动物细胞工程制药课件

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1、单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,,完整版课件,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,,完整版课件,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,二级,三级,四级,五级,,完整版课件,*,动物细胞工程制药,张忠山,,生命科学学院,,1,完整版课件,动物细胞工程制药张忠山1完整版课件,一、概述,二、动物细胞的形态和生理特点,三、生产用动物细胞的要求和获得,四、动物细胞的培养条件和培养基,五、动物细胞培养的方法和操作方式,六、动物细胞生物反应器及其检测控制系统,七、动物细胞制药的前景和展望

2、,,2,完整版课件,一、概述2完整版课件,第一节 概述,（1）发现细胞和细胞学说创立。1665年英国物理学家Hooke通过自制的显微镜观察切成薄片的软木时看到,死细胞的细胞壁,。,,（2）组织培养或细胞培养。1885年德国生理盐水培养鸡胚组织，至1907年，细胞体外培养宣布进入一个新时代。,,,3,完整版课件,第一节 概述（1）发现细胞和细胞学说创立。1665年英国物理,（3）细胞工程学时代。对细胞进行人工改造及培养以使其为人类服务的时代，包括真核细胞的基因重组、导入、扩增和表达的理论和技术，细胞融合的理论和技术，细胞器特别是细胞核移植的理论和技术，染色体改造的理论和技术，转基因动、植物的理论

3、和技术，细胞大量培养的理论和技术，以及产物分离纯化的理论和技术。,（4）细胞工程制药成为现代制药技术中常用的手段,。,,4,完整版课件,（3）细胞工程学时代。对细胞进行人工改造及培养以使其为人类服,应用领域,生产药品,：作为宿主细胞表达生产原核细胞所不能生产的药用蛋白。,基础研究的细胞材料,：细胞模型,种子细胞：,为组织修复与器官再生提供种子细胞。,,,5,完整版课件,应用领域生产药品：作为宿主细胞表达生产原核细胞所不能生产的药,第二节 动物细胞的形态和特点,一、动物细胞的形态,,二、动物细胞的生理特点,,6,完整版课件,第二节 动物细胞的形态和特点一、动物细胞的形态6完整版课件,,一、动

4、物细胞的形态,细胞的分化（或特化）,形态分化在离体培养同样也存在。,离体培养的细胞分为两类：,贴壁依赖型（anchorage-dependent）和,非贴壁依赖型（anchorage-independent），前者可简称为贴壁细胞，后者可简称为悬浮细胞。,,7,完整版课件,一、动物细胞的形态细胞的分化（或特化）7完整版,动物细胞,结构图,,8,完整版课件,动物细胞8完整版课件,1、贴壁细胞,,,特点：支持物,两种形态，即,成纤维样,细胞型或,上皮样,细胞型。前者主要来源于中胚层组织的细胞，生长时呈放射状、旋涡状或火焰状走行；后者主要来源于外胚层和内胚层组织的细胞，生长时彼此紧密连接成单层细胞片

5、。,,9,完整版课件,1、贴壁细胞9完整版课件,,,10,完整版课件,10完整版课件,,,11,完整版课件,11完整版课件,2、悬浮细胞,,这类细胞的生长,不依赖支持物,表面，可在培养液中呈悬浮状态生长，如血液的淋巴细胞和用以生产干扰素的Namalwa细胞等，细胞呈圆形。,,,,12,完整版课件,2、悬浮细胞12完整版课件,,3、兼性贴壁细胞,,兼具上述两种生长方式的细胞，称为兼性贴壁细胞，如CHO细胞、小鼠L929细胞。当它们贴附在支持物表面上生长时呈上皮或成纤维细胞的形态，而当悬浮于培养基中生长时则呈圆形，但有时它们可相互支持贴附在一起生长。,,,13,完整版课件,3、兼性贴壁细胞13完整

6、版课件,二、动物细胞的生理特点,1、细胞的分裂周期长,一般为12~48h，细胞分裂周期=间期（G,1,期+S期+G,2,期）+分裂期（M期）,,G,1,期：凡细胞无增殖活动时皆滞留在G,1,期,S,,期：DNA的合成，一般为6~8小时,,14,完整版课件,二、动物细胞的生理特点1、细胞的分裂周期长14完整,,G,2,期：DNA量加倍，RNA合成和染色体螺旋化，持续时间短，一般为2~5h。,M期：一般持续时间很短，仅0.5~1h。相当于有丝分裂的中后期和末期，主要是染色体的变化、分裂，并形成子细胞。,细胞分裂代数与培养中的代数及相互关系。,,,15,完整版课件,G2期：DNA量加倍，RNA合成和

