医学生物分子的分离纯化PPT课件

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1、第七章生物分子的分离纯化 生 物 大 分 子 （ 蛋 白 质 、 核 酸 、 糖 复 合 物 等 ）生 物 分 子 （ Biomolecule） 泛 指 生 物 体 特 有 的 各 类 分 子 ， 是 自 然 存 在于 生 物 体 中 的 分 子 的 总 称 ， 是 组 成 生 命 的 基 本 单 位 。包 括 小 分 子 （ 如 脂 类 、 激 素 、 维 生 素 等 ） 5） 能 人 工 合 成 与 改 造 。生 物 分 子 是 生 物 所 特 有 的 有 机 化 合 物 ，具 有 如 下 主 要 特 征 ：1） 结 构 复 杂 有 序 、 具 有 特 殊 的 层 次 ；2） 行 使 专

2、一 的 功 能 ；3） 代 谢 是 其 存 在 的 条 件 ；4） 生 物 分 子 体 系 具 有 自 我 复 制 的 能 力 ； 一 、 生 物 大 分 子 的 制 备 生 物 大 分 子 指 的 是 作 为 生 物 体 内 主 要 活 性 成 分 的 各种 分 子 量 达 到 上 万 或 更 多 的 有 机 分 子 。 常 见 的 生 物 大分 子 包 括 蛋 白 质 、 核 酸 、 脂 类 、 糖 类 。 （ 1） 分 离 纯 化 方 法 千 差 万 别 ， 没 有 一 种 标 准 方 法 可 通 用 于 各 种生 物 大 分 子 的 分 离 制 备 ；（ 2） 制 备 几 乎 都 是

3、在 溶 液 中 进 行 的 ， 难 以 准 确 估 计 和 判 断 pH值 、温 度 度 等 各 种 参 数 对 溶 液 中 各 种 组 份 的 综 合 影 响 生 物 大 分 子 的 制 备 有 以 下 主 要 特 点 ： （ 3） 大 多 数 生 物 大 分 子 的 含 量 极 微 ， 分 离 纯 化 的 步 骤 多 ， 流 程 长 ，有 的 目 的 产 物 甚 至 要 经 过 几 十 步 的 操 作 才 能 达 到 所 需 纯 度 ；（ 4） 分 离 纯 化 过 程 中 要 保 证 目 标 产 物 的 活 性 。 生 物 大 分 子 制 备 的 一 般 步 骤 ： 确定制备的目的和要求文

4、献调研和预备性实验建立相应的可靠的分析测定方法材料的破碎和预处理分离纯化方案的选择和探索 产物纯度的鉴定产物的浓缩，干燥和保存。 科 研 、 开 发 或发 现 新 的 物 质制 备 的 关 键 要 求 达 到 一 维 电 泳 一 条 带 ，二 维 电 泳 一 个 点 ， 或 HPLC和 毛 细 管 电 泳 都 是 一 个 峰最 困 难 的 过程掌 握 目 的 产 物的 理 化 性 质特异性强准确度高灵敏度高使用快捷方便 制 备 生 物 大 分 子 的 分 离 纯 化 方 法 多 种 多 样 ， 主 要 是 利 用 它们 之 间 理 化 性 质 的 差 异 。根 据 作 用 原 理 生 物 分

5、子 的 分 离 、 纯 化 可 分 为 以 下 几 种 类 型 ：（ 1） 根 据 分 子 极 性 大 小 和 溶 解 度 的 不 同 ， 如 溶 剂 提 取 技 术 、盐 析 法 、 分 配 层 析 法 、 分 级 沉 淀 法 等 ；（ 2） 根 据 分 子 形 状 和 大 小 不 同 ， 如 凝 胶 过 滤 层 析 等 ；（ 3） 根 据 物 质 吸 附 性 质 不 同 ， 如 选 择 性 吸 附 与 吸 附 层 析 法 等 ；（ 4） 根 据 分 子 带 电 性 （ 电 离 性 质 ） 的 差 异 ， 如 离 子 交 换 层 析 、电 泳 、 等 电 聚 焦 法 等 。（ 5） 根 据

6、配 体 特 异 性 ， 如 亲 和 层 析 。 破 碎 方 法 应 用机 械 法 研 磨 法 细 菌 、 酵 母匀 浆 法 机 体 软 组 织捣 碎 法 动 物 韧 性 组 织化 学 法 酶 解 法 细 菌 、 酵 母去 垢 剂 组 织 、 细 胞有 机 溶 剂 细 菌 、 酵 母物 理 法 反 复 冻 融 法 细 胞超 声 波 法 细 胞 悬 液低 渗 裂 解 法 红 细 胞冷 热 交 替 法 细 菌 、 病 毒常 用 破 碎 方 法 影 响 提 取 效 果 的 因 素（ 1） pH值 （ 2） 盐 浓 度 （ 即 离 子 强 度 ） （ 3） 温 度 （ 4） 水 解 酶 （ 5） 搅 拌

7、 与 氧 化 （ 6） 有 机 溶 剂 生 物 大 分 子 的 分 离 纯 化 （1 ）盐析法 （ 2） 有 机 溶 剂 沉 淀 法 (3) 透 析 (dialysis) 利 用 透 析 袋 把 大分 子 蛋 白 质 与 小分 子 化 合 物 分 开的 方 法 。 含蛋白溶液透析袋 透析液磁子 电磁搅拌器 二 、 核 酸 的 分 离 纯 化 核 酸 （ nucleic acid） 是 遗 传 信 息 的 携 带 者 ， 是 基 因 表 达 的 物质 基 础 (包 括 DNA与 RNA)。 无 论 是 进 行 核 酸 结 构 还 是 功 能 研 究 ， 首 先 需 要 对 核 酸 进 行 分 离

8、和 纯 化 。 核 酸 样 品 质 量 将 直 接 关 系 到 实 验 的 成 败 。 DNA与 RNA理 化 性 质 及 细 胞 定 位 上 的 差 异 决 定 了 两 者 的 最 适 分 离与 纯 化 条 件 的 不 同 分 离 纯 化 的 原 则 一 是 保 持 核 酸 碱 基 序 列 的 完 整 性 。 二 是 尽 量 清 除 其 它 分 子 的 污染 ， 保 证 核 酸 制 品 的 纯 度 。 意 义 ： 遗 传 信 息 全 部 储 存 在 一 级 结 构 之 中 ， 核 酸 的 一 级 结 构还 决 定 其 高 级 结 构 的 形 式 以 及 和 其 他 生 物 大 分 子 结 合

