 叉 组 合 ， 以 30 mg/L肝 素 的 受 精 液 为 对 照 ， 探 讨 肝 素 和 咖 啡因 对 牛 卵 母 细 胞 体 外 受 精 的 影 响 ， 并 确 定 受精 后 将 卵 母 细 胞 移 至 单 层 细 胞 的 合 适 时 间 。结 果 表 明 ， 当 卵 母 细 胞 在 受 精 后 5h移 至 单 层细 胞 时 ， 10mg/L肝 素 加 5mmol/L咖 啡 因 或30mg/L肝 素 加 2.5mmol/L咖 啡 因 的 体 外 受

15、精效 果 最 好 .(文 国 艺 ,卢 克 焕 ;1994) BOEC+CCS、 TAUTIN(输 卵 管 上 皮 细 胞 +颗 粒 细 胞 ,牛 磺 酸 ) 在 受 精 液 添 加 BOEC+CCS后 ,能 显 著 提 高 体 外受 精 率 。 这 可 能 是 添 加 BOEC + CCS能 模 拟输 卵 管 内 环 境 ,从 而 改 善 受 精 环 境 ,增 强 精 子 活力 ,并 能 够 清 除 代 谢 垃 圾 。 SNandi等 (1998)将刚 射 出 的 牛 精 子 与 BOEC共 培 养 了 6小 时 ,发现 精 子 的 获 能 明 显 增 加 。 . .Martus等(1998

16、)从 输 卵 管 液 中 分 离 到 了 输 卵 管 糖 蛋 白 ,并 证 明 它 在 牛 的 体 外 受 精 中 能 显 著 提 高 受 精率 。 卵 丘 细 胞 在 卵 母 细 胞 体 外 成 熟 阶 段 ， 卵 母 细 胞 周围 的 卵 丘 细 胞 数 量 的 多 少 ， 对 其 随 后 的受 精 和 卵 裂 以 及 胚 胎 发 育 均 有 很 大 的 影响 。 然 而 ， 在 受 精 阶 段 ， 卵 母 细 胞 周 围的 卵 丘 细 胞 存 在 与 否 ， 对 其 随 后 的 受 精及 卵 裂 无 关 重 要 。 (杨 膺 白 ,卢 克 焕 ,1994) 温 度 在 一 定 温 度 范

17、 围 内 ,受 精 温 度 的 升 高 ,精 子 对 卵母 细 胞 的 穿 透 率 也 相 应 提 高 (Lenz,1982;Ball等 ,1984)。 在 37 39 范 围 ,体 外 受 精 温 度 对牛 卵 母 细 胞 受 精 率 及 卵 裂 率 无 明 显 影 响 ,但 对受 精 卵 的 囊 胚 发 育 率 及 孵 化 率 有 明 显 影 响 (谭世 俭 等 ,1983)。 本 研 究 将 体 外 受 精 的 温 度 设定 为 37、 38、 39 时 ,体 外 受 精 温 度 对 延 边 黄牛 受 精 卵 的 卵 裂 率 无 明 显 差 ,39 为 受 精 卵 的最 佳 体 外 发

18、育 温 度 。 冷 冻 条 件 (温 度 ) 比 较 了 乙 二 醇 (EG)、 丙 二 醇 (PG)、 二 甲基 亚 砜 (DMSO)、 甘 油 (G)和 不 同 的 投 液氮 温 度 (-33 或 -40 ),对 牛 体 外 受 精 卵冷 冻 后 发 育 率 的 影 响 。 结 果 表 明 :投 液氮 温 度 以 -40 为 较 好 ,防 冻 剂 以 EG的 冷冻 效 果 为 最 佳 。 玻 璃 化 冷 冻 法 完 全 可 以应 用 于 冷 冻 牛 体 外 受 精 卵 。 (黄 凤 玲 ,石 德 顺 ,卢 克 焕 ;2002) 体 细 胞 因 子 精 子 的 获 能 和 受 精 是 在 输

