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1、单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第六章 病毒的纯化,利用各种物理、化学方法，以,不使病毒受损伤和失活为前提,，去除宿主细胞组分等非病毒杂质，提取出高纯度浓缩的病毒样品。,病毒微细结构的研究,病毒抗原蛋白的分离纯化,病毒化学成分及其遗传物质的研究,病毒感染的分子细节的研究,一、病毒纯化的标准,保持感染性,具有均一性：,结晶形成,检测病毒制备物均一性的方法：,电镜观察：,大小、形态均一,超速离心：,沉降速率和密度一致，只出现一条沉降带,电泳：,颗粒大小及表面电荷均一，只形成一条电泳带,免疫学方法：,只与特异性抗体发生反应,大小、形态、密度、化
2、学组成、分子量、抗原性,二、病毒纯化的理论依据,病毒体外表面的主要化学组成是蛋白质，可利用蛋白质提纯的方法纯化病毒,病毒体具有一定大小、形状和密度，可利用超速离心技术提纯病毒,三、病毒纯化前的预处理,1、病毒感染的组织、脏器或细胞,研磨匀浆,超声波处理,反复冻融,低速离心去掉细胞碎片,2、细胞培养液、鸡胚尿囊液,低速离心去掉可能含有的杂质或直接用于病毒的分离纯化,沉淀法,超速离心法,超滤法,层析法,两相溶剂间分配系数法,吸附法,电泳法,四、病毒纯化的方法,（一）沉淀法,主要从稀的病毒悬浮液中浓缩病毒。,中性盐沉淀法（盐析）,聚乙二醇沉淀法,有机溶剂沉淀法,等电点沉淀法,皂土法,鱼精蛋白沉淀法,
3、1、中性盐沉淀法（盐析）,先用其它方法去除材料中的大量杂质，再以高浓度的中性盐溶液盐析，析出的沉淀用缓冲液悬浮后再进行盐析，反复几次后，悬浮沉淀，用透析法或其它方法脱盐。,病毒一般在45%以上饱和度的硫酸铵溶液中沉淀，且保持感染性。,2、聚乙二醇（PEG）沉淀法,用于病毒沉淀的分子量：2000-6000,将PEG配成50%左右的溶液，或直接将固体PEG加于病毒悬液中，使其达到所需浓度，在4搅拌过夜，然后离心使病毒沉淀。,3、有机溶剂沉淀法,乙醚、甲醇、氯仿、正丁醇、氟碳化合物,原理：,A、降低溶液的介电常数，从而增加病毒颗粒表面不同电荷之间的引力，导致其溶解度降低。,B、与水作用，破坏蛋白质分
4、子的水化膜。,优点：,分辨力高，易除去,缺点：,易使表面蛋白质变性，溶解脂质,4、等电点沉淀法（分辨力不高）,原理：,病毒粒子在等电点时，所携带的正电荷与负电荷相互中和，因而失去相互排斥的作用而发生沉淀（分辨力不高）。,多数病毒的等电点在pH4.,5.5之间。,5,、,、,皂,皂,土,土,法,法,轮,状,状,病,病,毒,毒,皂,土,土,在,在,酸,酸,性,性,条,条,件,件,下,下,（,（pH4,4.5),可,可,吸,吸,附,附,轮,轮,状,状,病,病,毒,毒,，,，,在,在,碱,碱,性,性,条,条,件,件,下,下(pH8.5),，,，,又,又,使,使,其,其,洗,洗,脱,脱,下,下,来,来,
5、。,。,6,、,、,鱼,鱼,精,精,蛋,蛋,白,白,沉,沉,淀,淀,法,法,（,（,沉,沉,淀,淀,直,直,径,径,大,大,于,于50nm,的,的,病,病,毒,毒,）,）,鱼,精,精,蛋,蛋,白,白,为,为,碱,碱,性,性,蛋,蛋,白,白,，,，,具,具,有,有,携,携,带,带,其,其,它,它,蛋,蛋,白,白,质,质,（,（,直,直,径,径,大,大,于,于50nm,）,）,共,共,沉,沉,淀,淀,的,的,作,作,用,用,，,，,当,当,向,向,这,这,种,种,沉,沉,淀,淀,物,物,加,加,入,入1mol/LNaCl,时,时,，,，,其,其,它,它,蛋,蛋,白,白,质,质,又,又,重,重,新,