7、染色体螺旋化，持续时间短，,,,16,完整版课件,16完整版课件,2、细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现象,,大多数正常二倍体（dipoid）细胞的生长都需要一定的基质（如玻璃，塑料等）上贴附，伸展后才能生长增殖，其机制可能与电荷、钙镁离子的作用以及许多贴附因子有关。,,17,完整版课件,2、细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现象17完整版课件,,当细胞在基质上分裂增殖，逐渐汇合成片时，细胞与其周围细胞相互接触时，细胞才停止增殖。保持一定的营养，细胞仍可存活一段时间，但细胞密度不再增加，该现象就称为,接触抑制或密度依赖抑制现象,。一旦细胞转化为异倍体后，该现象消失，细胞可多层生长，细胞密度可

8、大大增加。,,,18,完整版课件,当细胞在基质上分裂增殖，逐渐汇合成片时，细胞与其周围细胞相互,,,19,完整版课件,19完整版课件,,,20,完整版课件,20完整版课件,3、正常二倍体细胞的生长寿命是有限的,当细胞培养开始，称之为,原代培养,，经过传代后，即成为有限细胞系，即有限的生长传代时间，取决于细胞来源的种族和年龄，人胚成纤维细胞约可培养50代，鸡胚的30代，小鼠的8代。但是若向培养基中加入表皮生长因子，可使上皮细胞的寿命从原来的50代增加至150代。,当细胞突变为,异倍体,后，该细胞可转变成无限细胞系，或称连续细胞系。,,21,完整版课件,3、正常二倍体细胞的生长寿命是有限的21完整

9、版课件,,,22,完整版课件,22完整版课件,动物细胞培养一代生长过程,,23,完整版课件,动物细胞培养一代生长过程23完整版课件,,4、动物细胞对周围环境比较敏感,无,细胞壁,保护，因而外界的物理化学因素很容易产生影响。,,5、动物细胞培养基的要求高,与细菌和植物细胞不同，其需要12种必需氨基酸、8种以上的维生素、多种无机盐和微量元素、作为主要碳原的葡萄糖以及多种细胞生长因子和贴附因子，而且不同种类要求又有变化。,,24,完整版课件,4、动物细胞对周围环境比较敏感24完整版课件,6、动物细胞蛋白合成途径和修饰功能与细菌不同,场所：游离的核糖体以及粗面内质网上的核糖体，前者合成的蛋白质都用于细

10、胞质基质内，后者上合成的蛋白质是分泌性的和膜中的整合蛋白，多数为糖蛋白。,蛋白质上的糖链有的在,内质网,上加接，有的在,高尔基体,中加接。其中内质网中加接的是N-链寡糖，在高尔基体内加接的是O-链寡糖。,,25,完整版课件,6、动物细胞蛋白合成途径和修饰功能与细菌不同25完整版课件,动物细胞生产药物的优缺点,,缺点：培养条件高、成本贵、产量低。,优点：分泌胞外、纯化方便、翻译后修饰糖基化，与天然产品一致。,,26,完整版课件,动物细胞生产药物的优缺点26完整版课件,第三节 生产用动物细胞的要求和获得,一、生产用动物细胞的要求,二、生产动物细胞的获得,三、常用生产用动物细胞的特性,四、基因工程细

11、胞的构建和筛选,五、细胞库的筛选,,27,完整版课件,第三节 生产用动物细胞的要求和获得一、生产用动物细胞的要求2,传代细胞的要求,正常原代细胞 二倍体细胞 无限制,,癌细胞生产药物,需谨慎,！,,28,完整版课件,传代细胞的要求正常原代细胞 二倍体细胞,,一、生产用动物细胞的要求,（1）原代正常组织分离的细胞,（2）二倍体细胞，即使是传代细胞,（3）传代细胞用于生产,（4）按照FDA对细胞株的要求，控制最终产品中DNA残留量。,,29,完整版课件,一、生产用动物细胞的要求（1）原代正常组织分离,,1、原代细胞：,是直接取自动物组织、器官，经过粉碎、消化而获

12、得的细胞悬液。一般1g组织约有10,9,个细胞。,,鸡胚细胞、原代兔肾或鼠肾细胞、淋巴细胞,费钱费劳力,,30,完整版课件,30完整版课件,,2、二倍体细胞系：,原代细胞经过传代、筛选、克隆，从而从多种细胞成分的组织中挑选并纯化出某种具有一定特征的细胞株。,WI-38、MRC-5、2BS等,,,31,完整版课件,2、二倍体细胞系：原代细胞经过传代、筛选、克隆，从而从多种细,,3、转化细胞系：,失去了正常细胞的特点，可以无限增殖。,,自发转化、人为转化,,Namalwa、CHO、BHK-21、Vero等。,各单位细胞库保存,,32,完整版课件,3、转化细胞系：失去了正常细胞的特点，可以无限增殖。