9、 的 方 式 。 对 于 核 酸 的 纯 化 应 达 到 以 下 三 点 要 求 ： 1） 核 酸 样 品 中 不 存 在 过 高 浓 度 的 金 属 离 子 和 对 酶 有 抑 制 作 用 的 有机 溶 剂 ； 2） 其 它 生 物 大 分 子 如 蛋 白 质 、 脂 类 和 多 糖 分 子 的 污 染 应 降 至 最 低程 度 ； 3） 排 除 其 它 核 酸 分 子 的 污 染 ， 如 提 取 DNA分 子 时 应 去 除 RNA， 提 取RNA分 子 时 应 去 除 DNA。 保 持 核 酸 的 完 整 性 在 整 个 操 作 过 程 中 应 尽 量 避 免 各 种 有 害 因 素 对

10、 核 酸 的 破 坏 。 1） 温 度 不 要 过 高 (0 4 )； (高 温 破 坏 氢 键 ) 2） 控 制 pH值 范 围 (pH值 4-10);(极 端 酸 碱 破 坏 磷 酸 二 酯 键 ) 3） 保 持 一 定 离 子 强 度 ; 4） 减 少 物 理 因 素 对 核 酸 的 机 械 剪 切 力 . 核酸制备的技术路线 核 酸 的 浓 缩 、 沉 淀 与 洗 涤 随 着 提 取 试 剂 的 逐 步 加 入 ， 去 除 杂 质 时 的 丢 失 ， 样 品 中 核 酸的 浓 度 会 逐 步 下 降 ， 当 不 能 满 足 后 续 研 究 与 诊 断 所 需 时 应 对样 品 进 行

11、浓 缩 。 沉 淀 是 浓 缩 核 酸 的 最 常 用 且 高 效 的 方 法 ， 优 点 ： 改 变 核 酸 的 溶 解 缓 冲 液 ； 重 新 调 整 核 酸 的 浓 度 ； 去 除 溶 液 中 某 些 盐 离 子 与 杂 质 。 核 酸 的 鉴 定 与 保 存（ 一 ） 核 酸 的 鉴 定1. 浓 度 鉴 定 核 酸 浓 度 的 测 定 可 通 过 紫 外 分 光 光 度 法 与 荧 光光 度 法 进 行 。 紫 外 分 光 光 度 法 ： 该 法 是 基 于 核 酸 分 子 中 的 碱 基 具 有 共 轭 双键 结 构 因 而 可 以 吸 收 紫 外 线 ， 其 最 大 吸 收 波 长

12、 为 260nm， 这一 物 理 特 性 。前 提 ： 核 酸 样 品 要 较 纯 ， 无 显 著 蛋 白 质 、 酚 、 琼 脂 糖 及 其 他 核 酸 污 染 。测 定 浓 度 应 大 于 0.25 g/ml 荧 光 光 度 法 ： 核 酸 在 荧 光 染 料 溴 化 乙 锭 （ ethidium bromide， EB） 嵌 入 碱 基 平 面 后 ， 本 身 无 荧 光 的 核 酸 在 UV激发 下 发 出 红 色 荧 光 ， 且 荧 光 强 度 的 积 分 与 溶 液 中 核 酸 的 含 量呈 正 比 。 纯 度 鉴 定 紫 外 分 光 光 度 法 或 荧 光 光 度 法 皆 可 用

13、 于 核 酸制 品 的 纯 度 鉴 定 。 紫 外 分 光 光 度 法 ： 该 法 主 要 通 过 A260与 A280的 比 值 来 判定 有 无 蛋 白 质 的 污 染 。 在 TE缓 冲 液 中 ， 纯 DNA的 A260/A280为 1.8， 纯 RNA的 比 值 为 2.0。 比 值 升 高 与 降 低 均 提 示 不 纯 。 荧 光 光 度 法 ： 用 EB等 荧 光 染 料 示 踪 的 核 酸 电 泳 结 果 可 判定 核 酸 制 品 的 纯 度 。 DNA分 子 较 RNA大 得 多 ， 电 泳 迁 移 率 低 。 完 整 性 鉴 定 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 法 ： 以 E

14、B为 示 踪 剂 的 核 酸 凝 胶 电 泳 结 果 为 依 据 。 基因 组 DNA片 段 如 发 生 降 解 ， 电 泳 图 呈 拖 尾 状 。 完 整 的 或 降 解 很 少 的 总RNA电 泳 图 谱 中 ， 三 条 带 的 荧 光 强 度 积 分 应 呈 特 定 的 比 值 ， 如 有 改 变则 提 示 有 RNA的 降 解 。 此 外 ， 若 在 点 样 孔 附 近 有 着 色 条 带 ， 则 说 明 存在 DNA 的 污 染 。 其 它 方 法 ： 必 要 时 ， 还 可 通 过 一 些 特 殊 的 实 验 来 鉴 定 RNA的 完 整 性 。 如 小 规 模 的 cDNA第 一

15、 条 链 的 合 成 反 应 ， 已 知 大 小 的 某 种 mRNA的Northern杂 交 等 (1) 对 DNA DNA样 品 溶 于 pH8.0的 TE， 4 或 -20 保 存 ； 在 -70可 保 存 数 年 长 期 保 存 样 品 中 可 加 入 1滴 氯 仿 。(2) 对 RNA RNA样 品 溶 于 0.3 mol/L NaAc (pH5.2)或 双 蒸 灭 菌 水 中 ，-70 保 存 ; 长 期 保 存 可 以 沉 淀 形 式 贮 于 乙 醇 中 ; 在 RNA溶 液 中 ， 加 1滴 0.2 mol/L VRC(氧 钒 核 糖 核 苷 复合 物 )冻 贮 于 -70 ,

16、可 保 存 数 年 。（ 二 ） 核 酸 的 保 存 尽 管 基 因 组 DNA因 来 源 、 性 质 以 及 制 备 的 目 的 不 同 ， 其 分 离 纯化 的 方 法 不 尽 相 同 ， 但 有 关 分 离 纯 化 的 原 则 、 主 要 步 骤 、 主 要技 术 、 主 要 试 剂 及 其 作 用 原 理 是 一 样 的 。 基 因 组 DNA分 离 纯 化的 一 般 程 序 见 图 7-4。真 核 基 因 组 DNA的 分 离 纯 化 真 核 基 因组 DNA分离 纯 化 的一 般 技 术路 线 1、 酚 抽 提 法 (SDS法 ）本 法 最 初 于 1976年 由 Stafford

