生物化学实验方法及常用仪器介绍

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1、 生 物 化 学 实 验 方 法 及 常 用 仪 器 介 绍授 课 ： 王 琼联 系 方 式 ： 2186772（ O） ； 15959252020E-mail： 原 料 液 、 动 植 物 器 官 、 组 织路 线 二细 胞 -胞 内 产 物碎 片 分 离 路 线 一 清 液 -胞 外 产 物细 胞 分 离 （ 离 心 、 过 滤 ）细 胞 破 碎 精 制 （ 结 晶 、 干 燥 ）粗 分 离 （ 盐 析 、 萃 取 、 超 过 滤 ）纯 化 （ 层 析 、 电 泳 ）脱 盐 （ 凝 胶 过 滤 、 超 过 滤 ）浓 缩 （ 超 过 滤 ） 分 离 纯 化 一 般 过 程 一 、 离 心 技

2、 术 离 心 （ centrifuge）离 心 是 利 用 旋 转 运 动 的 离 心 力 以 及 物 质 的沉 降 系 数 或 浮 力 密 度 的 差 异 进 行 分 离 、 浓缩 和 提 纯 的 一 种 方 法 。离 心 技 术 是 利 用 离 心 力 对 混 合 液 （ 含 有 固形 物 ） 进 行 分 离 和 沉 淀 的 一 种 技 术 。离 心 技 术 简 介 离 心 分 离 是 制 备 生 物 样 品 广 泛 应 用 的 重 要手 段 ， 可 以 分 离 ：活 体 生 物 （ 细 胞 、 微 生 物 、 病 毒 ）细 胞 器 （ 细 胞 核 、 细 胞 膜 、 线 粒 体 ）生 物

3、 大 分 子 （ 核 酸 、 蛋 白 质 、 酶 、 多 聚 物 ） 小 分 子 聚 合 物 离 心 技 术 简 介 离 心 技 术 的 发 展 1911-1912年 ， 开 始 生 产 和 使 用 低 速 （ 3,000 rpm以 下 ） 的 商 品 化 台 式 离 心 机 1923-1926年 ， 瑞 典 UPPSALA大 学Svedberg等 科 学 家 试 制 了 世 界 上 第 一台 试 验 型 超 速 离 心 机 （ 45,000 rpm） 。1926年 测 定 了 马 血 红 蛋 白 的 分 子 量 ，获 得 诺 贝 尔 化 学 奖 。 1929年 ， Lamm完 成 了 沉 降

4、 方 程 。 计 算 了 沉降 速 度 。 定 义 了 沉 降 系 数 1940 年 ， Svedberg与 Pederson出 版 了 世 界上 第 一 本 有 关 离 心 技 术 的 专 著 1943年 ， Pickels研 制 成 现 代 固 定 角 式 离 心转 子 离 心 技 术 的 发 展 离 心 技 术 的 发 展 1951年 ， Brakke在 差 速 离 心 的 基 础 上 发 展 了 速 率区 带 离 心 法 。 Kahler研 制 成 功 甩 平 转 子 ； 1955年 ， Anderson发 明 了 区 带 转 头 ， 并 用 区 带 离心 法 首 次 证 明 了 DN

5、A双 螺 旋 结 构 半 保 留 复 制 的 假说 ； 1955年 以 后 ， 开 始 了 超 速 、 高 速 、 低 速 大 容 量 离心 机 以 及 分 析 用 超 速 离 心 机 的 商 品 化 生 产 1957-1959年 ， Meselson、 Duve等 开 发 了 等 密 度 离心 法 。 1964 1966年 ， Anderson等 开 始 建 立 转 子 区 带 离心 技 术 并 开 发 了 低 、 高 、 超 速 区 带 转 头 。 1975年 ， 垂 直 管 转 子 被 开 发 并 用 于 Dupont-Sorvall油 透 平 驱 动 的 超 速 离 心 机 。 198

6、1年 ， 美 国 Beckman公 司 开 发 的 用 于 细 胞 离 心纯 化 的 “ 淘 洗 ” 转 头 供 应 市 场 。 离 心 技 术 的 发 展 1. 离 心 力 Centrifugal force (F) F= m2r 其 中 ： m 沉 降 粒 子 的 有 效 质 量 ； 粒 子 旋 转 的 角 速 度 ； r 粒 子 的 旋 转 半 径 (cm) = (rad/sec)离 心 技 术 原 理 2N 60 2. 相 对 离 心 力 Relative centrifugal force (RCF) RCF 就 是 实 际 离 心 力 转 化 为 重 力 加 速 度 的 倍 数 R

7、CF=F离 心 力 /F重 =m2r/mg=2r/g = (rad/sec) RCF= 42 n2r/3600g=1.12 10-5 n2r 其 中 ： n 每 分 钟 的 转 数 (rpm)离 心 技 术 原 理从 外 界 因 素 看 ， 颗 粒 的 沉 降 速 度 取 决 于 离 心 机的 转 速 及 其 自 身 与 中 心 轴 的 距 离 。 2n 60 只 要 给 出 旋 转 半 径 r， 则RCF和 rpm之 间 可 以 相 互换 算 。 由 于 转 头 的 形 状 及 结 构 的差 异 ， 使 每 台 离 心 机 的 离心 管 ， 从 管 口 至 管 底 的 各点 与 旋 转 轴