13、32完整,4、融合细胞系,动物细胞融合技术----也称动物体细胞杂交技术，是指二个或者二个以上的动物细胞在外力作用下，合并为一个多核细胞的过程。,,,,33,完整版课件,4、融合细胞系33完整版课件,促融因素,（1）病毒诱导融合,,（2）PEG诱导融合,,（3）电场诱导融合,,（4）其它诱导融合,,34,完整版课件,促融因素（1）病毒诱导融合34完整版课件,（1）病毒诱导融合,仙台病毒、流感病毒、新城疫鸡瘟病毒、疱疹病毒等,,当二种不同的动物细胞混合物中存在大量病毒时，病毒或其组分会在细胞间起粘连作用而使细胞聚集成团，细胞膜上的蛋白质和脂质双分子层产生重排、进而结合成一个整体。,,随机的，无法

14、人为控制，同时融合率较低。,,35,完整版课件,（1）病毒诱导融合仙台病毒、流感病毒、新城疫鸡瘟病毒、疱疹病,（2）,PEG,诱导融合,当二种不同的动物细胞混合物中存在PEG时，就会产生细胞聚集作用。在除去PEG的过程中，即产生细胞融合现象。,,所用的PEG分子量在1000-6000之间，一般浓度为40-50%，在37,℃,下作用2-3分钟，其促融效果最佳。,,PEG促融合的作用机理不清，其促融作用也具有随机性，无法人为控制。,,36,完整版课件,（2）PEG诱导融合当二种不同的动物细胞混合物中存在PEG时,（3）电场诱导融合,将二种细胞混合物经过10-100V/cm的低强度非均匀交变电场作用

15、时，细胞之间就会发生紧密接触，形成稳定的串珠状偶极子排列。在此基础上再对细胞实施瞬间高强度电脉冲就会发生膜击穿，不同细胞间通过膜脂质分子重排就能实现融合，形成一个双核或者多核的细胞。,,一般来说，击穿电压为0.5-10KV/cm，作用时间为30-50微秒。,,电场诱导融合不损伤细胞，具有可人为操作的控制的特性，,融合率较高,。,,37,完整版课件,（3）电场诱导融合将二种细胞混合物经过10-100V/cm的,三、常用生产用动物细胞的特性,（1）WI-38：,1961年来源于女性高加索人正常胚肺组织的二倍体细胞系，核型2n=46。该细胞是成纤维细胞，能产生胶原，培养基用BME（Eagle’s b

16、asal medium）加小牛血清，pH控制在7.2，同工酶为G6PD B型。细胞的倍增时间为24h，有限寿命为50代，上世纪60年代被广泛用于制备疫苗。,,38,完整版课件,三、常用生产用动物细胞的特性（1）WI-38：1961年来源,,（2）MRC-5：,特性和用途与WI-38相似，1966年来源于14周正常男性，对多种人的病毒敏感，用于疫苗的生产。,,,39,完整版课件,（2）MRC-5：特性和用途与WI-38相似，1966年来源,（3）CHO-K1：,1957年从中国地鼠卵巢中分离的一株上皮样细胞。在培养时需加入脯氨酸。核型为2n=20~22。目前广泛用于构建工程细胞的是一株缺乏二氢叶

17、酸还原酶的营养缺陷突变株CHO-dhfr,-,，它常用的培养基为DMEM培养基，加0.1 mol/L次黄嘌呤和0.01m mol/L胸苷，以及10%小牛血清。,,40,完整版课件,（3）CHO-K1：1957年从中国地鼠卵巢中分离的一株上皮,（4）BHK-21：,1961年从5只无性别的生长1天的地鼠幼鼠的肾脏中分离的。现在广泛采用的是1963年用单细胞分离的方法经13次的克隆的细胞。成纤维细胞，2n=44。通常用的培养基为DMEM培养基，添加7%胎牛血清。过去多用于增殖病毒，包括多瘤病毒、口蹄疫病毒和狂犬病疫苗，现在已被用于构建工程细胞。,,41,完整版课件,（4）BHK-21：1961年从

18、5只无性别的生长1天的地鼠幼,（5）Vero：,1962年来源于正常的成年非洲绿猴肾。是贴壁依赖的成纤维细胞，2n=60，高倍体率为1.7%，可持续地进行培养。通常用的培养基为199培养基，添加5%胎牛血清。该细胞可支持多种病毒的增殖，包括脊髓灰质炎、狂犬病病毒，已被批准用于人体。,,42,完整版课件,（5）Vero：1962年来源于正常的成年非洲绿猴肾。是贴壁,（6）Namalwa：,1972年来源于肯尼亚患有Burkitt淋巴瘤的病人体中，后在瑞典构建的一株人的类淋巴母细胞，高细胞有2.8%的高倍体率，多数细胞有12~14条标记染色体，单条X染色体，无Y染色体。通常用的培养基为RPMI 1