19、 卵 管 中 完 成 的 ，因 此 ， 输 卵 管 上 皮 细 胞 的 分 泌 因 子 可 能对 精 子 的 获 能 和 受 精 具 有 促 进 作 用 。 体 细 胞 因 子 BFF(牛 卵 泡 液 )对 牛 卵 母 细 胞 的 体 外 受精 具 抑 制 作 用 ， 而 内 膜 细 胞 的 条 件 液 则具 促 进 效 应 。 BFF的 这 种 受 精 抑 制 因 子可 能 来 自 血 清 而 不 是 卵 泡 细 胞 。 (石 德 顺 ,卢 克 焕 ,1994) 水 质 水 质 对 体 外 受 精 的 成 功 与 否 至 关 重 要 。Bavister（ 1988） 发 现 ， 培 养 液

20、在 贮 存过 程 中 ， CO2和 碳 酸 盐 流 失 ， 致 使 pH升 高 ， 对 精 卵 产 生 有 害 的 影 响 。 我 们 的研 究 发 现 ， 水 源 质 量 对 IVF有 明 显 影 响 ，在 受 精 液 中 加 入 50 mM的 EDTA， 可 除去 重 金 属 离 子 ， 降 低 水 质 对 IVF的 影 响 精 卵 比 率精 子 的 浓 度 过 高 易 引 起 多 精 子 受 精 ， 过 低又 影 响 受 精 率 。 通 常 用 于 体 外 受 精 的 精子 浓 度 为 1.05.0 106/ml， 精 卵 比 率 为1000020000:1。 在 有 咖 啡 因 存 在

21、 的 条件 下 ， 精 子 浓 度 可 降 低 为 0.5 106/ml，精 卵 比 率 可 降 低 为 5002000:1。 温 度牛 体 外 受 精 的 最 适 温 度 是 39 ， 如 果 采 用37 ， 受 精 率 则 下 降 15%以 上 （ Sharif，1992） 。 Cheng等 （ 1986） 对 猪 的 体 外受 精 亦 发 现 ， 37 时 的 受 精 率 不 到 1%，而 39 时 则 达 39%。 Watson等 （ 1991）发 现 羊 精 子 的 顶 体 反 应 也 与 温 度 显 著 相关 。 气 相 环 境通 常 采 用 含 5%CO2的 空 气 。 虽 然

22、胚 胎 的 体外 培 养 采 用 5% CO2， 5%O2和 90%N2的 气 相 环 境 培 养 效 果 较 好 ， 但 体 外 受 精效 果 则 不 如 含 5%CO2的 空 气 。 其 主 要原 因 是 精 子 在 获 能 过 程 中 呼 吸 增 加 ， 耗氧 量 增 加 23倍 ， 过 低 的 氧 浓 度 将 不 利于 精 子 的 获 能 与 受 精 。 精 卵 孵 育 时 间 当 采 用 A23187获 能 处 理 精 子 ， 或 受 精液 中 的 咖 啡 因 浓 度 在 5mM以 上 时 ， 精卵 孵 育 时 间 应 控 制 在 68小 时 。 当 用 肝 素 获 能 处 理 精

23、子 ， 且 受 精 液 中 的咖 啡 因 浓 度 为 2.5mM时 ， 精 卵 孵 育 时 间应 控 制 在 24小 时 以 内 ， 因 咖 啡 因 对 卵 母细 胞 受 精 后 的 胚 胎 发 育 具 有 抑 制 作 用 。 咖 啡 因 预 处 理 用 2.5mM咖 啡 因 处 理 解 冻 牛 精 液 10min.或 5.0mM咖 啡 因 处 理 30min.， 精 子 经 离心 后 加 入 到 不 含 咖 啡 因 的 受 精 液 中 进 行体 外 受 精 ， 均 获 得 较 高 卵 裂 率 (分 别 为89 .1%、 89 .9%)及 囊 胚 率 (分 别 为4 .4%、 45 .9%)，