17、及 其 同 事 提 出 ， 通 过 改 良 ， 以 含EDTA、 SDS及 无 DNA酶 的 RNA酶 裂 解 缓 冲 液 破 碎 细 胞 ， 经 蛋 白 酶 K处理 后 ， 用 pH8.0的 Tris饱 和 酚 抽 提 DNA， 重 复 抽 提 至 一 定 纯 度 后 ，根 据 不 同 需 要 进 行 透 析 或 沉 淀 处 理 获 得 所 需 的 DNA样 品 。 裂 解 液 中 ：EDTA： 离 子 螯 合 剂 ， 抑 制 DNase活 性 ， 降 低 细 胞 膜 稳 定 性SDS： 溶 解 细 胞 膜 、 核 膜 ， 乳 化 脂 质 、 蛋 白 ， 并 使 其 变 性 沉 淀 ， 同时

18、 变 性 DNase无 DNase的 RNase可 高 效 水 解 RNA而 避 免 DNA的 消 化蛋 白 酶 K： 消 化 DNase和 胞 中 的 蛋 白 质酚 ： 变 性 沉 淀 蛋 白 ， 抑 制 DNase活 性pH 8.0的 Tris溶 液 保 证 抽 提 时 DNA进 入 水 相 ， 防 止 DNA变 性 q SDS法流程图 （以动物组织为例） 动物组织 细胞裂解 上层溶液组织匀浆 抽提 干燥溶解离心洗涤酒精沉淀 DNA溶液 2、 甲 酰 胺 解 聚 法该 法 操 作 步 骤 少 ， 但 耗 时 ， 所 得 DNA浓 度 低 ， 适 用 于 制 备 大 片 段 DNA1987年

19、 Kupiec等 报 道 了 甲 酰 胺 （ formamide） 解 聚 法 ， 该 法 的 细胞 裂 解 与 蛋 白 质 水 解 同 酚 抽 提 法 相 似 ， 但 不 进 行 酚 的 抽 提 ， 而 是以 高 浓 度 的 甲 酰 胺 裂 解 DNA与 蛋 白 质 的 复 合 物 （ 即 染 色 质 ） ， 然后 通 过 火 棉 胶 袋 的 充 分 透 析 以 除 去 蛋 白 酶 K和 有 机 溶 剂 。 3、 玻 棒 缠 绕 法用 该 法 收 集 高 分 子 量 DNA的 沉 淀 始 于 20世 纪 30年 代 ， 现 今 使 用 的 缠绕 法 是 以 1987年 Bowtell的 方

20、法 经 改 进 而 来 。本 法 有 两 个 关 键 步 骤 ： 一 是 基 因 组 DNA沉 淀 在 细 胞 裂 解 液 和 乙 醇 的交 界 面 ； 二 是 将 DNA沉 淀 缠 绕 在 带 钩 玻 棒 上 。 带 钩 玻 棒 将 大 片 段 DNA从 无 水 乙 醇 中 转 移 至 pH8.0的 TE缓 冲 液 中 。该 法 以 盐 酸 胍 裂 解 细 胞 ， 制 备 的 DNA片 段 约 有 80kb， 适 用 于 同 时 从 不 同细 胞 或 组 织 标 本 中 提 取 DNA 物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法生物方式：酶法q根据细胞裂解方

21、式的不同有： 吸附材料结合法：q根据核酸分离纯化方式的不同有：硅质材料阴离子交换树脂磁珠 高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱快捷高效。低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱适用于纯度要求高的实验。磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从而达到分离目的。 浓盐法：有机溶剂抽提法：密度梯度离心法：利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物 基 因 组 DNA片 段 的 纯 化纯 化 的 原 则 与 要 求纯 化 的 方 法 有 透 析 、 层 析 、 电 泳 及 选 择 性 沉 淀 等 。 无

22、论 采 用 何 种方 法 从 何 种 支 持 介 质 中 纯 化 与 回 收 所 需 要 的 DNA片 段 都 要 注 意 两个 原 则 ：一 是 提 高 片 段 的 回 收 率 ；二 要 清 除 回 收 的 DNA样 品 中 的 污 染 。 1.回 收 率 为 提 高 DNA片 段 的 回 收 率 ， 可 通 过 提 高 DNA样品 的 上 样 量 和 选 择 适 宜 的 方 法 与 材 料 而 实 现 。2. 纯 度 常 用 的 纯 化 方 法 包 括 有 机 溶 剂 抽 提 法 与 商 品化 的 柱 层 析 法 （ column chromatography） 。柱 层 析 法 采 用

23、的 是 阴 离 子 交 换 层 析 的 原 理 从 琼 脂 糖 凝 胶 中 回 收 DNA片 段从 琼 脂 糖 凝 胶 中 纯 化 DNA片 段 的 方 法 主 要 有二 乙 基 氨 基 乙 基 （ diethyl aminoethyl， DEAE） -纤 维 素（ cellulose） 膜 插 片 电 泳 法电 泳 洗 脱 法 （ 透 析 袋 及 非 透 析 袋 电 泳 洗 脱 法 ）冷 冻 挤 压 法低 熔 点 琼 脂 糖 凝 胶 挖 块 回 收 法 等 。 从 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 回 收 DNA片 段从 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 中 回 收 DNA的 标 准 方 法 是 压 碎

24、 与 浸 泡 法 。 它 是 将含 待 回 收 DNA条 带 的 凝 胶 块 切 出 ， 用 吸 头 或 接 种 针 将 其 压 碎 ， 然 后以 洗 脱 缓 冲 液 浸 泡 ， 使 DNA洗 脱 出 来 。该 方 法 能 很 好 地 回 收 小 于 1 kb的 ss或 ds-DNA， 依 分 子 量 不 同 ， 其回 收 率 从 小 于 30%至 大 于 90%不 等 。 回 收 的 DNA纯 度 极 高 ， 无 酶 抑 制剂 ， 也 无 对 转 染 细 胞 或 微 注 射 细 胞 有 毒 的 污 染 物 ， 虽 费 时 但 操 作简 单 ， 是 小 片 段 DNA回 收 的 较 好 方 法