19、640，添加7%胎牛血清。用于大规模生产,-,干扰素。,,,43,完整版课件,（6）Namalwa：1972年来源于肯尼亚患有Burkit,（7）SP2/0-Ag14：,该细胞是1978年中通过融合的方法，从有抗羊红细胞活性的BALB/c小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞系P3X63Ag8融合的杂交瘤SP2/HL-Ag亚克隆中分离得到。它不分泌任何免疫球蛋白抗体链，能耐受8-氮鸟嘌呤（8-azaguanine）20,g/ml，但在含HAT选择培养基中不能存活。通常用的培养基为DMEM培养基，添加10%胎牛血清。,,44,完整版课件,（7）SP2/0-Ag14：该细胞是1978年中通过融合的方,（8）

20、Sf-9：,1983年从亲代IPLB-SF21 AE中克隆形成。亲代细胞则在1977年从秋粘虫（Spodoptera frugiperda)的蛹卵组织中分离获得。它对苜宿尺蠖核型多角体病毒（Autographa california MNPV）和其他杆状病毒（Baculovirus）高度敏感。通常用的培养基为Grace培养基，添加3.3g/L 水解乳蛋白和3.3g/L酵母浸液，以及10%胎牛血清。目前已经被广泛用于高效表达外来蛋白制品。,,45,完整版课件,（8）Sf-9：1983年从亲代IPLB-SF21 AE中克,四、基因工程细胞的构建和筛选,原代细胞、二倍体细胞系和转化细胞系三者在生产中

21、都有使用，但在生产中采用更多的、更有前景的是融合细胞及采用基因工程手段构建的各种工程细胞。当前被用以构建工程细胞的动物细胞有CHO-dhfr,-,、BHK-21、Namalwa、Vero、SP2/0和Sf-9等细胞。,那么如何获得动物工程细胞呢？,,46,完整版课件,四、基因工程细胞的构建和筛选原代细胞、二倍体细胞系和转化细胞,,1、真核细胞基因表达 载体的构建,目前一般使用的载体有两类：一是,病毒载体,，如牛痘病毒、腺病毒和逆转录病毒和杆状病毒等。,牛痘病毒,已被广泛地用来构建成多价疫苗，腺病毒和逆转录病毒载体正被试用用于基因治疗中，而杆状病毒载体-昆虫细胞系统已被成功地用于

22、300多种外源基因的高效表达。,,47,完整版课件,1、真核细胞基因表达 载体的,用,杆状病毒,做载体有许多优点：,（1）该病毒基因组是双链DNA，容易进行重组。,（2）插入7~8kb的DNA不影响正常病毒粒子的形成。,（3）,多角体蛋白,和病毒粒子的形成无直接关系，因此用外源基因更换多角体蛋白基因，仍能形成有感染力的病毒粒子。,,48,完整版课件,用杆状病毒做载体有许多优点：48完整版课件,（4）多角体蛋白基因有非常强的启动子，产生的蛋白质可占全部蛋白质的20~30%。,（5）用光学显微镜可看到多角体，容易以此为标记物来挑选阳性克隆。,（6）如果用家蚕杆状病毒，还可在蚕体直接

23、表达外源基因。,,,,49,完整版课件,（4）多角体蛋白基因有非常强的启动子，产生的蛋白质可占全部蛋,另一类是,质粒载体,，而且常常是穿梭质粒载体，即在细菌和哺乳动物细胞两者体内都能扩增。构建此类载体一般含有如下基本成分： （1）允许载体在细菌体内扩增的,质粒序列,。多数含有质粒pBR322或其衍生载体pAT153的序列，包括能使质粒在细菌体内复制的起始位点和抗生素标记基因。,,50,完整版课件,另一类是质粒载体，而且常常是穿梭质粒载体，即在细菌和哺乳动物,（2）含有能使基因转录表达的,调控元件,，在5’端转录起动需要有,启动子,，包括帽状位点（RNA转录起始点）上游约30碱基处的TATA框和

