农业大学病毒学实验技术之病毒纯化

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1、Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,单击此处编辑母版标题样式,*,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第六章 病毒的纯化,利用各种物理、化学方法，以,不使病毒受损伤和失活为前提,，去除宿主细胞组分等非病毒杂质，提取出高纯度浓缩的病毒样品。,病毒微细结构的研究,病毒抗原蛋白的分离纯化,病毒化学成分及其遗传物质的研究,病毒感染的分子细节的研究,一、病毒纯化的标准,保持感染

2、性,具有均一性：,结晶形成,检测病毒制备物均一性的方法：,电镜观察：,大小、形态均一,超速离心：,沉降速率和密度一致，只出现一条沉降带,电泳：,颗粒大小及表面电荷均一，只形成一条电泳带,免疫学方法：,只与特异性抗体发生反应,大小、形态、密度、化学组成、分子量、抗原性,二、病毒纯化的理论依据,病毒体外表面的主要化学组成是蛋白质，可利用蛋白质提纯的方法纯化病毒,病毒体具有一定大小、形状和密度，可利用超速离心技术提纯病毒,三、病毒纯化前的预处理,1、病毒感染的组织、脏器或细胞,研磨匀浆,超声波处理,反复冻融,低速离心去掉细胞碎片,2、细胞培养液、鸡胚尿囊液,低速离心去掉可能含有的杂质或直接用于病毒的

3、分离纯化,沉淀法,超速离心法,超滤法,层析法,两相溶剂间分配系数法,吸附法,电泳法,四、病毒纯化的方法,（一）沉淀法,主要从稀的病毒悬浮液中浓缩病毒。,中性盐沉淀法（盐析）,聚乙二醇沉淀法,有机溶剂沉淀法,等电点沉淀法,皂土法,鱼精蛋白沉淀法,1、中性盐沉淀法（盐析）,先用其它方法去除材料中的大量杂质，再以高浓度的中性盐溶液盐析，析出的沉淀用缓冲液悬浮后再进行盐析，反复几次后，悬浮沉淀，用透析法或其它方法脱盐。,病毒一般在45%以上饱和度的硫酸铵溶液中沉淀，且保持感染性。,2、聚乙二醇（PEG）沉淀法,用于病毒沉淀的分子量：2000-6000,将PEG配成50%左右的溶液，或直接将固体PEG加

4、于病毒悬液中，使其达到所需浓度，在4搅拌过夜，然后离心使病毒沉淀。,3、有机溶剂沉淀法,乙醚、甲醇、氯仿、正丁醇、氟碳化合物,原理：,A、降低溶液的介电常数，从而增加病毒颗粒表面不同电荷之间的引力，导致其溶解度降低。,B、与水作用，破坏蛋白质分子的水化膜。,优点：,分辨力高，易除去,缺点：,易使表面蛋白质变性，溶解脂质,4、等电点沉淀法（分辨力不高）,原理：,病毒粒子在等电点时，所携带的正电荷与负电荷相互中和，因而失去相互排斥的作用而发生沉淀（分辨力不高）。,多数病毒的等电点在pH4.,5.5之间。,5、皂土,法,法,轮状病毒,皂土在酸,性,性条件下,（,（pH4,4.5),可,可吸附轮,状,

5、状病毒，,在,在碱性条,件,件下(pH8.5)，又使,其,其洗脱下,来,来。,6、鱼精,蛋,蛋白沉淀,法,法（沉淀,直,直径大于50nm,的,的病毒）,鱼精蛋白,为,为碱性蛋,白,白，具有,携,携带其它,蛋,蛋白质（,直,直径大于50nm,）,）共沉,淀,淀的作用,，,，当向这,种,种沉淀物,加,加入1mol/LNaCl时，其,它,它蛋白质,又,又重新释,放,放到悬液,中,中，而鱼,精,精蛋白仍,然,然沉淀。,（二）层,析,析法,葡聚糖柱,层,层析法,凝胶层析,法,法,离子交换,柱,柱层析法,亲和层析,法,法,（三）两,相,相溶剂间,分,分配系数,法,法,原理：溶质在两,个,个互不相,溶,溶的

