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1、单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第六章,病,病毒的纯,化,化,利用各种物,理,理、化学方,法,法，以不使病毒受,损,损伤和失活,为,为前提，去除宿主,细,细胞组分等,非,非病毒杂质,，,，提取出高,纯,纯度浓缩的,病,病毒样品。,病毒微细结,构,构的研究,病毒抗原蛋,白,白的分离纯,化,化,病毒化学成,分,分及其遗传,物,物质的研究,病毒感染的,分,分子细节的,研,研究,一、病毒纯,化,化的标准,保持感染性,具有均一性,：,：,结晶形成,检测病毒制,备,备物均一性,的,的方法：,电镜观察：,大小、形态,均,均一,超速离心：,沉降速率和,密
2、,密度一致，,只,只出现一条,沉,沉降带,电泳：,颗粒大小及,表,表面电荷均,一,一，只形成,一,一条电泳带,免疫学方法,：,：,只与特异性,抗,抗体发生反,应,应,大小、形态,、,、密度、化,学,学组成、分,子,子量、抗原,性,性,二、病毒纯,化,化的理论依,据,据,病毒体外表,面,面的主要化,学,学组成是蛋,白,白质，可利,用,用蛋白质提,纯,纯的方法纯,化,化病毒,病毒体具有,一,一定大小、,形,形状和密度,，,，可利用超,速,速离心技术,提,提纯病毒,三、病毒纯,化,化前的预处,理,理,1、病毒感,染,染的组织、,脏,脏器或细胞,研磨匀浆,超声波处理,反复冻融,低速离心去,掉,掉细胞碎
3、片,2、细胞培,养,养液、鸡胚,尿,尿囊液,低速离心去,掉,掉可能含有,的,的杂质或直,接,接用于病毒,的,的分离纯化,沉淀法,超速离心法,超滤法,层析法,两相溶剂间,分,分配系数法,吸附法,电泳法,四、病毒纯,化,化的方法,（一）沉淀,法,法,主要从稀的,病,病毒悬浮液,中,中浓缩病毒,。,。,中性盐沉淀,法,法（盐析）,聚乙二醇沉,淀,淀法,有机溶剂沉,淀,淀法,等电点沉淀,法,法,皂土法,鱼精蛋白沉,淀,淀法,1、中性盐,沉,沉淀法（盐,析,析）,先用其它方,法,法去除材料,中,中的大量杂,质,质，再以高,浓,浓度的中性,盐,盐溶液盐析,，,，析出的沉,淀,淀用缓冲液,悬,悬浮后再进,行
4、,行盐析，反,复,复几次后，,悬,悬浮沉淀，,用,用透析法或,其,其它方法脱,盐,盐。,病毒一般在45%以上,饱,饱和度的硫,酸,酸铵溶液中,沉,沉淀，且保,持,持感染性。,2、聚乙二,醇,醇（PEG,）,）沉淀法,用于病毒沉,淀,淀的分子量,：,：2000-6000,将PEG配,成,成50%左,右,右的溶液，,或,或直接将固,体,体PEG加,于,于病毒悬液,中,中，使其达,到,到所需浓度,，,，在4搅,拌,拌过夜，然,后,后离心使病,毒,毒沉淀。,3、有机溶,剂,剂沉淀法,乙醚、甲醇,、,、氯仿、正,丁,丁醇、氟碳,化,化合物,原理：A、降低溶,液,液的介电常,数,数，从而增,加,加病毒颗粒
5、,表,表面不同电,荷,荷之间的引,力,力，导致其,溶,溶解度降低,。,。,B、与水作,用,用，破坏蛋,白,白质分子的,水,水化膜。,优点：分辨力高，,易,易除去,缺点：易使表面蛋,白,白质变性，,溶,溶解脂质,4、等电点,沉,沉淀法（分,辨,辨力不高）,原理：病毒粒子,在,在等电点,时,时，所携,带,带的正电,荷,荷与负电,荷,荷相互中,和,和，因而,失,失去相互,排,排斥的作,用,用而发生,沉,沉淀（分,辨,辨力不高,）,）。,多数病毒,的,的等电点,在,在pH4.,5.5之,间,间。,5、皂土,法,法,轮状病毒,皂土在酸,性,性条件下,（,（pH4,4.5),可,可吸附轮,状,状病毒，,在