25、 。 质粒DNA 的提取与纯化 质 粒 DNA的 提 取 与 纯 化 的 经 典 方 法 包 括 ： 碱 裂 解 法 煮 沸 裂 解 法 SDS裂 解 法 等这 些 方 法 主 要 由 质 粒 DNA的 扩 增 、 质 粒 DNA的 释 放 、 质 粒 DNA的分 离 纯 化 三 个 步 骤 组 成 1、 碱 裂 解 法在 NaOH提 供 的 高 pH（ 12.0 12.6） 条 件 下 ， 用 强 阳 离 子 去 垢 剂SDS破 坏 细 胞 壁 ， 裂 解 细 胞 ， 与 NaOH共 同 使 宿 主 细 胞 的 蛋 白 质 与染 色 体 DNA发 生 变 性 ， 释 放 出 质 粒 DNA。

26、 q碱裂解法原理 染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子； 当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象； 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。 尽 管 碱 溶 液 能 破 坏 DNA中 的 碱 基 配 对 ， 但 CCC质 粒 DNA因 缠 绕 紧密 而 不 易 解 链 ， 只 要 不 在 碱 性 条 件 下 变 性 太 久 ， 当 pH调 至 中性 时 ， CCC质 粒 DNA就

27、 可 重 新 恢 复 天 然 的 超 螺 旋 。该 法 操 作 简 单 、 重 复 性 好 且 成 本 低 ， 制 备 的 质 粒 纯 度 能 满足 DNA测 序 与 PCR等 实 验 要 求 ， 是 使 用 最 广 泛 的 方 法 q碱裂解法流程图对数期菌体 溶液III中和溶液I充分重悬溶液II裂解 上清液抽提离心洗涤酒精沉淀 干燥溶解沉淀质粒DNA溶液 2、 SDS裂 解 法 SDS裂 解 法 是 将 细 菌 悬 浮 于 等 渗 的 蔗 糖 溶 液 中 ， 用 溶 菌 酶 和EDTA处 理 以 破 坏 细 胞 壁 ， 去 壁 细 菌 再 用 SDS裂 解 ， 从 而 温 和 地释 放 质

28、粒 DNA到 等 渗 液 中 ， 然 后 用 酚 /氯 仿 抽 提 ， 乙 醇 沉 淀 、 洗涤 质 粒 DNA 由 于 条 件 温 和 ， 该 法 特 别 适 用 于 大 质 粒 DNA（ 15kb） 的 提 取 。但 有 一 部 分 质 粒 DNA会 与 细 胞 碎 片 缠 绕 在 一 起 而 丢 失 ， 故 产 率不 高 。 3、 煮 沸 裂 解 法该 法 条 件 剧 烈 ， 只 能 用 于 小 质 粒 DNA的 制 备煮 沸 裂 解 法 是 将 细 菌 悬 浮 于 含 Triton X-100和 溶 菌 酶 的 缓 冲 液 中 ，Triton X-100和 溶 菌 酶 破 坏 细 胞

29、壁 后 ， 沸 水 浴 裂 解 细 胞 的 同 时 可 破坏 DNA链 的 碱 基 配 对 ， 并 使 宿 主 细 胞 的 蛋 白 质 与 染 色 体 DNA变 性 ， 但CCC质 粒 DNA因 结 构 紧 密 不 会 解 链 。 当 温 度 下 降 后 ， CCC质 粒 DNA可 重新 恢 复 其 超 螺 旋 结 构 。 通 过 离 心 去 除 变 性 的 蛋 白 质 和 染 色 体 DNA， 然后 回 收 上 清 中 的 质 粒 DNA。 质 粒 DNA的 纯 化 1、 CsCl-EB法 利 用 CsCl形 成 的 连 续 密 度 梯 度 ， 在 过 量 EB存 在 的 条 件 下 ，各

30、种 不 同 密 度 的 物 质 经 离 心 平 衡 后 得 以 分 开 。 2、 聚 乙 二 醇 沉 淀 法 （ 一 种 分 级 沉 淀 法 ） 3、 柱 层 析 法 （ 树 脂 ） RNA极 易 被 RNase水 解 ， 除 胞 内 的 RNase外 ， 它 还 广 泛 存 在 于 人的 皮 肤 、 唾 液 、 汗 液 及 周 围 的 环 境 中 ； RNase分 子 结 构 中 二 硫 键的 存 在 使 其 生 物 学 活 性 非 常 稳 定 ， 加 热 煮 沸 及 一 般 的 变 性 剂 均不 能 使 其 完 全 灭 活 ， 而 且 去 除 变 性 剂 （ denaturant） 后 ，

31、RNase的 活 性 又 可 恢 复 。 因 此 ， 在 RNA的 制 备 过 程 中 ， 排 除 RNase的 污 染 及 强 有 力 地 抑 制其 活 性 是 RNA制 备 成 功 与 否 的 关 键真 核 细 胞 RNA的 分 离 纯 化 为 获 得 完 整 的 RNA分 子 ， 必 须 在 总 RNA提 取 分 离 的 最 初 阶 段 ， 尽 可能 地 灭 活 胞 内 RNase的 活 性 。 选 择 性 地 使 用 RNase的 变 性 剂 （ 如 酚 、 氯 仿 及 强 烈 的 胍 类 变 性 剂 ） 。 蛋 白 酶 K和 能 与 蛋 白 质 结 合 的 阴 离 子 去 污 剂 如

32、 SDS、 十 二 烷 基 肌 氨 酸钠 或 脱 氧 胆 酸 钠 ， 并 联 合 使 用 RNase的 特 异 抑 制 剂 （ 如 RNasin与DEPC等 ） 能 极 大 地 防 止 内 源 性 RNase对 RNA的 降 解 。 此 外 ， 在 变 性 液 中 加 入 -疏 基 乙 醇 、 二 硫 苏 糖 醇 （ DTT） 等 还 原 剂可 以 还 原 RNase中 的 二 硫 键 ， 有 利 于 RNase的 变 性 、 水 解 与 灭 活 。 由 Chomczynski和 Sacchi 于 1987年 提 出 。 它 以 含 4mmol/L的(异 )硫 氰 酸 胍 与 0.1mmol/

33、L的 -巯 基 乙 醇 的 变 性 溶 液 裂 解 细胞 ， 然 后 在 pH4.0的 酸 性 条 件 下 ， 用 酚 /氯 仿 抽 提 裂 解 溶 液 ，最 后 通 过 异 丙 醇 沉 淀 与 75%的 乙 醇 洗 涤 来 制 备 RNA。 。 本 法 具 有 简 便 、 快 速 、 经 济 、 高 效 及 提 取 的 RNA质 量 高 等 优 点 ，能 在 3小 时 内 迅 速 处 理 多 个 标 本 酸 性 异 硫 氰 酸 胍 -酚 -氯 仿 一 步 法 分 离 总 RNA mRNA的 分 离 纯 化 与 序 列 明 确 的 rRNA、 tRNA、 snRNA、 scRNA不 同 ， 真