8、之 间 的 距 离 是不 一 样 的 ， 所 以 在 计 算 时规 定 旋 转 半 径 均 用 平 均 半径 “ rav”代 替 ： rav =(r min+r max)/2 离 心 技 术 原 理 3. 沉 降 速 度 （ Sedimentation velocity） 指 在 强 大 离 心 作 用 下 ， 单 位 时 间 内 物 质 运 动 的 距 离 。 = d2 ( - ) g / 18 Stokes方 程 其 中 ： 颗 粒 的 沉 降 速 度 d 颗 粒 直 径 颗 粒 密 度 介 质 密 度 介 质 的 粘 度 离 心 技 术 原 理1、 颗 粒 沉 降 速 度 与 颗 粒 直

9、 径 平 方 成 正 比 ， 颗 粒 大 沉 降 快2、 颗 粒 沉 降 速 度 与 颗 粒 和 介 质 密 度 差 成 正 比 ， 密 度 之 差 越 大 沉降 越 快 4. 沉 降 系 数 （ sedimentation coefficient， S） 颗 粒 在 单 位 离 心 力 作 用 下 的 沉 降 速 度 称 为 该 颗 粒 的 沉 降 系数 ， 把 10-13秒 作 为 一 个 单 位 ， 称 为 斯 维 得 贝 格 单 位 ， 或 称沉 降 系 数 单 位 ， 用 S表 示 。 离 心 技 术 原 理 S ( - ) d2182r式 中 ： S沉 降 系 数 沉 降 速 度

10、r 旋 转 半 径 介 质 粘 度 d 颗 粒 直 径 样 品 中 颗 粒 的 密 度 溶 剂 的 密 度 例 如 ： 溶 菌 酶 的 沉 降 系 数 为 2.15 10-13 s， 通 常 叫 做 2.15 S； 过 氧 化 氢 酶 的 沉 降 系 数 为 11.35 10-13 s， 就 称11.35 S； 大 肠 杆 菌 核 蛋 白 体 是 70 S， 由 两 个 亚 基组 成 ， 用 超 离 心 方 法 测 其 沉 降 系 数 分 别 为 30 S和50 S。 离 心 技 术 原 理蛋 白 质 的 沉 降 系 数 一 般 在 1-200 S之 间 。 离 心 技 术 原 理某 些 生

11、物 样 品 的 沉 降 系 数 、 相 对 离 心 力 和 转 速 的 范 围样 品 沉 降 系 数 /S RCF/g 转 速 n/rpm细 胞 107 200 40万 60000 离 心 机 结 构 离 心 机 分 类低 速 离 心 机最 大 转 速 :4000 7000rpm最 大 离 心 力 :2220 9420g高 速 离 心 机最 大 转 速 :15000 26000rpm最 大 离 心 力 :16100 801100g 超 速 离 心 机最 大 转 速 :55000 150000rpm最 大 离 心 力 :363600 9011000g 分 离 物 大 小 ： 1 50 mMicr

12、obial cell， hemocyte， cell分 离 物 大 小 ： 0.1 1 mMitochondria， Lysosome， cell Well分 离 物 大 小 ： 0.002 0.1 mDNA， RNA， Virus， Protein， Enzyme根 据 转 速 根 据 用 途制 备 型 离 心 机分 析 型 离 心 机 分 离 生 物 材 料 ， 每 次 分 离 样 品的 容 量 比 较 大研 究 纯 品 大 分 子 物 质 ， 推 断 其纯 度 、 形 状 和 相 对 分 子 质 量 等性 质 ， 每 次 分 析 的 样 品 容 量 很小 离 心 机 分 类 离 心 机

13、分 类1、 低 速 离 心 机 最 大 转 速 4000 7000rpm左 右 ， 最 大 相 对 离 心 力 近2220 9420g ， 容 量 为 几 十 毫 升 至 几 升 ， 分 离 形 式是 固 液 沉 降 分 离 ， 转 子 有 角 式 和 外 摆 式 ， 其 转 速 不能 严 格 控 制 ， 通 常 不 带 冷 冻 系 统 ， 于 室 温 下 操 作 。 用 于 收 集 易 沉 降 的 大 颗 粒 物 质 ， 如 红 血 球 、 酵 母 细胞 等 。 2、 高 速 冷 冻 离 心 机 最 大 转 速 为 15000 26000rpm左 右 ， 最 大 相 对 离 心 力 为161

14、00 801100g， 最 大 容 量 可 达 3升 ， 分 离 形 式 也 是 固 液 沉降 分 离 ， 转 头 配 有 各 种 角 式 转 头 、 水 平 式 转 头 、 区 带 转 头 、垂 直 转 头 和 大 容 量 连 续 流 动 式 转 头 、 一 般 都 有 制 冷 系 统 ， 转速 、 温 度 和 时 间 都 可 以 严 格 准 确 地 控 制 ， 并 有 指 针 或 数 字 显示 。 通 常 用 于 微 生 物 菌 体 、 细 胞 碎 片 、 大 细 胞 器 、 硫 酸 铵 沉 淀 和免 疫 沉 淀 物 等 的 分 离 纯 化 工 作 ， 但 不 能 有 效 地 沉 降 病

15、毒 、 小细 胞 器 (如 核 蛋 白 体 )或 单 个 分 子 。 离 心 机 分 类 3、 超 速 离 心 机 转 速 可 达 55000 150000rpm， 相 对 离 心 力 最 大 可达 363600 9011000g， 离 心 容 量 由 几 十 毫 升 至 2升 ，分 离 的 形 式 是 差 速 沉 降 分 离 和 密 度 梯 度 区 带 分 离 ，离 心 管 平 衡 允 许 的 误 差 要 小 于 0.1克 。 超 速 离 心 机 能 使 过 去 仅 仅 在 电 子 显 微 镜 下 观 察 到的 亚 细 胞 器 得 到 分 级 分 离 ， 还 可 以 分 离 病 毒 、 核酸