24、上游70~90碱基处的CAAT框序列和增强子。当前构建载体的许多启动子序列都来自病毒。也有其它来源的启动子。此外，在基因3’端应有,终止序列,、RNA 3’端的切割序列和poly A序列等。近来有人在载体里加入显性活动调控区（DCR）序列，以此来克服因载体整合在宿主基因组位点而产生的表达水平降低。,,51,完整版课件,（2）含有能使基因转录表达的调控元件，在5’端转录起动需要有,（3）能用以筛选出外源基因已整合的,选择标记,。一般有两类标记：一类仅适合用于密切相关的突变细胞株，如采用标记基因,hgprt,、,tk,和,aprt,等基因，它们仅适用于,hgprt,-,、,tk,--,和,aprt

25、,--,等基因缺失的细胞株。另一类是显性作用基因，如neo基因，它能使氨基糖苷抗生素—新霉素磷酸化而失活，从而使原来对新霉素敏感的哺乳动物细胞一旦获得含该基因的载体后，就能在含该抗生素的培养基中存活。,,52,完整版课件,（3）能用以筛选出外源基因已整合的选择标记。一般有两类标记：,,（4）有时还带有选择性增加拷贝数的扩增系统。最常用的是编码二氢叶酸还原酶的基因。该酶的扩增可防止氨甲喋呤（MTX）对细胞的毒害作用。利用该原理，在构建载体时可有意识地将它与目的基因重组在一起，当在培养基内增加MTX浓度时，就会促使,dhfr,基因的扩增，同时也会使其毗邻的目的基因随之扩增，从而大大提高表达量。类似

26、的扩增系统还有谷氨酰胺合成酶和腺苷脱氢酶等系统。,,,53,完整版课件,（4）有时还带有选择性增加拷贝数的扩增系统。最常用的是编码二,2、基因载体的导入和高效表达 工程细胞株的筛选,（1）DNA导入动物细胞方法：,,融合法、化学法、物理法、病毒法,,（2）筛选：,,筛选系统、克隆纯化,,54,完整版课件,2、基因载体的导入和高效表达,,五、细胞库的建立,除原代细胞外，其它的细胞株、细胞系都需要建细胞库加以保存。按照我国和美国FDA的规定，用于生产的工程细胞必须建立两个细胞库：,原始细胞库,（master cell bank， MCB）和,生产用细胞库,（ma

27、nugacture’s working cell bank，MWCB）或称工作细胞库（working cell bank， WCB）。,,55,完整版课件,五、细胞库的建立除原代细胞外，其它的细胞株、细,储存于MCB的细胞应该是单一来源的均质的细胞，对于二倍体细胞应该是群体倍增水平尽可能低的细胞。储存时应具有该细胞详细档案，包括：,（1）该细胞系的历史：,（2）该细胞的特性：,（3）对各种有害因子的检查结果：,,56,完整版课件,储存于MCB的细胞应该是单一来源的均质的细胞，对于二倍体细胞,储存于MWCB的细胞应该是从MCB来的，或从单一安瓿来，或从多个安瓿在融化即刻混合在一起的，然后经培养扩

28、增到一定数量后，再分装储存形成的细胞库。同样该细胞库也必须建立档案，而且需要进行无菌性和无细胞交叉污染的检查。生产时需确定其最高使用的传代数。,,57,完整版课件,储存于MWCB的细胞应该是从MCB来的，或从单一安瓿来，或从,第四节 动物细胞的培养条件和培养基,为了使细胞培养在体外培养成功，需要一些基本条件：,（1）绝对无菌操作；,（2）足够的营养供应，排除有害物质包括极其微量的离子掺入；,（3）适量氧气供应；,,58,完整版课件,第四节 动物细胞的培养条件和培养基为了使细胞培养在体外培养,,（4）随时清除细胞代谢中产生的有害产物；,（5）有良好的适于生存外界环境，包括pH、渗透压和离子浓

29、度等；,（6）及时分种，保持合适的细胞密度。,,,59,完整版课件,（4）随时清除细胞代谢中产生的有害产物；59完整版课件,,一、动物细胞的培养条件,,1、器材的清洗和消毒,器材的清洗：一般来说，需经,浸泡、刷洗、泡酸和冲洗,四个步骤，用过的器材最好尽快地浸泡在3%的磷酸三钠溶液内过夜，以除去蛋白质和残余细胞等污垢。,,,60,完整版课件,一、动物细胞的培养条件60完整版课件,,器材的消毒灭菌：主要通过物理方法和化学方法来达到严格无菌的操作过程。书中表3-4是细胞培养中常用的消毒剂、浓度和使用场合的列表。尽量避免使用抗生素，但在工业生产中还是经常使用的。常用抗生素及其浓度见表3-5。,,61,