6、,在碱性条,件,件下(pH8.5)，又使,其,其洗脱下,来,来。,6、鱼精,蛋,蛋白沉淀,法,法（沉淀,直,直径大于50nm,的,的病毒）,鱼精蛋白,为,为碱性蛋,白,白，具有,携,携带其它,蛋,蛋白质（,直,直径大于50nm,）,）共沉,淀,淀的作用,，,，当向这,种,种沉淀物,加,加入1mol/LNaCl时，其,它,它蛋白质,又,又重新释,放,放到悬液,中,中，而鱼,精,精蛋白仍,然,然沉淀。,（二）层,析,析法,葡聚糖柱,层,层析法,凝胶层析,法,法,离子交换,柱,柱层析法,亲和层析,法,法,（三）两,相,相溶剂间,分,分配系数,法,法,原理：溶质在两,个,个互不相,溶,溶的溶剂,中,中
7、分配系,数,数的不同,而,而选择性,地,地分配于,其,其中的一,方,方。,常用的溶,剂,剂：葡聚糖硫,酸,酸盐（dextran sulphate,Ds),聚乙二醇,（,（PEG,）,）,甲基纤维,素,素（MC,）,）,聚乙烯醇,（,（PVA,）,）,分配体系,：,：Ds-PEG系、Ds-PVA系、Ds-MC系,（四）吸,附,附法,原理：利用对病,毒,毒或对杂,质,质有选择,吸,吸附能力,的,的固体吸,附,附剂吸附,病,病毒或吸,附,附杂质，,再,再用一定,的,的盐溶液,把,把它们洗,脱,脱下来。,作为吸附,剂,剂必须具,备,备的特点,：,：,有较大的,表,表面积和,吸,吸附能力,较高的吸,附,
8、附选择性,便于洗脱,性质稳定,常用吸附,剂,剂：,白土,磷酸钙,硅藻土,红细胞,离子交换,树,树脂,羧甲基纤,维,维素,（六）超,滤,滤法,利用超滤,膜,膜将水、,盐,盐及小分,子,子滤过，,将,将一定大,小,小的大分,子,子或病毒,等,等颗粒截,住,住从而使,后,后者得到,浓,浓缩。,优点：,可用于大,容,容量样品,的,的浓缩,可以在室,温,温或低温,下,下操作,对被浓缩,产,产物的损,害,害小,浓缩的同,时,时可达到,部,部分纯化,回收率高,可防止外,来,来污染,（五）电,泳,泳法,（七）离,心,心法,差速离心,速度区带,离,离心法,密度梯度,离,离心,1.差速,离,离心法,原理：不同大小
9、,和,和比重的,粒,粒子沉降,速,速度不同,。,。,用途：从组织培,养,养液、鸡,胚,胚尿囊液,或,或经过红,细,细胞吸附,释,释放的病,毒,毒悬液中,提,提纯病毒,。,。,优点：可快速处,理,理大量样,品,品,步骤：低速（2000-3000r/min,20-30min),、,、中速（10000min,20-30min)去,除,除较大的,宿,宿主细胞,碎,碎片、污,染,染的细菌,及,及其它较,大,大的杂质,。,。再选择,较,较高速度,离,离心1-2h使病,毒,毒沉淀。,速度梯度离心法,密度梯度离心法,原理,沉降与颗粒质量成正比，以物质沉降速度的不同进行分离,沉降与颗粒密度成正比，以物质浮密度的
10、不同进行分离,介质,密度小，1-1.3286，预制梯度，不连续,密度大，1-1.9025，连续梯度,离心力场,强，离心速度高，使被分离物质易沉降,稍强，速度相对低，使CsCl形成梯度，建立沉降扩散平衡,离心过程,样品向离心管底沉降,样品停留于介质的等密度部位,离心时间,较短，几小时到几十小时,较长，十几小时到数天,2.速,度,度梯度离,心,心法与密,度,度梯度离,心,心法,速度梯度,离,离心,密度梯度,离,离心,A,B,五、病毒,纯,纯化应注,意,意的问题,1、保持,病,病毒的感,染,染性,严格控制,温,温度、pH及试剂,的,的选择。,2、选用,适,适宜的纯,化,化实验起,始,始材料,无其它病
11、,毒,毒或毒株,的,的污染,病毒体的,含,含量高,杂质含量,少,少并易于,处,处理,3、根据,具,具体情况,选,选择提纯,方,方法,根据需要,纯,纯化的病,毒,毒的性质,、,、起始材,料,料的特点,、,、研究的,目,目的以及,实,实验室的,条,条件等，,选,选择适宜,的,的纯化方,法,法。,4、建立,灵,灵敏的病,毒,毒鉴定和,测,测定方法,六、伪狂,犬,犬病毒的,浓,浓缩提纯,1、病毒,材,材料,将伪狂犬,病,病病毒接,种,种于PK-15细,胞,胞，病变,后,后收集细,胞,胞培养物,，,，反复冻,融,融3次，,即,即为样品,材,材料。,2病毒,提,提纯浓缩,去细胞碎,片,片及杂质,：,：将细