16、 、 蛋 白 质 和 多 糖 等 。 离 心 机 分 类 依 材 质 分 类 ： 铝 合 金 ： 较 轻 ,耐 受 强 度 较 弱 ,适 合 在 较 低 的 转 速 下 使 用 钛 合 金 ： 耐 受 强 度 不 错 ,重 量 也 比 不 锈 钢 轻 不 锈 钢 ： 耐 受 强 度 最 好 ,但 材 质 本 身 太 重 碳 纤 维 ： 具 有 抗 各 种 腐 蚀 的 能 力 ， 重 量 只 有 铝 合 金 转 子的 二 分 之 一 ,钛 合 金 转 子 的 五 分 之 一 ， 使 用 寿 命 更 长 。离 心 机 转 子 种 类 角 转 子 （ angle rotor） 甩 平 转 子 （ s

17、winging bucket rotor） 垂 直 转 子 （ vertical tube rotor） 区 带 转 子 （ zonal rotor） 连 续 流 动 转 子 （ continuous flow rotor）离 心 机 转 子 种 类依 外 形 分 类 ： 角 转 子 ： 离 心 管 放 置 的 位 置 与 转头 的 旋 转 轴 之 间 成 一 个 固 定 角 度 ，通 常 在 14-40 之 间 。 适 用 于 差 速 离 心 ， 也 可 用 于 等 密度 离 心 。 特 点 ： 容 量 大 ， 转 头 内 容 纳 的 离心 管 多 。角 转 子 （ angle rotor）

18、离 心 机 转 子 种 类 Drive shaft holeRotor coverPacking Thread portionTube cavity 离 心 机 转 子 种 类Rotor body 角 转 子 的 特 点 ： 重 心 低 ,转 速 可 较 高 样 品 粒 子 穿 过 溶 剂 层 的 距 离 略 大 于 离 心 管 的 直 径 “ 管 壁 效 应 ” ： 有 一 定 的 角 度 , 在 离 心 过 程 中 撞 到 离 心 管 外 壁 的粒 子 沿 着 管 壁 滑 到 管 底 形 成 沉 淀 , 此 效 应 使 最 后在 管 底 聚 成 的 沉 淀 较 紧 密 。离 心 机 转 子

19、 种 类 甩 平 转 子 ： 离 心 管 组 装 在 转 子 的 吊 桶 里 ，离 心 机 处 于 静 止 状 态 时 离 心 管 为 垂 直 方 向 ，即 离 心 管 与 离 心 轴 承 平 行 方 向 。 离 心 时 离心 管 与 旋 转 轴 垂 直 。 承 受 的 最 大 离 心 速 度 在 65,000 r/min左 右 ，最 大 离 心 力 在 400,000 g。 适 合 于 密 度 梯 度 离 心 ， 进 行 差 速 离 心 效 果不 理 想 。甩 平 转 子 （ swinging bucket rotor）离 心 机 转 子 种 类 甩平转子运行状态 600 rpm/min离

20、心 机 转 子 种 类 甩 平 转 子 的 特 点 ： 转 子 的 重 心 位 置 较 高 ， 转 速 较 低 样 品 粒 子 沉 降 穿 过 溶 剂 层 的 距 离 大 于 直 径 对 于 多 种 成 分 样 品 分 离 特 别 有 效 常 用 于 速 率 区 带 离 心 和 等 密 度 离 心离 心 机 转 子 种 类 垂 直 转 子 （ vertical tube rotor）离 心 机 转 头 种 类 垂 直 转 子 ： 是 指 离 心 管 与 旋 转 轴 成 平 行 方 向 ， 离 心 管 垂直 插 入 转 子 孔 内 ， 在 离 心 过 程 中 始 终 与 旋 转 轴 平 行 。

21、承 受 的 最 大 离 心 速 度 在 100, 000 r/min左 右 ， 最 大 离 心力 在 700, 000g 。 比 较 适 合 速 率 区 带 离 心 和 等 密 度 离 心 ， 尤 其 适 合 于 质 粒DNA 的 分 离 纯 化 ， 但 不 适 合 于 差 速 离 心 。 转 头 停 止 状 态 起 始 开 始 分 离 完 全 分 离 减 速 停 止 垂 直 转 头 的 运 行 状 态离 心 机 转 头 种 类 当 转 子 旋 转 时 ， 离 心 管 中 的 液 体 层 改 变 方 向 ， 从 开 始 的水 平 方 向 改 成 垂 直 方 向 ， 当 转 子 降 速 时 ，

22、垂 直 分 布 的 液层 又 逐 渐 趋 向 水 平 ， 待 旋 转 停 止 后 ， 液 面 又 完 全 恢 复 成水 平 方 向 。 为 一 空 腔 ， 没 有 离 心 管 ， 样 品 液 直 接 放 在 腔 内 。 适 用 于 大 量 样 品 的 分 离 。 最 大 离 心 速 度 ： 60,000 rpm左 右 最 大 离 心 力 ： 250,000 g区 带 转 头 （ zonal rotor） 离 心 机 转 头 种 类 由 转 子 桶 和 有 入 口 和 出 口 的 转 头 盖 及 附 属 装 置 组 成 ， 离 心 时 样品 液 由 入 口 连 续 流 入 转 头 ， 在 离 心

23、 力 作 用 下 ， 悬 浮 颗 粒 沉 降 于转 子 桶 壁 ， 上 清 液 由 出 口 流 出 。 连 续 流 动 转 头 （ continuous flow rotor）离 心 机 转 头 种 类 最 大 离 心 速 度 ： 32,000 rpm左 右 最 大 离 心 力 ： 100,000 g 可 用 于 大 量 培 养 液 或 提 取液 的 浓 缩 与 分 离 塑 料 离 心 管 ： 聚 乙 烯 （ PE） 管 、 纤 维 素 （ CAB） 管 、 聚 碳 酸酯 （ PC） 管 、 聚 丙 烯 （ PP） 管 、 异 质 同 晶 聚 合 物 （ PA） 、聚 氧 化 乙 烯 對 苯