30、完整版课件,器材的消毒灭菌：主要通过物理方法和化学方法来达到严格无菌的操,2、水质,蒸馏、离子交换、电渗析、反渗透、中空纤维过滤等单独使用或配合使用，制备纯水，一般要求金属离子含量很低，电阻值在18M,以上。动物细胞制药用水，要求去热源。,,62,完整版课件,2、水质62完整版课件,3、pH,pH的高低对细胞各种酶的活性、细胞壁的通透性以及许多蛋白的功能都有重要的影响。动物细胞培养的最适pH为,7.2~7.4,，低于6.8或高于7.6时会对细胞产生不利影响，严重时会引起细胞退变甚至死亡。,,63,完整版课件,3、pH63完整版课件,4、渗透压,在细胞培养的所有操作中，为了使与细胞接触的所有液

31、体都保持有较合适的渗透压和pH，一般都需要使用平衡盐溶液（balanced salt solution, BSS），它由无机盐和葡萄糖组成。表3-6列出了几种常用平衡盐溶液（BSS）组成。,,64,完整版课件,4、渗透压64完整版课件,,5、温度,,哺乳动物 ：（37±0.5）℃,昆虫：27 ℃,,6、空气,,65,完整版课件,5、温度65完整版课件,二、动物细胞培养基的种类和组成,细胞种系不同对培养基的要求亦有差异，主要有三类：天然培养基、合成培养基和无血清培养基。,1、天然培养基,：在细胞培养的早期阶段使用的培养基，主要为来自天然的材料如血浆凝块、血清、淋巴液、胚胎浸液以及羊水、腹水等。

32、,,66,完整版课件,二、动物细胞培养基的种类和组成细胞种系不同对培养基的要求亦,,优点,：营养价值高,缺点,：成分复杂、来源有限、成本较高,,血清,（serum）：纤维蛋白已被除去(如通过血凝或去纤维蛋白法)的血浆。,,,67,完整版课件,优点：营养价值高67完整版课件,,2、合成培养基：,优点是成分明确，组分稳定，可大量生产供应。动物细胞培养中常用的有BME、MEM、DMEM、HAM F12、RPMI 1640以及ISOCOV、199和McCoy等。,,缺点,：无法替代一些未知成分。,解决途径合成培养基中添加小牛血清，彼此互补,,,68,完整版课件,2、合成培养基：优点是成分明确，组分稳

33、定，可大量生产供应。动,上述合成培养基中主要有：,氨基酸：12种必需+谷氨酰胺,维生素：脂溶性和水溶性,糖类：葡萄糖、谷氨酰胺,无机盐：保持渗透压,其它一些特定成分如核酸的前体腺苷、鸟苷等。,,69,完整版课件,上述合成培养基中主要有：69完整版课件,,为了给细胞培养以更大的方便，以便于其增殖或贴附生长，长向培养基中加入一定量的动物血清，常用的是添加5%~10%的小牛血清，杂交瘤细胞的培养中，血清可能要求的更高，常用10~20%的胎牛血清,。,,70,完整版课件,为了给细胞培养以更大的方便，以便于其增殖或贴附生长，长向培养,,血清的作用机制可能为：（1）提供有利于细胞生长增殖所需要的各种,生长

34、因子和激素,；（2）提供有利于细胞贴壁所需要的,贴附因子和伸展因子,；（3）提供可识别金属、激素、维生素和脂类的结合蛋白；（4）提供细胞生长所必须的脂肪酸和微量元素。,,,71,完整版课件,血清的作用机制可能为：（1）提供有利于细胞生长增殖所需要的各,3、无血清培养基,无血清培养基的优点如下：,①提高了细胞培养的可重复性，避免，避免了由于血清批之间差异的影响；②减少了由血清带来的病毒、真菌和支原体等微生物污染的危险；③供应充足、稳定；,,72,完整版课件,3、无血清培养基72完整版课件,,④细胞产品容易纯化；⑤避免了血清中某些因素对有些细胞的毒性；⑥减少了血清中蛋白对某些生物测定的干扰，便于实

35、验结果的分析。,,,,73,完整版课件,④细胞产品容易纯化；⑤避免了血清中某些因素对有些细胞的毒性；,,目前已经有市售无血清培养基（书中表5-8所示）。无血清培养基中都是在合成培养基内加入不同种类的添加剂所构成，大致有以下几类：,,74,完整版课件,目前已经有市售无血清培养基（书中表5-8所示）。无血清培养基,（1）激素和生长因子：使用最多的是胰岛素，促进糖原和脂肪酸的合成，对细胞生长有刺激作用。（2）结合蛋白：最经常被补充的是铁传递蛋白和白蛋白。为了便于纯化，有时可用硫酸亚铁、柠檬酸铁、葡萄糖酸铁代替铁传递蛋白。,,75,完整版课件,（1）激素和生长因子：使用最多的是胰岛素，促进糖原和脂