34、 核 生 物的 mRNA在 细 胞 中 含 量 少 ， 种 类 多 且 分 子 量 大 小 不 一 。 除 血 红蛋 白 及 组 蛋 白 的 mRNA外 ， 绝 大 多 数 mRNA在 其 3末 端 带 有 长 短不 同 的 poly（ A） 尾 巴 。 依 据 mRNA的 结 构 特 征 ， 利 用 碱 基 配 对 原 则 ， 通 过 oligo（ dT）-纤 维 素 或 poly（ U） -琼 脂 糖 凝 胶 的 亲 和 层 析 ， 可 以 很 容 易地 从 总 RNA制 品 中 分 离 纯 化 mRNA。 1、 oligo（ dT） -纤 维 素 柱 层 析 法2、 oligo（ dT）

35、 -纤 维 素 柱 离 心 法3、 oligo（ dT） -纤 维 素 液 相 结 合 离 心 法4、 磁 性 球 珠 分 离 法 该 法 联 合 利 用 了 oligo（ dT） 与 poly（ A） 的 互 补 配 对 、 生物 素 （ biotin） 与 链 亲 和 素 （ streptavidin） 的 结 合 特异 性 以 及 磁 性 分 离 原 理 ， 可 对 poly（ A） +RNA进 行 高 效 、灵 敏 及 快 捷 的 分 离 。 5m7G AAAAAAAAAAAA3 3TTTTTTTTTTTT-Biotin5+总RNA中的poly(A) +RNA分子 退火形成杂交体 5m

36、7G AAAAAAAAAAAA3 3TTTTTTTTTTTT-Biotin5 链亲和素标记的磁珠+ Streptavidin- 磁5m7G AAAAAAAAAAAA3 3TTTTTTTTTTTT-Biotin5 Streptavidin- 磁生物素与链亲和素的特异性结合 磁性分离 5m7G AAAAAAAAAAAA3 磁铁3TTTTTTTTTTTT-Biotin5 Streptavidin- 磁洗涤与洗脱水相(含纯化的mRNA) 固相 生物素标记的oligo(dT) 磁铁5m7G AAAAAAAAAAAA3 3TTTTTTTTTTTT-Biotin5 Streptavidin- 磁图 3-2

37、磁 珠 分 离 法 纯 化 poly(A) +RNA的 原 理 5、 其 它 方 法Poly(U)-凝 胶 层 析 法 : 利 用 Poly(U)与 Poly(A)的 互 补 配对 原 理Poly(U)-滤 纸 法 : 将 总 RNA加 到 共 价 交 联 有 Poly(U)的 滤 纸上 ,经 洗 涤 后 加 热 洗 脱 q蛋白质的去除： 酚/氯仿抽提 使用变性剂变性（SDS、异硫氰酸胍等） 高盐洗涤 蛋白酶处理 q多糖的去除： 高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的5M NaCl，高盐可溶解多糖。 用多糖水解酶将多糖降解。 在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可以与

38、多糖的羟基作用，从而去除多糖 。 用PEG 8000代替乙醇沉淀DNA：在500 L DNA液中加入200 l 20% PEG8000 (含1.2 M NaCl) ，冰浴20min。 q多酚的去除： 在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂： -巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等 加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合q盐离子的去除： 70的乙醇洗涤 1. DNA中 含 有 蛋 白 、 多 糖 、 多酚 类 杂 质2. DNA在 溶 解 前 ， 有 酒 精 残 留， 酒 精 抑 制 后 续 酶 解 反 应3. DNA中 残 留

39、有 金 属 离 子 1. 重 新 纯 化 DNA， 去 除 蛋 白 、 多 糖、 多 酚 等 杂 质 （ 具 体 方 法 见 前）2. 重 新 沉 淀 DNA， 让 酒 精 充 分 挥 发3. 增 加 70 乙 醇 洗 涤 的 次 数 （ 2-3次 ）q问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。 原因 对策 1. 材 料 不 新 鲜 或 反 复 冻 融2. 未 很 好 抑 制 内 源 核 酸 酶 的 活性3. 提 取 过 程 操 作 过 于 剧 烈 ， DNA被 机 械 打 断4. 外 源 核 酸 酶 污 染5. 反 复 冻 融 1. 尽 量 取 新 鲜 材 料 ， 低 温 保 存 材

40、 料 避 免 反 复 冻 融2. 液 氮 研 磨 或 匀 浆 组 织 后 ， 应 在 解 冻 前 加 入 裂 解 缓冲 液3. 在 提 取 内 源 核 酸 酶 含 量 丰 富 的 材 料 的 DNA时 ， 可增 加 裂 解 液 中 螯 合 剂 的 含 量4. 细 胞 裂 解 后 的 后 续 操 作 应 尽 量 轻 柔5. 所 有 试 剂 用 无 菌 水 配 制 ， 耗 材 经 高 温 灭 菌6. 将 DNA分 装 保 存 于 缓 冲 液 中 ， 避 免 反 复 冻 融q问题二：DNA降解。 对策 原因 1. 实 验 材 料 不 佳 或 量 少2. 破 壁 或 裂 解 不 充 分3. 沉 淀 不

41、 完 全4. 洗 涤 时 DNA丢 失 1. 尽 量 选 用 新 鲜 （ 幼 嫩 ） 的 材 料2. 动 植 物 要 匀 浆 研 磨 充 分 ； G 菌 、 酵 母 裂解 前 先 用 生 物 酶 或 机 械 方 式 破 壁3. 高 温 裂 解 时 ， 时 间 适 当 延 长 （ 对 于 动 物细 胞 、 细 菌 可 增 加 PK的 用 量 ）4. 低 温 沉 淀 ， 延 长 沉 淀 时 间5. 加 辅 助 物 ， 促 进 沉 淀6. 洗 涤 时 ， 最 好 用 枪 头 将 洗 涤 液 吸 出 ， 勿倾 倒q问题三：DNA提取量少。 对策 原因 三 、 蛋 白 质 的 分 离 与 纯 化 蛋 白