6、溶剂,中,中分配系,数,数的不同,而,而选择性,地,地分配于,其,其中的一,方,方。,常用的溶,剂,剂：葡聚糖硫,酸,酸盐（dextran sulphate,Ds),聚乙二醇,（,（PEG,）,）,甲基纤维,素,素（MC,）,）,聚乙烯醇,（,（PVA,）,）,分配体系,：,：Ds-PEG系、Ds-PVA系、Ds-MC系,（四）吸,附,附法,原理：利用对病,毒,毒或对杂,质,质有选择,吸,吸附能力,的,的固体吸,附,附剂吸附,病,病毒或吸,附,附杂质，,再,再用一定,的,的盐溶液,把,把它们洗,脱,脱下来。,作为吸附,剂,剂必须具,备,备的特点,：,：,有较大的,表,表面积和,吸,吸附能力,较

7、高的吸,附,附选择性,便于洗脱,性质稳定,常用吸附,剂,剂：,白土,磷酸钙,硅藻土,红细胞,离子交换,树,树脂,羧甲基纤,维,维素,（六）超,滤,滤法,利用超滤,膜,膜将水、,盐,盐及小分,子,子滤过，,将,将一定大,小,小的大分,子,子或病毒,等,等颗粒截,住,住从而使,后,后者得到,浓,浓缩。,优点：,可用于大,容,容量样品,的,的浓缩,可以在室,温,温或低温,下,下操作,对被浓缩,产,产物的损,害,害小,浓缩的同,时,时可达到,部,部分纯化,回收率高,可防止外,来,来污染,（五）电,泳,泳法,（七）离,心,心法,差速离心,速度区带,离,离心法,密度梯度,离,离心,1.差速,离,离心法,原

8、理：不同大小,和,和比重的,粒,粒子沉降,速,速度不同,。,。,用途：从组织培,养,养液、鸡,胚,胚尿囊液,或,或经过红,细,细胞吸附,释,释放的病,毒,毒悬液中,提,提纯病毒,。,。,优点：可快速处,理,理大量样,品,品,步骤：低速（2000-3000r/min,20-30min),、,、中速（10000min,20-30min)去,除,除较大的,宿,宿主细胞,碎,碎片、污,染,染的细菌,及,及其它较,大,大的杂质,。,。再选择,较,较高速度,离,离心1-2h使病,毒,毒沉淀。,速度梯度离心法,密度梯度离心法,原理,沉降与颗粒质量成正比，以物质沉降速度的不同进行分离,沉降与颗粒密度成正比，以

9、物质浮密度的不同进行分离,介质,密度小，1-1.3286，预制梯度，不连续,密度大，1-1.9025，连续梯度,离心力场,强，离心速度高，使被分离物质易沉降,稍强，速度相对低，使CsCl形成梯度，建立沉降扩散平衡,离心过程,样品向离心管底沉降,样品停留于介质的等密度部位,离心时间,较短，几小时到几十小时,较长，十几小时到数天,2.速,度,度梯度离,心,心法与密,度,度梯度离,心,心法,速度梯度,离,离心,密度梯度,离,离心,A,B,五、病毒,纯,纯化应注,意,意的问题,1、保持,病,病毒的感,染,染性,严格控制,温,温度、pH及试剂,的,的选择。,2、选用,适,适宜的纯,化,化实验起,始,始材

10、料,无其它病,毒,毒或毒株,的,的污染,病毒体的,含,含量高,杂质含量,少,少并易于,处,处理,3、根据,具,具体情况,选,选择提纯,方,方法,根据需要,纯,纯化的病,毒,毒的性质,、,、起始材,料,料的特点,、,、研究的,目,目的以及,实,实验室的,条,条件等，,选,选择适宜,的,的纯化方,法,法。,4、建立,灵,灵敏的病,毒,毒鉴定和,测,测定方法,六、伪狂,犬,犬病毒的,浓,浓缩提纯,1、病毒,材,材料,将伪狂犬,病,病病毒接,种,种于PK-15细,胞,胞，病变,后,后收集细,胞,胞培养物,，,，反复冻,融,融3次，,即,即为样品,材,材料。,2病毒,提,提纯浓缩,去细胞碎,片,片及杂质