36、肪酸的,（3）贴附和伸展因子：目前多数无血清培养基只适用于悬浮细胞，真正能用以培养贴壁细胞的很少，也很贵，原因在于它们均缺少必需的贴附和伸展因子，除这些因子外，有的还添加维生素A酸和重组的小肽，它可与细胞的受体结合。（4）其它有利于细胞生长的因子和元素：它们包括有消除氧自由基损害的谷胱甘肽，某些微量元素，如硒等。,,76,完整版课件,（3）贴附和伸展因子：目前多数无血清培养基只适用于悬浮细胞，,三、,动物细胞培养所需仪器设备,实验室要求,（A）和缓冲间相连，缓冲间内备消毒服装和鞋，口罩等，入内换上。,（B）室内空气不流通，有适当的光线，清洁，干燥,。,（C）侧部可设传递窗，用于物品传递。,（

37、D）有消毒用紫外线灯,,,77,完整版课件,三、动物细胞培养所需仪器设备实验室要求77完整版课件,,,78,完整版课件,78完整版课件,（1）培养器具,,培养瓶,培养板,培养皿,,79,完整版课件,（1）培养器具培养瓶培养板培养皿79完整版课件,,,（2）超净工作台,超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。,,,100级超净工作台指标：,（≥0.5цm≤3.5粒/L）,,80,完整版课件,（2）超净工作台超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过,,,（3） CO,2,培养箱,CO2培养箱设定的条件为37 ℃ ，5％CO,2,。,二氧化碳的作

38、用：维持PH值。,,81,完整版课件,（3） CO2培养箱CO2培养箱设定的条件为37 ℃ ，,,（4）倒置显微镜,,82,完整版课件,（4）倒置显微镜82完整版课件,,,（5）纯化水装置,,83,完整版课件,（5）纯化水装置83完整版课件,四、进行动物细胞培养的材料,1、,胚胎组织,------如10—20日龄的鸡胚、实验动物胚胎、人工流产的胎儿。胚胎组织的细胞由于互相之间粘连作用较弱、易于消化和分散、并且其细胞生命力强，易于培养和增殖。,,,84,完整版课件,四、进行动物细胞培养的材料1、胚胎组织------如10—2,,2、,成体组织,------如肝脏、脾脏、心脏、肾脏、白血球等等，由

39、于其细胞之间具有较强的粘合作用，培养难度较大。,,,85,完整版课件,2、成体组织------如肝脏、脾脏、心脏、肾脏、白血球等等,,3、,肿瘤组织,-----细胞增殖能力强，可在体外长期培养和繁殖，并且可以采用微生物培养方法进行悬浮培养。,,,,86,完整版课件,3、肿瘤组织-----细胞增殖能力强，可在体外长期培养和繁殖,第五节 动物细胞培养的基本方法,动物细胞培养的概念 :,从动物机体中取出相关细胞,将它分散成单个细胞,放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖．,,87,完整版课件,第五节 动物细胞培养的基本方法动物细胞培养的概念 :87完整,,,88,完整版课件,88完整版课件,,细胞

40、系的分离与培养,胰蛋白酶：细胞间质较少的软组织，胚胎、肝、肾及传代细胞,胶原酶：纤维、上皮、癌组织,链霉蛋白酶、粘蛋白酶、蜗牛酶,动物组织或器官,洗涤 粉碎,酶解消化,离心或过滤,接种培养,培养液稀释细胞,洗 涤,,,,,,,,89,完整版课件,细胞系的分离与培养胰,细胞计数,1、自动细胞计数器计数,,2、血球计数板计数,,3、结晶紫染色细胞核计数,,4、,MTT,染色计数,,,90,完整版课件,细胞计数1、自动细胞计数器计数90完整版课件,,,ADAM-MC全自动细胞计数仪,,,91,完整版课件,ADAM-MC全自动细胞计数仪 91,,,,92,完整版课件,92完整版课件,细胞传代,1、悬浮

41、细胞传代,,2、贴壁细胞传代：消化液消化,,93,完整版课件,细胞传代1、悬浮细胞传代93完整版课件,细胞冻存与复苏,1、冻存,温度：液氮（-196℃）,速度：1 ℃/min,,2、复苏,,94,完整版课件,细胞冻存与复苏1、冻存94完整版课件,屠呦呦与拉斯克奖,2011年9月24日，拉斯克基金会将临床医学研究奖授予81岁的中国中医研究院研究员屠呦呦，以表彰其在,治疗疟疾的青蒿素研究,中的贡献。,,这是“拉斯克奖”设立65年来,首次,颁予,中国科学家,，也是中国生物医学界迄今获得的世界级最高大奖。,,95,完整版课件,屠呦呦与拉斯克奖2011年9月24日，拉斯克基金会将临床医学,,,,96,完