42、 质 的 分 离 纯 化 是 研 究 蛋 白 质 化 学 组 成 、 结 构 及 生物 学 功 能 、 新 蛋 白 质 的 发 现 和 疾 病 分 子 诊 断 的 基 础 ；分 子 克 隆 中 ， 下 游 的 处 理 和 分 析 鉴 定 ， 基 因 工 程 产 品的 制 备 ， 也 需 要 蛋 白 质 的 分 离 和 纯 化 。 蛋 白 质 分 离 纯 化 的 总 目 标 是 增 加 制 品 的 纯 度 （ purity） 或比 活 （ specific activity） ， 以 增 加 单 位 蛋 白 质 重 量 中靶 蛋 白 的 含 量 或 生 物 学 活 性 （ 比 活 常 以 活 力

43、 单 位 数 /毫 克蛋 白 质 表 示 ） ， 即 从 蛋 白 混 合 物 中 设 法 去 除 不 要 的 杂 蛋 白和 变 性 的 靶 蛋 白 ， 使 靶 蛋 白 的 产 量 达 到 最 高 值 。 蛋白质分离纯化的一般技术路线 分 离 纯 化 的 总 体 原 则 一 是 保 证 靶 蛋 白 结 构 的 完 整 ， 防 止 降 解 和 活 性 蛋 白 质 的 变 性 ； 二 是 尽 量 满 足 研 究 与 诊 断 对 靶 蛋 白 纯 度 的 要 求 。 纯 化 蛋 白 质总 是 希 望 纯 度 和 产 率 均 高 ， 例 如 纯 化 某 种 酶 ， 理 想 的 结 果 是 比活 力 和 总

44、 回 收 率 均 高 ， 但 实 际 工 作 中 二 者 不 能 兼 得 ， 通 常 在 科研 上 希 望 比 活 力 尽 可 能 高 ， 而 牺 牲 一 些 回 收 率 ， 在 工 业 生 产 和分 子 诊 断 中 则 正 相 反 。 蛋 白 质 分 离 纯 化 的 条 件蛋 白 质 是 一 类 结 构 复 杂 、 有 生 物 活 性 的 生 物 大 分 子 ， 离 开 天 然 的 存在 体 系 ， 其 结 构 与 活 性 变 得 极 不 稳 定 ， 因 此 从 生 物 材 料 中 提 纯 各 种靶 蛋 白 均 需 要 特 定 的 条 件 。 应 注 意 各 种 因 素 对 靶 蛋 白 的

45、影 响 。 1. 缓 冲 液 2. 盐 、 金 属 离 子 和 螯 合 剂 .3. 还 原 剂 4. 去 垢 剂5. 增 溶 剂 6. 蛋 白 酶 抑 制 剂 （ pronase inhibitor）7. 蛋 白 质 的 环 境 因 素 表 面 效 应 的 影 响 温 度 的 影 响 储 存 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 方 法 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 是 依 据 其 溶 解 性 、 分 子 质 量 大 小 及 形 状 、电 离 性 质 和 生 物 学 功 能 的 差 异 而 进 行 的 。 分 离 纯 化 的 方 法 可分 类 如 下 ： 以 溶 解 度 的 差 异 为 依 据 的

46、 方 法 ： 盐 析 、 分 配 层 析 、 有 机 溶剂 沉 淀 、 选 择 性 沉 淀 和 结 晶 等 ； 以 分 子 大 小 及 形 状 差 异 为 依 据 的 方 法 ： 差 速 离 心 、 区 带 离心 、 超 滤 、 透 析 和 凝 胶 过 滤 层 析 等 ； 以 电 离 性 质 差 异 为 依 据 的 方 法 ： 电 泳 、 离 子 交 换 层 析 等 ； 以 生 物 学 功 能 专 一 性 为 依 据 的 方 法 ： 亲 和 层 析 。 盐 析 法 ： 将 硫 酸 铵 、 硫 酸 钠 或 氯 化 钠 等 加 入 蛋 白 质 溶 液 ， 使 蛋白 质 表 面 电 荷 被 中 和

47、以 及 水 化 膜 被 破 坏 ， 导 致 蛋 白 质 沉 淀 。 等 电 点 沉 淀 法 ： 净 电 荷 为 零 ， 分 子 之 间 的 静 电 排 斥 力 最 小 ， 因而 容 易 聚 集 形 成 沉 淀 。 该 法 适 用 于 在 等 电 点 pH稳 定 的 蛋 白 质 。有 机 溶 剂 沉 淀 法 ： 甲 醇 、 乙 醇 、 丙 酮 等 （ 保 持 低 温 ） ， 破 坏 蛋白 质 的 水 化 层 ， 使 蛋 白 质 的 溶 解 度 降 低 而 沉 淀 。 + + +带正电荷的蛋白质 带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质水 化 膜+ + + +带正电荷的蛋白质 带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白

48、质颗粒酸碱酸碱酸碱脱水作用脱水作用脱水作用溶液中蛋白质的聚沉 加压 蛋白质溶液半透膜支持膜的栅板超滤液 凝 胶 过 滤 层 析 (gel filtration)凝 胶 过 滤 层 析 亦 称 凝 胶 色 谱 、 排 阻 色 谱 或 分 子 筛 ， 是 利 用 凝 胶把 分 子 大 小 不 同 的 物 质 分 离 开 的 一 种 方 法 。凝 胶 色 谱 的 机 理 是 分 子 筛 效 应 ， 在 洗 脱 过 程 中 ， 大 分 子 不 能 进入 凝 胶 内 部 ， 而 沿 凝 胶 颗 粒 间 的 空 隙 最 先 流 出 柱 外 ； 而 小 分 子可 以 进 入 凝 胶 颗 粒 内 部 的 多

49、孔 网 状 结 构 ， 路 径 长 、 流 速 慢 ， 以至 最 后 流 出 柱 外 。 因 此 ， 混 合 样 品 如 同 “ 过 筛 ” 一 样 ， 因 分 子大 小 的 不 同 得 以 彼 此 分 开 。 离 子 交 换 层 析 的 原 理 密 度 梯 度 （ 区 带 ） 离 心 ： 常 用 蔗 糖 密 度 梯 度 电 泳蛋 白 质 在 高 于 或 低 于 其 pI的 溶液 中 为 带 电 的 颗 粒 ， 在 电 场 中能 向 正 极 或 负 极 移 动 。 这 种 通过 蛋 白 质 在 电 场 中 泳 动 而 达 到分 离 各 种 蛋 白 质 的 技 术 , 称 为电 泳 (elctr