24、二 酸 （ PET） ， 其 中 PP管 性 能 较 好 。 优 点 ： 透 明 （ 或 半 透 明 ） ， 易 于 观 察 ； 硬 度 小 ， 可 用 穿 刺 法取 出 梯 度 。 缺 点 ： 易 变 形 ， 抗 有 机 溶 剂 腐 蚀 性 差 ， 使 用 寿 命 短 。 不 锈 钢 离 心 管 ： 强 度 大 ， 不 变 形 ， 能 抗 热 ， 抗 冻 ， 抗 化 学 腐蚀 。 离 心 管 沉 淀 离 心差 速 分 级 离 心密 度 梯 度 离 心离 心 分 离 方 法 沉 淀 离 心 是 应 用 最 广 的 一 种 离 心 方 法 ， 一 般 是 指 介 质 密 度约 1g/ml， 选

25、用 一 种 离 心 速 度 ， 使 悬 浮 溶 液 中 的 悬 浮 颗 粒在 离 心 的 作 用 下 完 全 沉 淀 下 来 。 主 要 适 宜 于 细 菌 等 微 生 物 、 细 胞 和 细 胞 器 等 生 物 材 料 （ 密度 在 1.08-1.12 g/ml左 右 ） ； 病 毒 和 染 色 体 DNA等 （ 密 度 在1.18-1.31 g/ml左 右 ） 。 沉 降 速 度 与 离 心 力 和 颗 粒 大 小 有 关 。离 心 分 离 方 法沉 淀 离 心 （ pelleting） 沉 淀 离 心 示 意 图离 心 分 离 方 法 建 立 在 颗 粒 的 大 小 、 密 度 和 形

26、状 有 明 显 的 不 同 ， 沉 降 系 数存 在 较 大 差 异 的 基 础 上 进 行 分 离 的 方 法 。 差 速 离 心 比 较 适 用 于 大 小 相 差 明 显 的 细 胞 或 细 胞 器 的 分 级分 离 ， 经 过 多 次 离 心 可 以 得 到 满 意 结 果 。 沉 降 顺 序 ： 整 个 细 胞 或 细 胞 碎 片 核 线 粒 体 溶酶 体 与 过 氧 化 物 酶 体 内 质 网 与 高 基 体 核 蛋 白 体 。 差 速 离 心 每 次 得 到 的 沉 淀 物 都 含 有 极 少 量 的 小 于 该 s值 的沉 淀 物 质 。差 速 离 心 （ differenti

27、al velocity centrifugation ）离 心 分 离 方 法 差 速 离 心 示 意 图离 心 分 离 方 法Low speedHigh speed 例 ： 一 个 体 积 为 100 mL悬 浮 液 中 有 三 种 物 质 A、 B、 C， 沉降 系 数 分 别 为 100S、 10S、 1S。 采 用 差 速 离 心 的 方 法 分 离 。第 一 步 ： 物 质 A的 沉 降 。 A100 沉 淀 时 ， 沉 淀 物 中 有 10的 B和 1 的 C。 多 次 沉 淀 纯 化 物 质 A。组 分 沉 降 系数 /S 第 一 次 第 二 次 第 三 次沉 淀 上 清 沉 淀

28、 上 清 沉 淀 上 清 A 100 100 0 100 0 100 0B 10 10 90 1 9 0.1 0.9C 1 1 99 0.01 0.99 0.0001 0.0099第 二 步 ： 物 质 B的 沉 降第 三 步 ： 物 质 C的 沉 降 离 心 分 离 方 法 差 速 离 心 法 主 要 用 于 分 离 细 胞 器 和 病 毒 。 优 点 是 ： 操 作 简 单 ， 离 心 后 用 倾 倒 法 即 可 将 上 清 夜与 沉 淀 分 开 ， 并 可 使 用 容 量 较 大 的 角 式 转 子 。 缺 点 是 ： 分 离 效 果 差 ， 不 能 一 次 得 到 纯 颗 粒 ； 壁

29、效 应 严 重 ， 特 别 是 当 颗 粒 很 大 或 浓 度 很 高 时 ， 在 离心 管 一 侧 会 出 现 沉 淀 ； 颗 粒 被 挤 压 ， 离 心 力 过 大 、离 心 时 间 过 长 会 使 颗 粒 变 形 、 聚 集 而 失 活 。离 心 分 离 方 法 密 度 梯 度 离 心（ density gradient centrifugation）速 率 区 带 离 心 （ rate zonal centrifugation）分 离 密 度 相 近 而 大 小 不 等 的 细 胞 或 细 胞 器等 密 度 区 带 离 心 （ isopycnic centrifugation）分 离

30、密 度 不 等 的 颗 粒（区带离心）密度梯度离心 离 心 分 离 方 法 分 离 密 度 相 近 而 大 小 不 等 的 细 胞 或 细 胞 器 。 梯 度 液 设 计 的 最 大 密 度 小 于 样 品 颗 粒 （ 各 种 组 分 ） 的 密 度 。 离 心 前 预 先 在 离 心 管 内 装 入 密 度 梯 度 介 质 ， 被 分 离 物 质 的 样 品溶 液 位 于 梯 度 液 的 上 面 。 离 心 时 样 品 中 的 组 分 以 不 同 的 沉 降 速 度 沉 降 ， 离 心 时 间 应 该 控制 在 最 重 的 样 品 沉 淀 之 前 ， 结 束 时 不 同 的 组 分 以 纯