42、整版课件,96完整版课件,,,,97,完整版课件,97完整版课件,研究背景,疟疾,（Malaria）经按蚊叮咬而感染疟原虫所引起的虫媒传染病。,19世纪，从金鸡纳树皮中分离出抗疟成分,奎宁,。随后，科学家人工合成了奎宁，又找到了奎宁替代物—,氯喹,。氯喹药物一度是抗击疟疾的特效药。,二战后，疟原虫产生了,抗药性,。20世纪60年代初，疟疾再次肆疟，疫情难以控制。科学家开始,寻找新药,。,,98,完整版课件,研究背景疟疾（Malaria）经按蚊叮咬而感染疟原虫所引起的,美国投入,巨额资金,，筛选出,20多万,种化合物，但没有找到理想的药物。,,国内多个省份的科研人员已经筛选了,4万多种,抗疟疾的

43、化合物和中草药，没有令人满意的结果。,,99,完整版课件,美国投入巨额资金，筛选出20多万种化合物，但没有找到理想的药,青蒿素研发时间表,1967年 中国启动研发抗疟新药的大项目—“,523项目,”，500名科研人员组成研发大军。,1969年 39岁的屠呦呦以,中医研究院科研组长,的身份加入“523项目”。,1971年 经过反复筛选、试验，屠呦呦领导的研究小组将目光锁定,青蒿,（一种菊科草本植物）。经过,190,多次失败后，用,乙醚,制取的191号样品获得成功。,,100,完整版课件,青蒿素研发时间表1967年 中国启动研发抗疟新药的大项目—“,1972年 屠呦呦在南京召开的“523项目”工作

44、会议上报告了实验结果。,1973年 北京中药研究所拿到青蒿素的,结晶,。青蒿结晶的抗疟功效在其他地区得到证实。“523项目”办公室将青蒿结晶物命名为,青蒿素,，作为新药进行研发。,2004年 世卫组织正式将青蒿素复方药物列为,治疗疟疾的首选药物,，从此青蒿素作为“中国神药”在世界各地显示奇效。统计显示，青蒿素复方药物对恶性疟疾的治愈率达到,97％,。,,101,完整版课件,1972年 屠呦呦在南京召开的“523项目”工作会议上报告了,搜集600多种草药方,,从系统整理历代医籍入手，她查阅经典医书、地方药志，四处走访老中医，做了,2000,多张资料卡片，最后整理了一个,600,多种包括青蒿在内的

45、草药《抗疟单验方集》，供研究者进一步发掘。,李时珍的《,本草纲目,》说青蒿能“治疟疾寒热”。,,,102,完整版课件,搜集600多种草药方 从系统整理历代医籍入手，她查阅经典医书,灵感,在众多中草药中，研究小组发现青蒿对疟疾的抑制率相对较高，能达到,68%,。然而，之后的重复试验中，青蒿的抑制率反而,降低,了。,东晋《,肘后备急方,》中的几句话引起了她的注意：,“青蒿一握，以水二升渍，绞取汁，尽服之。”,,103,完整版课件,灵感在众多中草药中，研究小组发现青蒿对疟疾的抑制率相对较高，,,绞汁,使用的办法，和中药常用的,煎熬法,不同。这是不是为了避免青蒿的有效成分在高温下被破坏？屠呦呦受到启发

46、，想到用,沸点较低的乙醚,制取青蒿提取物。,,经过190多次失败后，终于，用乙醚制取的191号样品，对鼠疟猴疟的抑制率达到了,100%,。,,104,完整版课件,绞汁使用的办法，和中药常用的煎熬法不同。这是不是为了避免青蒿,青蒿与青蒿素,,,105,完整版课件,青蒿与青蒿素 105完整版课件,题外话,拉斯克奖在医学界又被称作,“诺贝尔奖风向标”。,,统计数字表明，,48%,的拉斯克,基础,医学研究奖获得者随后获得诺贝尔奖，,28%,的拉斯克基础医学研究奖和临床医学研究奖获得者已经成为诺贝尔奖得主。,,106,完整版课件,题外话拉斯克奖在医学界又被称作“诺贝尔奖风向标”。 106完,相关问题,1、查阅资料讲讲青蒿还有哪些药理作用。,2、青蒿素具有什么毒理作用？,3、如何避免青蒿素不产生抗药性？,,107,完整版课件,相关问题1、查阅资料讲讲青蒿还有哪些药理作用。107完整版课,感谢亲观看此幻灯片，此课件部分内容来源于网络，,如有侵权请及时联系我们删除，谢谢配合！,感谢亲观看此幻灯片，此课件部分内容来源于网络，,