第十五章基因重组与基因工程Chapter15Gene

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1、单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第十五章基因工程Chapter15Genetic Engineering,基因重组(gene recombination)是指DNA片段在,细,细胞内、,细,细胞间，,甚,甚至在不,同,同物种之,间,间进行交,换,换，交换,后,后的片段,仍,仍然具有,复,复制和表,达,达的功能。,基因工程,(geneticengineering,）,是指采用,人,人工方法,将,将不同来,源,源的DNA进行重,组,组，并将,重,重组后的DNA引,入,入宿主细,胞,胞中进行,增,增殖或表,达,达的过程,，,，从而改,变,变生物

2、特,性,性或创造,新,新的生物,类,类型的技,术,术。,整合:,外来,DNA,侵入宿主,细,细胞，并,与,与宿主细,胞,胞,DNA,进行重组,，,，成为宿,主,主细胞,DNA,的一部分,，,，这一过,程,程称为整合,。整合后的,外,外来,DNA,仍然可随,染,染色体,DNA,一起复制,，,，并在适,当,当的条件,下,下进行表,达,达，但也,可,可在相当,长,长的一段,时,时间内不,表,表达。,基因工程,的,的操作过,程,程主要由,以,以下步骤,组,组成：,载体和目,的,的基因的,分,分离；载体和目,的,的基因的,切,切断；载体和目,的,的基因的,重,重组；重组,DNA,的转化和,扩,扩增；重组

3、,DNA,的筛选和,鉴,鉴定。,（一）载,体,体：,可以将目,的,的基因运,载,载进入细,胞,胞并进行,复,复制和表,达,达的DNA分子。,基,基因,工,工程中常,用,用的载体,(vector),主要包括质粒,(plasmid),、噬菌体,(phage),和病毒,(virus),三大类。,这,这些,载,载体均需,经,经人工构,建,建，除去,致,致病基因,，,，并赋予,一,一些新的,功,功能，如,有,有利于进,行,行筛选的,标,标志基因,、,、单一的,限,限制酶切,点,点等。,载体构建,的,的条件：,1.能,在,在受体细,胞,胞中独立,复,复制。,2.分,子,子量小，,易,易于分离,、,、纯化、

4、,导,导入,3.有,限,限制性内,切,切酶位点,。,。,4.有,可,可供选择,的,的遗传标,志,志。,5.易,于,于导入受,体,体细胞。,1质粒,：,：,是存在于,天,天然细菌,体,体内的一,种,种独立于,细,细菌染色,体,体之外的双链环状,DNA,，具有独立复制的能力，,通,通常带有,细,细菌的抗药基因。最早,使,使用的质,粒,粒,DNA,是人工构,建,建的,pBR322,，该质粒,分,分子大小,为,为,4.3kb,，带有抗,四,四环素和,抗,抗氨苄青,霉,霉素基因,，,，含,EcoR,，,BamH,，,Hind,等单一,的,的限制酶,切,切点。,质粒,pUC19,的分子结,构,构,2噬菌,

5、体,体：,l,可通过转,染,染方式将,其,其,DNA,送入细菌,体,体内进行,增,增殖。常,用,用的为人,工,工构建的,噬菌体载,体,体,。噬菌体,两,两端的片,段,段对于其,包,包装是必,需,需的，因,而,而应予保,留,留；而其,中,中间部分,则,则可进行,改,改造或置,换,换，使之,具,具有某种,单,单一的限,制,制酶切点,。,。目的基,因,因与噬菌,体,体,DNA,进行重组,时,时，可采,用,用插入重组,方,方式，也可采,用,用置换重组,方,方式。,3病毒,：,：,常用的为,SV40,，通过感,染,染方式将,其,其,DNA,送入哺乳,动,动物细胞,中,中进行增,殖,殖。目前,应,应用相对

6、,较,较少。,（二）目,的,的基因：,目的基因,的,的筛选和,分,分离可采,用,用以下方,法,法进行：,1直接,从,从染色体DNA中,分,分离：,仅适用于,原,原核生物,基,基因的分,离,离，较少,采,采用。,2人工,合,合成：,根据已知,多,多肽链的,氨,氨基酸顺,序,序，利用,遗,遗传密码,表,表推定其,核,核苷酸顺,序,序再进行,人,人工合成,。适,应,应于编码,小,小分子多,肽,肽的基因,。,。,l,采用一定,的,的方法钓,取,取特定基,因,因的,mRNA,，再通过,逆,逆转录酶,催,催化合成,其,其互补,DNA,（,cDNA,），除去,RNA,链后，再,用,用,DNA,聚合酶合,成,