31、样 品 带 方 式存 在 于 梯 度 液 之 中 。速 率 区 带 离 心 离 心 分 离 方 法 分 离 密 度 不 等 的 颗 粒 。 梯 度 液 设 计 的 密 度 范 围 正 好 包 括 所 有 待 分 离 颗 粒 的 密 度 。 样 品 各 成 分 在 连 续 梯 度 的 介 质 中 经 过 一 定 时 间 的 离 心 则 沉降 到 与 自 身 密 度 相 等 的 介 质 处 ， 并 停 留 在 那 里 达 到 平 衡 ，从 而 将 不 同 密 度 的 成 分 分 离 。等 密 度 区 带 离 心 离 心 分 离 方 法 速 率 区 带 离 心 和 等 密 度 区 带 离 心 比 较

32、分 离 法 速 率 区 带 离 心 法 等 密 度 区 带 离 心 法原 理 沉 降 与 颗 粒 质 量 成 正 比 ， 以 物 质沉 降 速 度 的 不 同 进 行 分 离 沉 降 与 颗 粒 的 密 度 成 正 比 ，以 物 质 的 浮 密 度 不 同 进 行分 离介 质 密 度 小 ， 如 蔗 糖 、 甘 油 、 聚 蔗 糖 密 度 大 ， 如 CsCl,Cs2SO4离 心 力 场 强 ， 离 心 速 度 高 ， 使 被 分 离 物 质易 沉 降 稍 强 ， 速 度 相 对 低 ， 使CsCl形 成 梯 度 ， 建 立 沉 降扩 散 平 衡离 心 过 程 样 品 向 离 心 管 底 沉

33、降 不 论 样 品 起 始 时 在 什 么 位置 ， 离 心 中 样 品 停 留 于 介质 的 等 密 度 部 位离 心 时 间 较 短 ， 一 般 为 几 小 时 到 几 十 小 时 较 长 ， 十 几 小 时 到 数 天离 心 分 离 方 法 该 法 的 优 点 是 ： 分 离 效 果 好 ， 可 一 次 获 得 较 纯颗 粒 ； 适 应 范 围 广 ， 既 能 分 离 具 有 沉 淀 系 数 差的 颗 粒 ， 又 能 分 离 有 一 定 浮 力 密 度 的 颗 粒 ； 颗粒 不 会 挤 压 变 形 ， 能 保 持 颗 粒 活 性 ， 并 防 止 已 形成 的 区 带 由 于 对 流 而

34、引 起 混 合 。 缺 点 ： 离 心 时 间 较 长 ； 需 要 制 备 梯 度 ； 操 作 严 格 ， 不 宜 掌 握 。 离 心 分 离 方 法 密 度 梯 度 溶 液 目 前 使 用 的 密 度 梯 度 材 料 主 要 有 ： CsCl2, LiCl, RbCl， 酒石 酸 钾 钠 ， 甘 油 ， 蔗 糖 ， 聚 蔗 糖 等 。 常 使 用 的 梯 度 液 为 4%-20%（ W/V）蔗 糖 离 心 管 顶 部 为 4%的 蔗 糖 ， 密 度1.018 g/mL 离 心 管 底 部 为 20%的 蔗 糖 ， 密 度 为1.077 g/mL 离 心 分 离 方 法 正 确 选 择 密 度

35、 梯 度 的 范 围 。 对 样 品 的 生 物 活 性 不 能 有 影 响 。 不 能 影 响 所 使 用 的 测 量 技 术 。 注 意 能 否 进 行 高 温 消 毒 ， 对 转 头 是 否 有 影 响 。梯 度 材 料 的 选 择 离 心 分 离 方 法 1、 虹 吸 法 ： 用 一 根 细管 插 到 离 心 管 的 底 部 ，将 溶 液 吸 出 ， 用 试 管分 部 接 收 ， 然 后 进 行分 析 。梯 度 的 取 出 离 心 分 离 方 法 1、 顶 替 法 ： 把 一 种 很 稠 的介 质 ， 如 60-70 的 蔗 糖 溶液 慢 慢 注 入 离 心 管 底 部 ，将 离 心

36、管 中 的 溶 液 顶 替 出来 。 离 心 分 离 方 法 2、 穿 刺 法 ： 将 离 心 管 固定 在 支 架 上 ， 在 离 心 管底 部 贴 一 块 胶 布 ， 防 止穿 刺 后 液 体 泄 漏 。 用 针头 仔 细 穿 过 塑 料 离 心 管的 底 部 ， 此 时 液 体 顺 针头 缓 缓 地 逐 滴 流 出 ， 可用 试 管 按 体 积 分 部 接 收 ，然 后 进 行 分 析 。 离 心 分 离 方 法 4、 冷 冻 切 段 法 ： 将 离 心 好 地 试 管 进 行 冷 冻 ， 再 切成 段 ， 将 不 同 的 区 带 分 开 。 离 心 分 离 方 法3、 虹 吸 法 ：

37、用 蠕 动 泵 或 吸 管 将 样 品 从 上 至 下 逐层 按 区 带 吸 出 并 分 管 收 集 。 泵 管 或 吸 管 注 意 每 区带 一 管 ， 不 能 混 用 。 离 心 机 使 用 注 意 事 项一 、 不 可 使 用 有 机 溶 剂离 心 机 无 法 预 防 爆 炸 情 况 的发 生 ！ ！ ！请 不 要 使 用 有 机 溶 剂 离心 ！ ！ ！ 如 在 特 别 的 状 况 下 ，必 须 要 非 常 小 心 ， 不要 让 液 体 流 出 ,并 且 使用 密 封 式 Rotor！ 二 、 转 子 速 度 的 设 定 离 心 机 转 子 标 出 的 最 高 转 速 一 般 是 在