24、 并 且 第 7天 一 级 囊 胚数 较 多 。 (文 国 艺 ， 2000） 牛 血 清 白 蛋 白 一 般 认 为 添 加 血 清 与 激 素 ， 是 使 卵 母 细 胞 周 围的 卵 丘 细 胞 充 分 扩 展 的 必 要 因 素 ， 而 且 卵 丘细 胞 的 扩 展 程 度 与 核 成 熟 密 切 相 关 。 (1)、 在 体 外 成 熟 阶 段 ， 有 、 无 血 清 ， 对 牛 卵 母细 胞 的 核 成 熟 及 随 后 的 分 裂 率 无 显 著 影 响 ，但 对 随 后 的 早 期 胚 胎 有 显 著 影 响 。 (2)、 血 清 对 牛 卵 母 细 胞 的 体 外 受 精 、

25、早 期 胚 胎 的 体 外 发 育 至 关 重 要 ， 且 对 后 者 更 为 重 要 。 （ 陈 鸿 冰 ， 卢 克 焕 ； 1994） 血 小 板 激 活 因 子 （ Platelet activation factor, PAF） PAF是 一 种 与 磷 脂 相 联 的 酯 ， 具 有 诱 发质 膜 囊 泡 化 的 特 性 ， 且 是 精 子 顶 体 反 应的 内 源 诱 导 者 。 在 受 精 液 中 加 入 100ng/ml的 PAF能 显 著提 高 牛 卵 母 细 胞 受 精 后 的 囊 胚 发 育 率 。 血 管 内 皮 生 长 因 子 人 的 血 管 内 皮 生 长 因 子

26、(vascular endothelial growth factor， VEGF),具 有 能 诱 使 细 胞 质与 核 的 成 熟 的 作 用 。 在 牛 的 IVM/IVF/IVC培 养 液 中 分 别 添 加 不 同 剂 量 的 VEGF后 ，5ng/ml的 处 理 组 得 到 最 高 发 育 到 4-8细 胞 的胚 胎 (42%以 上 )。 Einspanier等 认 为 ，VEGF也 是 影 响 卵 母 细 胞 成 熟 和 胚 胎 质 量 的一 个 重 要 因 子 。 氨 基 酸 大 部 分 氨 基 酸 对 卵 母 细 胞 的 体 外 受 精 具 有能 抑 制 作 用 ， 但 个

27、别 氨 基 酸 则 对 体 外 受 精具 有 促 进 作 用 。 （ 甘 、 丝 、 天 冬 、 丙 、 谷氨 酰 胺 ， 具 促 进 作 用 ； 苯 丙 、 缬 、 异 亮 、色 、 酪 AA， 则 抑 制 胚 胎 的 发 育 ） 存 在 的 问 题 与 对 策 目 前 存 在 的 主 要 问 题 是 受 精 后 的 胚 胎 发育 率 偏 低 ， 胚 胎 的 质 量 较 差 。 解 决 这 些问 题 可 从 如 下 几 方 面 考 虑 。 常 规 成 熟 培 养 的 策 略 体 外 成 熟 培 养 的 系 统 应 有 利 于 维 持 卵 母细 胞 在 体 外 的 活 力 。 成 熟 培 养

28、的 条 件 应 有 利 于 成 熟 分 裂 的 恢复 和 完 成 。 成 熟 培 养 条 件 应 有 利 于 卵 母 细 胞 质 成 熟的 最 后 完 成 。 提 高 卵 母 细 胞 成 熟 前 质 量 卵 泡 的 大 小 是 卵 母 细 胞 成 熟 前 质 量 的 重要 标 志 。 如 用 促 性 腺 激 素 对 采 卵 前 的 动物 进 行 处 理 ， 增 加 卵 巢 上 面 的 大 卵 泡 数量 ， 将 完 全 可 能 提 高 卵 母 细 胞 体 外 成 熟的 效 果 。 延 长 成 熟 培 养 时 间 使 用 cAMP等 控 制 卵 母 细 胞 的 核 成 熟 ，延 长 成 熟 培 养 的 时 间 ， 使 卵 母 细 胞 质 得以 充 分 成 熟 。 你 已 到 了 终 点 站 !