6、新,释,释,放,放,到,到,悬,悬,液,液,中,中,，,，,而,而,鱼,鱼,精,精,蛋,蛋,白,白,仍,仍,然,然,沉,沉,淀,淀,。,。,（,二,二,）,）,层,层,析,析,法,法,葡,聚,聚,糖,糖,柱,柱,层,层,析,析,法,法,凝,胶,胶,层,层,析,析,法,法,离,子,子,交,交,换,换,柱,柱,层,层,析,析,法,法,亲,和,和,层,层,析,析,法,法,（,三,三,）,）,两,两,相,相,溶,溶,剂,剂,间,间,分,分,配,配,系,系,数,数,法,法,原,理,理,：,：溶,质,质,在,在,两,两,个,个,互,互,不,不,相,相,溶,溶,的,的,溶,溶,剂,剂,中,中,分,分,配,配
7、,系,系,数,数,的,的,不,不,同,同,而,而,选,选,择,择,性,性,地,地,分,分,配,配,于,于,其,其,中,中,的,的,一,一,方,方,。,。,常,用,用,的,的,溶,溶,剂,剂,：,：葡,聚,聚,糖,糖,硫,硫,酸,酸,盐,盐,（,（dextransulphate,Ds),聚,乙,乙,二,二,醇,醇,（,（PEG,）,）,甲,基,基,纤,纤,维,维,素,素,（,（MC,）,）,聚,乙,乙,烯,烯,醇,醇,（,（PVA,）,）,分,配,配,体,体,系,系,：,：Ds-PEG,系,系,、,、Ds-PVA,系,系,、,、Ds-MC,系,系,（,四,四,）,）,吸,吸,附,附,法,法,原,
8、理,理,：,：利,用,用,对,对,病,病,毒,毒,或,或,对,对,杂,杂,质,质,有,有,选,选,择,择,吸,吸,附,附,能,能,力,力,的,的,固,固,体,体,吸,吸,附,附,剂,剂,吸,吸,附,附,病,病,毒,毒,或,或,吸,吸,附,附,杂,杂,质,质,，,，,再,再,用,用,一,一,定,定,的,的,盐,盐,溶,溶,液,液,把,把,它,它,们,们,洗,洗,脱,脱,下,下,来,来,。,。,作,为,为,吸,吸,附,附,剂,剂,必,必,须,须,具,具,备,备,的,的,特,特,点,点,：,：,有较,大,大的,表,表面,积,积和,吸,吸附,能,能力,较高,的,的吸,附,附选,择,择性,便于,洗,洗脱
9、,性质,稳,稳定,常用,吸,吸附,剂,剂：,白土,磷酸,钙,钙,硅藻,土,土,红细,胞,胞,离子,交,交换,树,树脂,羧甲,基,基纤,维,维素,（六,）,）超,滤,滤法,利用,超,超滤,膜,膜将,水,水、,盐,盐及,小,小分,子,子滤,过,过，,将,将一,定,定大,小,小的,大,大分,子,子或,病,病毒,等,等颗,粒,粒截,住,住从,而,而使,后,后者,得,得到,浓,浓缩,。,。,优点,：,：,可用,于,于大,容,容量,样,样品,的,的浓,缩,缩,可以,在,在室,温,温或,低,低温,下,下操,作,作,对被,浓,浓缩,产,产物,的,的损,害,害小,浓缩,的,的同,时,时可,达,达到,部,部分,纯
10、,纯化,回收,率,率高,可防,止,止外,来,来污,染,染,（五,）,）电,泳,泳法,（七,）,）离,心,心法,差速,离,离心,速度,区,区带,离,离心,法,法,密度,梯,梯度,离,离心,1.,差,差速,离,离心,法,法,原理,：,：不同,大,大小,和,和比,重,重的,粒,粒子,沉,沉降,速,速度,不,不同,。,。,用途,：,：从组,织,织培,养,养液,、,、鸡,胚,胚尿,囊,囊液,或,或经,过,过红,细,细胞,吸,吸附,释,释放,的,的病,毒,毒悬,液,液中,提,提纯,病,病毒,。,。,优点,：,：可快,速,速处,理,理大,量,量样,品,品,步骤,：,：低速,（,（2000-3000r/min
11、,20-30min),、,、中,速,速（10000min,20-30min)去,除,除较,大,大的,宿,宿主,细,细胞,碎,碎片,、,、污,染,染的,细,细菌,及,及其,它,它较,大,大的,杂,杂质,。,。再,选,选择,较,较高,速,速度,离,离心1-2h,使,使病,毒,毒沉,淀,淀。,速度梯度离心法,密度梯度离心法,原理,沉降与颗粒质量成正比，以物质沉降速度的不同进行分离,沉降与颗粒密度成正比，以物质浮密度的不同进行分离,介质,密度小，1-1.3286，预制梯度，不连续,密度大，1-1.9025，连续梯度,离心力场,强，离心速度高，使被分离物质易沉降,稍强，速度相对低，使CsCl形成梯度，建