38、使 用 塑 料 离 心 管 、样 品 的 平 均 密 度 低 于 1.2g/cm3或 者 按 照 说 明 书 的 要 求 低 于某 一 装 载 量 时 ， 才 能 达 到 的 最 高 安 全 使 用 转 速 。 当 离 心 管 、 管 帽 或 套 管 材 质 更 换 成 大 密 度 材 质 时 ， 应 降低 运 转 速 度 （ 低 于 最 大 速 度 ） 。 转 头 都 有 一 定 的 使 用 极 限 ， 到 一 定 时 限 后 ， 最 高 使 用 转速 必 须 降 低 10-20%。 离 心 机 使 用 注 意 事 项 当 离 心 样 品 平 均 密 度 大 于 1.2克 /立 方 厘 米

39、， 按 下 式 计 算实 际 最 高 转 速 ： 1.2NN 最 大实 际 有 些 转 子 说 明 书 中 给 出 的 是 转 子 的 最 大 装 样 量 ， 按 下 式计 算 实 际 最 高 转 速 ： 实 际 重 量最 大 装 载 量 最 大实 际 NN 离 心 机 使 用 注 意 事 项 三 、 样 品 的 装 载 和 平 衡由 于 离 心 时 产 生 很 大 的 离 心 力 ， 当 转 头 所带 的 样 品 处 于 不 平 衡 状 态 时 ， 会 产 生 很 大的 力 矩 。 轻 者 引 起 机 器 发 抖 和 震 动 ， 重 者会 扭 断 转 轴 造 成 事 故 。离 心 机 使 用

40、 注 意 事 项 静 平 衡 ： 对 称 的 两 管 样 品等 重 。动 平 衡 ： 离 心 时 产 生 的 力矩 不 仅 与 样 品 的 重 量 有 关 ，还 和 样 品 的 旋 转 半 径 有 关 。处 于 对 称 位 置 的 两 个 离 心管 必 须 装 载 密 度 相 近 的 样 品 。 离 心 机 使 用 注 意 事 项 （ illustration of correct set）（ illustration of incorrect setting）： with tube ： without tube放 置 已 平 衡 好 的 Tube和 Bottls,其 放 置 的 位 置 必

41、須 为 对 称两 个 对 称 的 Tube和 Bottls,如 右图 情 形 是 不 允 许 的 离 心 机 使 用 注 意 事 项四 、 tube/bottles的 放 置 在 Rotor body上 的 bucket的 孔 洞 必 須 全 部 裝 滿 ,不 论 是 否 有 包 含 样 品*运 转 时 必 須 將 所 有 的 Buckets都 放 入 到 Rotor body內 ,其 主 要 預 防 在 启动 运 转 时 造 成 Buckets变 形（ illustration of correct set） （ illustration of incorrect setting）离 心 机

42、 使 用 注 意 事 项 五 、 清 洗 及 消 毒Rotor1. 清 洗 清 洗涂 抹 使 用 水 或 中 性 清 洁 剂 清 洗 ，并 且 需 使 用 去 离 子 水 冲 洗 ( 清 洁 剂 :pH 59 )铝 合 金 /钛 合 金 :低 于 100 C碳 纤 维 :低 于 80 C干 燥 表 面 :Silicone grease 螺 纹 部 分 :Aluminum Lubricant Packing/O-ring:Vacuum grease 离 心 机 使 用 注 意 事 项 2. 消 毒 消 毒 的 方 式 铝 合 金 /钛 合 金 Rotor 碳 纤 维 Rotor 高 压 蒸 汽

43、煮 沸 消 毒 紫 外 线 消 毒 200300nm Ethylene oxide环 氧 乙 烷 气 体 消 毒 Formaldehyde甲 醛 70% Ethanol乙 醇 化 学 药 剂 3% Hydrogen peroxede 3% Formalin福 尔 马 林 Rotor耐 热 温 度 100C 80C 离 心 机 使 用 注 意 事 项 Tube/Bottles1. 清 洗 清 洗 的 方 式 Tube/Bottles 附 件PA,PEPET PC Cap,adapter ect.水 性 洗 涤 剂 ( pH9 ) 温 水 ( 50C ) 超 声 波 清 洁 (清 洗 剂 电 荷

44、高 者离 子 大 者浓 度 大 者 离 子 交 换 层 析 130 What happens in ion exchange?Sampleapplicationand wash ElutionEquilibration Regeneration- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -+ + + + + + + + + + + + anionexchangerbead- - - 离 子 交 换 层 析 离 子 交 换 剂 种 类 在 惰 性 载 体 上 引 入 带 有 电 荷 的 活 性 基 团 即 离 子 交 换 剂 。

45、（ 一 ） 按 活 性 功 能 基 团 带 电 荷 性 质 不 同 阳 离 子 交 换 剂 带 负 电 荷 ， 与 阳 离 子 交 换 阴 离 子 交 换 剂 带 正 电 荷 ， 与 阴 离 子 交 换离 子 交 换 层 析 （ 二 ） 按 载 体 种 类 不 同1、 离 子 交 换 树 脂 ： 聚 苯 乙 烯 树 脂 聚 苯 乙 烯苯 乙 烯 二 乙 烯 苯 离 子 交 换 层 析+ 离 子 交 换 层 析离 子 交 换 树 脂 的 特 性 多 孔 性 ： 疏 松 、 多 孔 网 状 ， 活 性 基 团 在 网 孔 内 不 溶 性 ： 不 溶 于 稀 酸 、 稀 碱 、 有 机 溶 剂 稳