7、成其互补,DNA,链，从而,得,得到双链,DNA,。这一方,法,法通常可,得,得到可表,达,达的完整,基,基因,。,3,从,mRNA,合成,cDNA,：,4从基,因,因文库中,筛,筛选：,将某一种,基,基因,DNA,用适当的,限,限制酶切,断,断后，与,载,载体,DNA,重组，再,全,全部转化,宿,宿主细胞,，,，得到含,全,全部基因,组,组,DNA,的种群，,称,称为,G,文库,(genomicDNAlibrary),。,将,将某种细,胞,胞的全部,mRNA,通过逆转,合,合成,cDNA,，然后转,化,化宿主细,胞,胞，得到,含,含全部表,达,达基因的,种,种群，称,为,为,C-,文库,(c

8、DNA library),。,C-,文库具有,组,组织细胞,特,特异性。,基因组文,库,库的制作,5,利用,PCR,合成：,l,如已知目,的,的基因两,端,端的序列,，,，则可采,用,用聚合酶,链,链反应（,polymerase chainreaction,PCR,）技术，,在,在体外合,成,成目的基,因,因。但此,法,法可能会,造,造成克隆,的,的目的基,因,因碱基序,列,列的改变,。,。,二、载体,和,和目的基,因,因的切断,：,：,通常采用限制性核,酸,酸内切酶(restrictionendonuclease)，简,称,称限制酶,，,，分别对,载,载体DNA和目的,基,基因进行,切,切断

9、，以,便,便于重组,。,。限制酶,目,目前已经,发,发现400多种，,所,所识别的,顺,顺序往往,为,为4-8,个,个碱基对,，,，且有回文结构。,由限制酶,切,切断后的,末,末端可形,成,成平端、,3-,突出粘性,末,末端和,5-,突出粘性,末,末端三种情况,。,。形成粘,性,性末端,(cohesive end),者较有利,于,于载体,DNA,和目的基,因,因的重组,。,。,三、载体,和,和目的基,因,因的重组,（,（接）,即将带有,切,切口的载,体,体与所获,得,得的目的,基,基因连接,起,起来，得,到,到重新组,合,合后的DNA分子,。,。（一）粘,性,性末端连,接,接法：当载体DNA和

10、目,的,的基因均,用,用同一种,限,限制酶进,行,行切断时,，,，二者即,可,可带有相,同,同的粘性,末,末端。如,将,将载体与,目,目的基因,混,混合在一,起,起，二者,即,即可通过,粘,粘性末端,进,进行互补,粘,粘合，再,加,加入DNA连接酶,，,，即可封,闭,闭其缺口,，,，得到重,组,组体。,较少的情,况,况下，对,产,产生的平,端,端也可直,接,接进行连,接,接。,载体,DNA,与目,的,的基,因,因的,连,连接,（二,）,）人,工,工接,尾,尾法,：,：即同,聚,聚物,加,加尾,连,连接,法,法。,当,当载,体,体和,目,目的,基,基因,无,无法,采,采用,同,同一,种,种限,制

11、,制酶,进,进行,切,切断,，,，无,法,法得,到,到相,同,同得,粘,粘性,末,末端,时,时，,可,可采,用,用此,方,方法,。,。,此法,首,首先,使,使用,单,单链,核,核酸,酶,酶将,粘,粘性,末,末端,切,切平,，,，再,在,在末,端,端核,苷,苷酸,转,转移,酶,酶的,催,催化,下,下，,将,将脱,氧,氧核,糖,糖核,苷,苷酸,添,添加,于,于载,体,体或,目,目的,基,基因,的,的,3-,端，,如,如载,体,体上,添,添加,一,一段,polyG,，则,可,可在,目,目的,基,基因,上,上添,加,加一,段,段,polyC,，故,二,二者,即,即可,通,通过,碱,碱基,互,互补,进,