12、胞培,养,养物43000r/min离心30min，收集,上,上清液。,硫酸铵沉,淀,淀：按100ml病毒,液,液42.5g硫酸,铵,铵的量加,入,入硫酸铵,，,，搅匀后,置,置4冰,箱,箱搅拌沉,淀,淀过夜，4 5000r/min,离,离心40min，,去,去上清，,沉,沉淀用适,量,量的灭菌ddH,2,O悬浮。,透析：将悬浮的,病,病毒液装,于,于透析袋,中,中，于ddH,2,O或PBS中搅拌,透,透析，每,半,半个小时,换,换一次液,，,，共换5,次,次，第5,次,次透析过,夜,夜。,浓缩：透析完成,后,后，取出,，,，用聚乙,二,二醇或蔗,糖,糖将病毒,浓,浓缩至合,适,适的体积,。,。
13、,超,离,离,纯,纯,化,化,：,：,在,离,离,心,心,管,管,中,中,加,加,入,入,不,不,同,同,浓,浓,度,度,的,的,甘,甘,油,油,垫,垫,层,层,，,，,即,即,先,先,加,加,入,入45%,甘,甘,油,油,，,，,再,再,加,加,入,入5%,甘,甘,油,油,。,。,加,入,入,病,病,毒,毒,悬,悬,液,液,（,（,应,应,不,不,超,超,过,过,离,离,心,心,管,管,总,总,容,容,积,积,的,的10%,）,）,。,。,20000-25000r/min,离,离,心,心2h,。,。,弃,上,上,层,层,液,液,体,体,，,，,沉,沉,淀,淀,用,用,适,适,量,量TEN,重
14、,重,悬,悬,（,（,涡,涡,旋,旋,或,或,超,超,声,声,波,波,处,处,理,理,，,，,使,使,沉,沉,淀,淀,分,分,散,散,）,）,。,。,速,度,度,区,区,带,带,离,离,心,心,密,度,度,梯,梯,度,度,离,离,心,心,在,离,离,心,心,管,管,中,中,加,加,入,入,不,不,同,同,浓,浓,度,度,的,的CsCl,或,或,蔗,蔗,糖,糖,垫,垫,层,层,，,，,再,再,加,加,入,入,病,病,毒,毒,悬,悬,液,液,，,，,超,超,高,高,速,速,离,离,心,心,。,。,蔗,糖,糖,密,密,度,度,梯,梯,度,度,离,离,心,心：,在,在,离,离,心,心,管,管,中,中,
15、加,加,入,入20%,60%,不,不,连,连,续,续,蔗,蔗,糖,糖,密,密,度,度,梯,梯,度,度,20000-25000r/min,离,离,心,心2h,3h,，,，,收,收,集,集,蔗,蔗,糖,糖,浓,浓,度,度,为,为35%,处,处,的,的,病,病,毒,毒,带,带,，,，,加,加,入,入,适,适,量,量,缓,缓,冲,冲,液,液,稀,稀,释,释,后,后,，,，,再,再,次,次20000-25000r/min,离,离,心,心2h,，,，,沉,沉,淀,淀,用,用,适,适,量,量TEN,重,重,悬,悬,。,。,P,rV,鄂,A,株,电,电,镜,镜,观,观,察,察,左,图,图,：,：,上,上,带,
16、带,中,中,的,的P,rV,粒,子,子,右,图,图,：,：,下,下,带,带,中,中,的,的P,rV,粒,子,子,浓,缩,缩,（,（,方,方,法,法,二,二,）,）,将,经,经,低,低,速,速,离,离,心,心,去,去,掉,掉,细,细,胞,胞,碎,碎,片,片,及,及,杂,杂,质,质,的,的,病,病,毒,毒,悬,悬,液,液,直,直,接,接20000-25000r/min,离,离,心,心2h,。,。,弃,上,上,层,层,液,液,体,体,，,，,沉,沉,淀,淀,用,用,适,适,量,量TEN,重,重,悬,悬,。,。,将,重,重,悬,悬,的,的,病,病,毒,毒,液,液,再,再,经,经,梯,梯,度,度,离,离,心,心,纯,纯,化,化,。,。,如,何,何,利,利,用,用,纯,纯,化,化,的,的,病,病,毒,毒,进,进,行,行,下,下,一,一,步,步,的,的,研,研,究,究,研究病毒的,结,结构,研究病毒感,染,染的分子细,节,节,病毒粒子的,标,标记,研究与受体,的,的结合,研究病毒的,侵,侵入,研究病毒在,体,体内的移行,病毒纯化,质谱分析,靶蛋白验证,纯化的病毒,是,是不是只含,有,有病毒的蛋,白,
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