46、定 性 ： 离 子 交 换 性 ： 具 相 当 数 量 的 可 交 换 或 带 电 基 团 2、 离 子 交 换 纤 维 素 阴 离 子 交 换 纤 维 素 如 :DEAE-纤 维 素 ， pH8.6以下 分 离 中 性 或 酸 性 物 质 ， 具 二 乙 胺 乙 基 阳 离 子 交 换 纤 维 素 如 :CM-纤 维 素 ， 一 般 pH4条 件 下 使 用 ， 具 有 羧 甲 基 离 子 交 换 层 析 3、 离 子 交 换 凝 胶 分 离 大 分 子 物 质如 ： 葡 聚 糖 （ Sephadex） 聚 丙 烯 酰 胺 （ PAG） 琼 脂 糖 （ Sepharose） 离 子 交 换

47、层 析 离 子 交 换 层 析 的 应 用 主 要 用 于 分 离 蛋 白 质 、 多 肽 、 氨 基酸 ， 也 可 用 于 分 离 核 酸 、 核 苷 酸 及其 他 带 电 荷 的 生 物 分 子 。离 子 交 换 层 析 举 例 ： 当 pIpH时 ， 蛋白 质 带 净 正 电 荷 。 已 知 蛋 白 质 X等 电 点 为 7， 设 计 实 验 利 用 阴离 子 交 换 树 脂 纯 化 。建 立 阴 离 子 交 换 柱 ， 比 如 Q-Sepharose。 用 pH8.5的 缓 冲 液 平衡 柱 子 ， 同 时 蛋 白 X溶 解 于 pH8.5的 缓 冲 液 中 ， 在 此 pH值 下蛋

48、白 X带 有 负 电 ， 将 含 有 蛋 白 X的 混 合 液 上 样 ， 然 后 用 起 始液 冲 洗 ， 蛋 白 X会 与 此 柱 结 合 ， 然 后 盐 梯 度 洗 脱 。离 子 交 换 层 析 亲 和 层 析Affinity Chromatography 亲 和 层 析 是 利 用 生 物 大 分 子 所 具 有 的 专 一 亲 和 力 而设 计 的 纯 化 技 术 。 亲 和 层 析 法SpecificBindingSubstance (B) 洗 脱Elution配 体Ligand (A)耦 合 反 应 Coupling Reaction杂 质 BB BBSolid Matrix B

49、 亲 和 层 析 法 的 四 要 素 ： 固 相 载 体 亲 和 配 体 耦 合 反 应 与 配 体 可 逆 结 合 的 生 物 分 子 亲 和 层 析 法 的 作 用 机 理 ：亲 和 层 析 法 混 合 蛋 白 样 品带 有 配 体 的 树脂 珠 （ 或 胶 粒 ）洗 下 未 结 合 的 蛋 白 含 配 体 溶 液平 衡 液 收 集 目 的 蛋 白亲 和 层 析 法 专 一 性 亲 和 力 的 构 成 因 素 ：I. Conformational Match: Van der waals interaction+ K两 分 子 间 因 构 象 互 补 所 造 成 的吸 引 力 是 由 范

50、德 瓦 尔 力 所 贡 献 + -=OH-N-II. Interaction Forces: (1) Hydrogen bond (2) Hydrophobic interaction (3) Electrostatic interaction (4) Van der waals interaction亲 和 层 析 法 Van der Waal interactionsbetween non-polar surfacesConformational Matchn 构型互补所造成的吸引力 亲 和 层 析 法 90kcal/mole3kcal/mole1kcal/mole1kcal/mole0.

51、1kcal/mole一 个 二 级 键 的 大 约 键 能n二 级 键 ： 次 于 共 价 键 的 结 合 能 力离 子 键氢 键疏 水 键范 德 瓦 尔 力 亲 和 层 析 法 配 体 亲 和 性 分 子 说 明抗 体 对 应 的 抗 原 免 疫 吸 附 剂 ， 大 多 自 行 合 成底 物 或 抑 制 剂 对 应 的 酶 酶 的 专 一 性 结 合Protein A 部 分 IgG 单 株 抗 体 纯 化Con A刀 豆 素 糖 蛋 白 对 a-D-葡 萄 糖 、 甘 露 糖 基 有 专 一 性Heparin 凝 血 蛋 白 等 Heparin Sepharose CL-6BOligo (

52、dT) mRNA Oligo (dT)-celluloseCibacron-Blue NAD（ P） +结 合 酶 Blue Sepharose CL-6BAMP, ADP NAD（ P） +结 合 酶 5AMP-, 2, 5ADP-Sepharose 4B单 糖 及 衍 生 物 Lectin 用 来 纯 化 lectin各 种 亲 和 性 配 体 及 其 专 一 性 基 团亲 和 层 析 法 具 有 良 好 的 物 理 化 学 稳 定 性载 体 的 选 择均 匀 多 孔 的 网 状 结 构 ， 有 良 好 的 渗 透 性具 备 大 量 能 被 活 化 的 基 团 ， 能 和 配 体 稳 定

53、结 合与 样 品 中 的 各 组 分 均 没 有 明 显 的 非 特 异 性 吸 附抗 微 生 物 和 酶 的 侵 蚀 亲 和 层 析 法 种 类 优 点 缺 点纤 维 素 价 格 低 ， 活 性 集 团较 多 非 特 异 性 吸 附 强 ， 稳 定 性 和均 一 性 较 差葡 聚 糖 凝 胶 稳 定 性 好 孔 径 较 小聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 同 上 同 上琼 脂 糖 凝 胶 非 特 异 性 吸 附 低 ，稳 定 性 好 ， 孔 径 均匀 适 当 ， 宜 于 活 化多 孔 玻 璃 机 械 强 度 好 ， 化 学稳 定 性 好 活 性 集 团 较 少 ， 对 蛋 白 质 有较 强 的 吸