12、进行,粘,粘合,，,，再,由,由,DNA,连接,酶,酶连,接,接。,四、,重,重组,DNA,的转,化,化和,扩,扩增,（,（转,）,）重组,DNA,需导,入,入宿,主,主细,胞,胞才,能,能进,行,行增,殖,殖或,表,表达,。,。重,组,组质,粒,粒可,通,通过转化（,transformation,）方,式,式导,入,入宿,主,主细,胞,胞，,即,即将,大,大肠,杆,杆菌,用,用,CaCl,2,处理,，,，增,加,加细,菌,菌细,胞,胞壁,的,的通,透,透性,，,，再,与,与重,组,组质,粒,粒,DNA,短暂,温,温育,，,，质,粒,粒,DNA,即可,导,导入,宿,宿主,细,细胞,。,。,如果

13、,是,是用,噬,菌,菌体,作,作为,载,载体,的,的重,组,组体,，,，则,需,需要,用,用外,壳,壳蛋,白,白进,行,行包,装,装，,使,使之,成,成为,具,具有,感,感染,能,能力,的,的噬,菌,菌体,，,，再,通,通过转染(transfection),方,方式,将,将重,组,组噬,菌,菌体DNA导,入,入大,肠,肠杆,菌,菌等,宿,宿主,细,细胞,。,。,重组,DNA,导入,宿,宿主,细,细胞,后,后，,即,即可,在,在适,当,当的,培,培养,条,条件,下,下进,行,行培,养,养以,扩,扩增,宿,宿主,细,细胞,。,。对,于,于质,粒,粒,DNA,，还,可,可通,过,过在,培,培养,基,

14、基中,加,加入,氯,氯霉,素,素，,抑,抑制,细,细菌,蛋,蛋白,质,质合,成,成及,染,染色,体,体,DNA,的复,制,制，,以,以单,独,独扩,增,增细,胞,胞中,的,的质,粒,粒,DNA,。,五、,重,重组,DNA,的筛,选,选和,鉴,鉴定,（,（筛,）,）,由于,重,重组,体,体导,入,入宿,主,主细,胞,胞的,比,比例,通,通常,较,较低,，,，因,此,此需,要,要对,含,含有,重,重组,体,体的,宿,宿主,细,细胞,进,进行,筛,筛选,并,并作,鉴,鉴定,。,。可,采,采用,以,以下,方,方法,进,进行,：,：（一,）,）根,据,据重,组,组体,的,的表,型,型进,行,行筛,选,选

15、：,对于,带,带有,抗,抗药,基,基因,的,的质,粒,粒重,组,组体,，,，可,采,采用插入,灭,灭活,法,法进行,筛,筛选,。,。如,pBR322,中带,有,有抗,氨,氨苄,青,青霉,素,素和,抗,抗四,环,环素,基,基因,，,，当,将,将目,的,的基,因,因插,入,入抗,四,四环,素,素基,因,因后,，,，就,可,可引,起,起该,基,基因,失,失活,，,，细,菌,菌对,氨,氨苄,青,青霉,素,素耐,药,药，,而,而对,四,四环,素,素敏,感,感。,在,在含,氨,氨苄,青,青霉,素,素的,培,培养,基,基上,能,能够,生,生长,，,，而,在,在含,四,四环,素,素的,培,培养,基,基上,不,

16、不能,生,生长,的,的细,菌,菌即,为,为带,重,重组,体,体的,细,细菌,。,。,插入,灭,灭活,法,法筛,选,选重,组,组体,（二,）,）根,据,据标,志,志互,补,补进,行,行筛,选,选：,当宿,主,主细,胞,胞存,在,在某,种,种基,因,因及,其,其表,达,达产,物,物的,缺,缺陷,时,时，,可,可采,用,用此,方,方法,筛,筛选,重,重组,体,体。,即,即在,载,载体,DNA,分子,中,中插,入,入相,应,应的,缺,缺陷,基,基因,，,，如,宿,宿主,细,细胞,重,重新,获,获得,缺,缺陷,基,基因,的,的表,达,达产,物,物，,则,则说,明,明该,细,细胞,中,中带,有,有重,组,组体,。,。,（三,）,）根,据,据DNA,限,限制,酶,酶谱,进,进行,分,分析,：,：,经过,粗,粗筛,后,后的,含,含重,组,组体,的,的细,菌,菌，,还,还需,进,进行,限,限制,酶,酶谱,分,分析,进,进一,步,步鉴,定,定。,将,将单,一,一细,菌,菌进,行,行扩,增,增后,分,分别,提,提取,其,其,DNA,，用,重,重组,时,时所,用,用的,同,同一,限,限制,酶,酶进,行,行酶,