50、ophoresis) 。电 泳 (elctrophoresis) 几 种 重 要 的 蛋 白 质 电 泳SDS-聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 （ SDS-polyacrylamide gel electrophoresis， SDS-PAGE） ： 常 用 于 蛋 白 质 分 子 量 的 测 定 。每 一 个 蛋 白 质 分 子 都 因 为 结 合 了 许 多的 SDS而 带 有 大 量 的 负 电 荷 ， 而 蛋 白 质分 子 原 有 的 电 荷 则 可 以 忽 略 。 由 于 所有 的 蛋 白 质 颗 粒 都 带 有 大 量 的 负 电 荷 ，而 且 它 们 的 电 荷 密 度 也

51、大 体 相 同 ， 因此 ， Eq值 接 近 一 个 常 数 。 所 以 该 法 主要 利 用 了 蛋 白 质 分 子 量 大 小 不 同 而 分离 蛋 白 质 。 等 电 聚 焦 电 泳 （ isoelectric focusing， IEF） 通 过 蛋 白 质 等 电 点 的 差异 而 分 离 蛋 白 质 的 电 泳方 法 。 pH梯 度 以 两 性 电解 质 ampholyte（ 脂 肪 族多 胺 和 多 羧 同 系 物 ） 在外 电 场 作 用 下 自 然 形 成 。 双 向 凝 胶 电 泳 two-dimensional electrophoresis 方 法 原 理 优 点 缺

52、点凝 胶 层 析 分 子 筛 的 排 阻 效 应 分 辨 力 高 、 不 会 引 起 变 性 凝 胶 介 质 昂 贵 、 处 理 量 有 限离 子 交 换 层 析 各 组 份 与 离 子 交 换 剂 亲 和 力不 同 分 辨 力 高 、 处 理 量 较 大 需 酸 碱 处 理 树 脂 、 操 作 耗 时电 泳 法 等 电 点 、 分 子 量 、 电 荷 的 差异 分 辨 力 很 高 、 可 连 续 制 备 仪 器 试 剂 昂 贵盐 析 法 破 坏 水 化 膜 和 中 和 表 面 电 荷 操 作 简 便 、 成 本 低 、 重 复 性好 、 对 蛋 白 有 保 护 作 用 分 辨 率 差 、 纯

53、 化 倍 数 低 、 沉 淀 中 混杂 盐 分选 择 性 沉 淀 等 电 点 、 热 变 性 、 酸 碱 变 性等 沉 淀 作 用 选 择 性 较 强 、 方 法 简 便 、 种类 较 多 应 用 范 围 较 窄有 机 溶 剂 沉 淀 脱 水 作 用 和 降 低 介 电 常 数 操 作 简 便 、 分 辨 较 强 对 蛋 白 质 或 酶 有 变 性 作 用亲 和 层 析 蛋 白 质 与 配 体 之 间 特 殊 的 亲 和 力 分 辨 力 很 高 局 限 性 大高 速 与 超 速 离 心 沉 降 系 数 或 密 度 差 异 操 作 方 便 、 容 量 大 设 备 昂 贵制 备 HPLC 凝 胶

54、过 滤 、 离 子 交 换 、 反 向色 谱 等 分 辩 力 很 高 、 步 骤 少 ， 仪 器 昂 贵 常用的蛋白质分离纯化方法 蛋 白 质 在 组 织 或 细 胞 中 是 以 复 杂 的 混 合 物 形 式 存 在 ， 每种 类 型 的 细 胞 都 含 有 成 千 上 万 种 不 同 的 蛋 白 质 ， 蛋 白 质的 分 离 纯 化 往 往 要 采 取 多 种 方 法 联 合 使 用 ， 并 通 过 预 实验 进 行 条 件 优 化 ， 逐 步 地 制 备 高 纯 度 或 高 比 活 的 靶 蛋 白 ，实 现 蛋 白 质 分 离 纯 化 的 目 标 蛋 白 质 样 品 的 纯 度 鉴 定

55、蛋 白 质 的 纯 度 （ purity） 一 般 指 是 否 含 有 其 它 杂 蛋 白 ， 而不 包 括 盐 、 缓 冲 液 离 子 、 SDS等 小 分 子 在 内 ， 一 定 条 件 下 的相 对 均 一 性 。 目 前 常 用 的 鉴 定 纯 度 的 方 法 有 ： 有 聚 丙 烯 酰胺 凝 胶 电 泳 （ PAGE） 、 SDS-PAGE、 毛 细 管 电 泳 （ CE） 、 等电 聚 焦 电 泳 （ IFE） 及 高 效 液 相 色 谱 （ HPLC） 。 此 外 ， 还 有超 速 离 心 法 、 蛋 白 质 的 化 学 组 成 和 结 构 分 析 法 。 蛋 白 质 的 定 量

56、 和 分 子 量 测 定 蛋 白 质 的 定 量 ， 通 常 是 指 测 定 溶 液 中 的 蛋 白 质 浓 度 。 测 定蛋 白 质 总 量 的 方 法 很 多 ， 最 早 的 经 典 方 法 是 凯 氏 定 氮 法 ，此 法 虽 有 普 遍 性 ， 但 操 作 繁 琐 ， 目 前 极 少 使 用 。 应 用 较 为 广 泛 的 方 法 是 双 缩 脲 法 、 福 林 -酚 法 和 紫 外 吸 收法 。 测 定 蛋 白 质 混 合 物 中 某 一 特 定 靶 蛋 白 的 含 量 通 常 要 用 具 有高 度 特 异 性 的 生 物 学 方 法 。 活 性 的 测 定 和 总 蛋 白 量 的

57、测 定配 合 起 来 可 以 用 来 表 示 分 离 纯 化 过 程 中 某 一 特 定 靶 蛋 白 的纯 化 程 度 。 纯 化 程 度 常 用 这 一 特 定 成 分 的 含 量 （ 一 般 用 活力 单 位 ） 与 总 蛋 白 量 （ 质 量 单 位 ） 之 比 来 表 示 。 确 定 了 蛋 白 质 的 均 一 性 后 ， 蛋 白 质 的 定 性 以 及 一 级 结 构的 研 究 ， 都 需 要 测 定 蛋 白 质 的 分 子 质 量 以 及 亚 基 和 寡 聚体 的 分 子 质 量 。 测 定 蛋 白 质 分 子 质 量 的 方 法 很 多 ， 这 此方 法 都 是 根 据 蛋 白