54、 附 作 用各 类 载 体 的 优 缺 点亲 和 层 析 法 配 体 的 选 择1与 待 分 离的 物 质 有适 当 的 亲和 力 2与 待 分 离物 质 之 间的 亲 和 力要 有 较 强的 特 异 性 3与 载 体 稳定 的 共 价结 合 4与 待 分 离的 物 质 有适 当 的 亲和 力亲 和 层 析 法 配 体 的 分 类 特 异 性 配 体 只 与 单 一 或 很 少 种 类 的 蛋 白 质 等 生 物 大 分 子 结 合 的 配 体 eg.抗 原 和 抗 体 、 酶 和 它 的 抑 制 剂 通 用 性 配 体 特 异 性 不 是 很 强 ， 能 和 某 一 类 的 蛋 白 质 等

55、生 物 大 分 子 结 合的 配 体 eg.凝 集 素 可 以 结 合 各 种 糖 蛋 白 亲 和 层 析 法 洗 脱 方 法 特 异 性 洗 脱 利 用 洗 脱 液 中 的 物 质 与 待 分 离 物 质 或 与 配 体 的 亲 和 特 性 而将 待 分 离 物 质 从 亲 和 吸 附 剂 上 洗 脱 下 来 。 非 特 异 性 洗 脱 通 过 改 变 洗 脱 缓 冲 液 pH、 离 子 强 度 、 温 度 等 条 件 ， 降 低 待分 离 物 质 与 配 体 的 亲 和 力 而 将 待 分 离 物 质 洗 脱 下 来 。亲 和 层 析 法 特 异 性 洗 脱 亲 和 层 析 法 特 异 性

56、 洗 脱 的 优 缺 点优 点缺 点改 善 方 法 特 异 性 强 ， 可 以 进 一 步 消 除 非 特 异 性 吸 附 的 影响 ， 从 而 得 到 较 高 的 分 辨 率 可 避 免 蛋 白 质 变 性 较 长 的 时 间 和 较 大 的 洗 脱 条 件 选 择 亲 和 力 强 的 物 质 洗 脱 、 加 大 洗 脱 液 浓 度亲 和 层 析 法 非 特 异 性 洗 脱 待 分 离 物 质 与 配 体 亲 和 力 较 小 连 续 大 体 积 平 衡 缓 冲 液 冲 洗 ， 不 影 响 活 性 ， 但 洗 脱 液 体 积较 大 ， 待 分 离 物 质 浓 度 较 低 。 待 分 离 物 质

57、 与 配 体 结 合 较 强 时 适 当 的 pH、 离 子 强 度 洗 脱 ， 注 意 尽 量 不 影 响 待 分 离 物 质的 活 性 。 待 分 离 物 质 与 配 体 集 合 非 常 牢 固 时 使 用 较 强 的 酸 、 碱 或 在 洗 脱 液 中 加 入 脲 、 胍 等 变 性 剂 ， 使蛋 白 质 等 带 分 离 物 质 变 性 ， 洗 脱 后 再 复 性 。亲 和 层 析 法 加 样 除 去 非 特 异 性结 合 的 蛋 白 质 基 本 操 作固 定 配 体+ 选 择 配 体+ 洗 脱 纯 的目 的 蛋 白 +亲 和 层 析 法 1. Equilibration2. Sampl

58、e application3. Binding and washing4. Desorption and elutionMatrix Specific ligandEquilibrate the column and the sample to binding conditions. 亲 和 层 析 法 1. Equilibration2. Sample application3. Binding and washing4. Desorption and elution Target bindsOthers wash outApply sample under binding conditio

59、ns. 亲 和 层 析 法 1. Equilibration2. Sample application3. Binding and washing4. Desorption and elution Target elutesChange the eluent to elute the target. 亲 和 层 析 法 亲 和 层 析 法亲 和 层 析 的 优 点 只 需 一 步 纯 化 步 骤 即 可使 待 分 离 物 质 从 复 杂 的混 合 物 中 分 离 出 来 。 产 物 纯 度 很 高 。 可 从 很 稀 的 溶 液 中 纯 化到 所 需 物 质 。 亲 和 层 析 的 缺 点 可

60、 能 吸 附 一 些 杂 蛋 白 质 。 洗 脱 过 程 中 的 配 体 不 可避 免 的 脱 落 进 入 分 离 体系 。 载 体 较 昂 贵 ， 配 基 制 备困 难 。 亲 和 层 析 的 应 用 目 前 亲 和 层 析 技 术 被 广 泛 应 用 在 蛋 白 质 研 究 和 制 备 领 域 ， 是分 离 纯 化 以 及 分 析 生 物 大 分 子 尤 其 是 蛋 白 质 的 有 力 工 具 。亲 和 层 析 法蛋 白 质 研 究和 制 备 领 域 凝 集 素 和 糖 蛋 白抗 原 和 抗 体激 素 和 受 体 蛋 白含 有 辅 酶 的 酶 类 多 核 苷 酸 和 核 酸氨 基 酸生 物 素 和 亲 和 素 快 速 液 相 蛋 白 纯 化 系 统 气 相 色 谱 仪 液 相 色 谱 仪 1.一 个 体 积 为 100 mL悬 浮 液 中 有 三 种 物 质 A、 B、C， 沉 降 系 数 分 别 为 100S、 20S、 5S。 采 用 差 速离 心 的 方 法 分 离 纯 化 物 质 A。 2. 设 定 离 心 转 速 和 平 衡 样 品 时 有 哪 些 注 意 事 项 ？思 考 题 谢 谢 ！