12、立沉降扩散平衡,离心过程,样品向离心管底沉降,样品停留于介质的等密度部位,离心时间,较短，几小时到几十小时,较长，十几小时到数天,2.,速,速,度,度梯,度,度离,心,心法,与,与密,度,度梯,度,度离,心,心法,速度,梯,梯度,离,离心,密度,梯,梯度,离,离心,A,B,五、,病,病毒,纯,纯化,应,应注,意,意的,问,问题,1、,保,保持,病,病毒,的,的感,染,染性,严格,控,控制,温,温度,、,、pH及,试,试剂,的,的选,择,择。,2、,选,选用,适,适宜,的,的纯,化,化实,验,验起,始,始材,料,料,无其,它,它病,毒,毒或,毒,毒株,的,的污,染,染,病毒,体,体的,含,含量,
13、高,高,杂质,含,含量,少,少并,易,易于,处,处理,3、,根,根据,具,具体,情,情况,选,选择,提,提纯,方,方法,根据,需,需要,纯,纯化,的,的病,毒,毒的,性,性质,、,、起,始,始材,料,料的,特,特点,、,、研,究,究的,目,目的,以,以及,实,实验,室,室的,条,条件,等,等，,选,选择,适,适宜,的,的纯,化,化方,法,法。,4、,建,建立,灵,灵敏,的,的病,毒,毒鉴,定,定和,测,测定,方,方法,六、,伪,伪狂,犬,犬病,毒,毒的,浓,浓缩,提,提纯,1、,病,病毒,材,材料,将伪,狂,狂犬,病,病病,毒,毒接,种,种于PK-15细,胞,胞，,病,病变,后,后收,集,集细
14、,胞,胞培,养,养物,，,，反,复,复冻,融,融3,次,次，,即,即为,样,样品,材,材料,。,。,2,病,病毒,提,提纯,浓,浓缩,去细,胞,胞碎,片,片及,杂,杂质,：,：将细,胞,胞培,养,养物43000r/min,离,离心30min，,收,收集,上,上清,液,液。,硫酸,铵,铵沉,淀,淀：按100ml,病,病毒,液,液42.5g,硫,硫酸,铵,铵的,量,量加,入,入硫,酸,酸铵,，,，搅,匀,匀后,置,置4,冰,箱,箱搅,拌,拌沉,淀,淀过,夜,夜，45000r/min,离,离心40min，,去,去上,清,清，,沉,沉淀,用,用适,量,量的,灭,灭菌ddH,2,O悬,浮,浮。,透析,：
15、,：将悬,浮,浮的,病,病毒,液,液装,于,于透,析,析袋,中,中，,于,于ddH,2,O或PBS中,搅,搅拌,透,透析,，,，每,半,半个,小,小时,换,换一,次,次液,，,，共,换,换5,次,次，,第,第5,次,次透,析,析过,夜,夜。,浓缩,：,：透析,完,完成,后,后，,取,取出,，,，用,聚,聚乙,二,二醇,或,或蔗,糖,糖将,病,病毒,浓,浓缩,至,至合,适,适的,体,体积,。,。,超离,纯,纯化,：,：,在离,心,心管,中,中加,入,入不,同,同浓,度,度的,甘,甘油,垫,垫层,，,，即,先,先加,入,入45%,甘,甘油,，,，再,加,加入5%,甘,甘油,。,。,加入,病,病毒,
16、悬,悬液,（,（应,不,不超,过,过离,心,心管,总,总容,积,积的10%）,。,。,20000-25000r/min,离,离心2h,。,。,弃上,层,层液,体,体，,沉,沉淀,用,用适,量,量TEN,重,重悬,（,（涡,旋,旋或,超,超声,波,波处,理,理，,使,使沉,淀,淀分,散,散）,。,。,速度,区,区带,离,离心,密度,梯,梯度,离,离心,在离,心,心管,中,中加,入,入不,同,同浓,度,度的CsCl,或,或蔗,糖,糖垫,层,层，,再,再加,入,入病,毒,毒悬,液,液，,超,超高,速,速离,心,心。,蔗糖,密,密度,梯,梯度,离,离心：在,离,离心,管,管中,加,加入20%60%不,连,连续,蔗,蔗糖,密,密度,梯,梯度,20000-25000r/min,离,离心2h,3h,，,，收,集,集蔗,糖,糖浓,度,度为35%处,的,的病,毒,毒带,，,，加,入,入适,量,量缓,冲,冲液,稀,稀释,后,后，,再,再次20000-25000r/min,离,离心2h,，,，沉,淀,淀用,适,适量TEN重,悬,悬。,P,rV,鄂,A,株电,镜,镜观,察,察,左图,：,：上,带,带中,的,的
华中农业大学病毒学实验技术第六章病毒纯化XXXX