58、质 的 理 化 性 质 来 测 定 分 子 量 的 ， 由 此测 得 的 分 子 量 称 为 物 理 分 子 质 量 。 与 物 理 分 子 量 相 对 应的 是 化 学 分 子 量 ， 化 学 分 子 量 是 从 化 学 分 析 所 得 的 结 果 ，计 算 而 得 到 的 最 小 分 子 质 量 。 四 、 生 物 小 分 子 的 提 取 纯 化 1、 溶 剂 提 取 法2、 水 蒸 气 蒸 馏 法 3、 升 华 法 4、 超 临 界 流 体 萃 取 法 5、 超 声 提 取 法 6、 固 相 萃 取 法 常 用 提 取 方 法 分 离 精 制 的 原 理 主 要 是 根 据 ：1） 物

59、质 溶 解 度 差 别 ；2） 物 质 在 两 相 溶 剂 中 的 分 配 比 不 同 ；3)物 质 的 吸 附 性 差 别 ；4） 物 质 分 子 大 小 差 异 等 进 行 分 离 常 用 纯 化 方 法1、 逆 流 分 配 法 （ CCD） 2、 液 滴 逆 流 色 谱 法 （ DCCC）3、 高 速 逆 流 色 谱 法 （ HSCCC）4、 气 液 分 配 色 谱 （ GC或 GLC）5、 液 -液 分 配 色 谱 6、 凝 胶 过 滤 法 7、 超 滤 法 8、 硅 胶 吸 附 色 谱9、 氧 化 铝 吸 附 色 谱 10、 大 孔 吸 附 树 脂 吸 附 色 谱 等 Metabol

60、ite Regulation of Glycolysis and GluconeogenesisGlucoseG6PF6PF16P 2 GlucokinasePEPPyruvateLactate + H + ADPATP Pyruvate kinaseOxaloacetateGTP GDPATP CO2ADPPyruvate carboxylase CO2PEPcarboxy kinaseAcetyl-CoA+ F16P2+ATP, Alanine_ ATPADP F6P- 1- kinaseCitrate, ATP, H+_AMP, F26P2+Fructose-1,6-bisphospha

61、taseAMP, F26P2_ ADPATPPiGlucose-6-phosphatase Glucokinase binding protein (F6P-ligated)_(FBPase) T-StateR-State （ 1） 分 离 纯 化 方 法 千 差 万 别 ， 没 有 一 种 标 准 方 法 可 通 用 于 各 种生 物 大 分 子 的 分 离 制 备 ；（ 2） 制 备 几 乎 都 是 在 溶 液 中 进 行 的 ， 难 以 准 确 估 计 和 判 断 pH值 、温 度 度 等 各 种 参 数 对 溶 液 中 各 种 组 份 的 综 合 影 响 生 物 大 分 子 的 制 备

62、 有 以 下 主 要 特 点 ： 制 备 生 物 大 分 子 的 分 离 纯 化 方 法 多 种 多 样 ， 主 要 是 利 用 它们 之 间 理 化 性 质 的 差 异 。根 据 作 用 原 理 生 物 分 子 的 分 离 、 纯 化 可 分 为 以 下 几 种 类 型 ：（ 1） 根 据 分 子 极 性 大 小 和 溶 解 度 的 不 同 ， 如 溶 剂 提 取 技 术 、盐 析 法 、 分 配 层 析 法 、 分 级 沉 淀 法 等 ；（ 2） 根 据 分 子 形 状 和 大 小 不 同 ， 如 凝 胶 过 滤 层 析 等 ；（ 3） 根 据 物 质 吸 附 性 质 不 同 ， 如 选

63、择 性 吸 附 与 吸 附 层 析 法 等 ；（ 4） 根 据 分 子 带 电 性 （ 电 离 性 质 ） 的 差 异 ， 如 离 子 交 换 层 析 、电 泳 、 等 电 聚 焦 法 等 。（ 5） 根 据 配 体 特 异 性 ， 如 亲 和 层 析 。 完 整 性 鉴 定 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 法 ： 以 EB为 示 踪 剂 的 核 酸 凝 胶 电 泳 结 果 为 依 据 。 基因 组 DNA片 段 如 发 生 降 解 ， 电 泳 图 呈 拖 尾 状 。 完 整 的 或 降 解 很 少 的 总RNA电 泳 图 谱 中 ， 三 条 带 的 荧 光 强 度 积 分 应 呈 特 定 的 比

64、 值 ， 如 有 改 变则 提 示 有 RNA的 降 解 。 此 外 ， 若 在 点 样 孔 附 近 有 着 色 条 带 ， 则 说 明 存在 DNA 的 污 染 。 其 它 方 法 ： 必 要 时 ， 还 可 通 过 一 些 特 殊 的 实 验 来 鉴 定 RNA的 完 整 性 。 如 小 规 模 的 cDNA第 一 条 链 的 合 成 反 应 ， 已 知 大 小 的 某 种 mRNA的Northern杂 交 等 q SDS法流程图 （以动物组织为例） 动物组织 细胞裂解 上层溶液组织匀浆 抽提 干燥溶解离心洗涤酒精沉淀 DNA溶液 5、 其 它 方 法Poly(U)-凝 胶 层 析 法 :

65、 利 用 Poly(U)与 Poly(A)的 互 补 配对 原 理Poly(U)-滤 纸 法 : 将 总 RNA加 到 共 价 交 联 有 Poly(U)的 滤 纸上 ,经 洗 涤 后 加 热 洗 脱 几 种 重 要 的 蛋 白 质 电 泳SDS-聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 （ SDS-polyacrylamide gel electrophoresis， SDS-PAGE） ： 常 用 于 蛋 白 质 分 子 量 的 测 定 。每 一 个 蛋 白 质 分 子 都 因 为 结 合 了 许 多的 SDS而 带 有 大 量 的 负 电 荷 ， 而 蛋 白 质分 子 原 有 的 电 荷 则 可 以 忽 略 。 由 于 所有 的 蛋 白 质 颗 粒 都 带 有 大 量 的 负 电 荷 ，而 且 它 们 的 电 荷 密 度 也 大 体 相 同 ， 因此 ， Eq值 接 近 一 个 常 数 。 所 以 该 法 主要 利 用 了 蛋 白 质 分 子 量 大 小 不 同 而 分离 蛋 白 质 。 分 离 精 制 的 原 理 主 要 是 根 据 ：1） 物 质 溶 解 度 差 别 ；2） 物 质 在 两 相 溶 剂 中 的 分 配 比 不 同 ；3)物 质 的 吸 附 性 差 别 ；4） 物 质 分 子 大 小 差 异 等 进 行 分 离 T-StateR-State