11、,：,：将细胞培,养,养物43000r/min离心30min，收集,上,上清液。,硫酸铵沉,淀,淀：按100ml病毒,液,液42.5g硫酸,铵,铵的量加,入,入硫酸铵,，,，搅匀后,置,置4冰,箱,箱搅拌沉,淀,淀过夜，4 5000r/min,离,离心40min，,去,去上清，,沉,沉淀用适,量,量的灭菌ddH,2,O悬浮。,透析：将悬浮的,病,病毒液装,于,于透析袋,中,中，于ddH,2,O或PBS中搅拌,透,透析，每,半,半个小时,换,换一次液,，,，共换5,次,次，第5,次,次透析过,夜,夜。,浓缩：透析完成,后,后，取出,，,，用聚乙,二,二醇或蔗,糖,糖将病毒,浓,浓缩至合,适,适的

12、体积,。,。,超离纯化,：,：,在离心管,中,中加入不,同,同浓度的,甘,甘油垫层,，,，即先加,入,入45%,甘,甘油，再,加,加入5%,甘,甘油。,加入病毒,悬,悬液（应,不,不超过离,心,心管总容,积,积的10%）。,20000-25000r/min,离,离心2h,。,。,弃上层液,体,体，沉淀,用,用适量TEN重悬,（,（涡旋或,超,超声波处,理,理，使沉,淀,淀分散）,。,。,速度区带,离,离心,密度梯度,离,离心,在离心管,中,中加入不,同,同浓度的CsCl,或,或蔗糖垫,层,层，再加,入,入病毒悬,液,液，超高,速,速离心。,蔗糖密度,梯,梯度离心：在离心,管,管中加入20%60

13、%不,连,连续蔗糖,密,密度梯度,20000-25000r/min离心2h3h，收,集,集蔗糖浓,度,度为35%处的病,毒,毒带，加,入,入适量缓,冲,冲液稀释,后,后，再次20000-25000r/min,离,离心2h,，,，沉淀用,适,适量TEN重悬。,P,rV,鄂,A,株电镜观,察,察,左图：上,带,带中的P,rV,粒子,右图：下,带,带中的P,rV,粒子,浓缩（方,法,法二）,将经低速,离,离心去掉,细,细胞碎片,及,及杂质的,病,病毒悬液,直,直接20000-25000r/min离心2h。,弃上层液,体,体，沉淀,用,用适量TEN重悬,。,。,将重悬的,病,病毒液再,经,经梯度离,心

14、,心纯化。,如何利用,纯,纯化的病,毒,毒进行下,一,一步的研,究,究,研究病毒,的,的结构,研究病毒,感,感染的分,子,子细节,病毒粒子,的,的标记,研究与受,体,体的结合,研究病毒,的,的侵入,研究病毒,在,在体内的,移,移行,病毒纯化,质谱分析,靶蛋白验,证,证,纯化的病,毒,毒是不是,只,只含有病,毒,毒的蛋白,？,？,PRV如,何,何侵入细,胞,胞,免疫金标,记,记,确定病毒,的,的细胞受,体,体,解析病毒,侵,侵入细胞,的,的分子细,节,节,是当前病,毒,毒感染研,究,究的重点,Internalizationof IHNVparticles through clathrin-mediatedendocytosis,利用量子,点,点(quantum dots)标,记,记研究病,毒,毒的侵入,谢谢观看,/,欢迎下载,BY FAITHI MEANA VISIONOFGOODONECHERISHES AND THE ENTHUSIASM THAT PUSHES ONE TOSEEK ITS FULFILLMENT REGARDLESSOFOBSTACLES.BY FAITHI BYFAITH,