溶菌酶的作用机制

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1、Determing the Mechanism of Lysozyme Action溶 菌 酶 的 作 用 机 制制 作 : 靳 晶 溶 菌 酶 是 如 何 被 发 现 的 ？ 亚 历 山 大 弗 莱 明(Alexander Fleming)，1881年 8月 6日 出 生 于苏 格 兰 艾 尔 郡 洛 奇 菲尔 德 。 他 是 苏 格 兰 低地 农 民 的 后 裔 ， 家 境贫 寒 。 因 发 现 了 青 霉 素 以 及 它对 多 种 传 染 性 疾 病 的治 疗 作 用 ， 荣 获 1945年 诺 贝 尔 生 理 学 或 医学 奖 。 1922年 的 一 天 ， 正 在 感 冒 的 英 国

2、 细 菌 学 家Alexander Fleming发 现 ， 把 一 些 鼻 粘 液 加 入细 菌 的 培 养 基 后 会 引 起 细 胞 的 溶 解 。 而 这 种存 在 于 鼻 粘 液 中 的 能 杀 死 细 菌 的 重 要 物 质 被认 为 是 一 种 酶 ， Fleming命 名 其 为 溶 菌 酶（ Lysozyme ） 。 起 初 ， Fleming对 这 种 有 杀 死 细 菌 活 性 的物 质 的 实 验 不 过 是 出 于 一 种 兴 趣 。 但 在 目睹 了 一 战 中 大 量 的 士 兵 死 于 外 伤 感 染 之 后 ， Fleming开 始 试 图 倾 其 毕 生 来

3、 寻 找 一 种 能 够有 效 杀 死 细 菌 ， 同 时 又 能 对 人 类 保 持 相 对的 无 毒 性 的 药 剂 。 不 象 Fleming在 1928年 发现 的 青 霉 素 (penicillin)， 溶 菌 酶 不 能 证明 有 临 床 价 值 。 但 是 在 酶 机 制 的 研 究 学 习方 面 ， 溶 菌 酶 扮 演 了 一 个 很 重 要 的 角 色 。 在 1965年 ,David Phillips和 他 在 牛津 的 同 事 以 0.2nm分 辨 率 的 X射 线晶 体 （ X-ray crystallography） 结构 分 析 法 阐 明 了 溶 菌 酶 的 三

4、维 结构 (tertiary structure)。 溶 菌 酶 是 从 鸡 蛋 清 中 提 炼 的 ， 蛋 清 里 的溶 菌 酶 可 以 保 护 胚 胎 在 发 育 过 程 中 免 受细 菌 的 感 染 。 溶 菌 酶 溶 解 细 菌 是 通 过 水解 细 菌 细 胞 壁 多 糖 (the polysaccharide of the bacterial cell wall)的 糖 苷 键(glycosidic bonds)。 而 敏 感 细 菌 革 兰 氏 阳 性 细 菌 (gram-positive bacteria)的 细 胞 壁 多 糖 是 N-乙 酰 氨 基 葡 糖 （ N-acet

5、ylglucosamine, NAG） -N-乙 酰 氨 基 葡 糖 乳 酸 （ N-acetylmuramic acid, NAM） 的 共 聚 物 ，其 中 的 NAG及 NAM通 过 -1， 4糖 苷键 而 交 替 排 列 。 溶 菌 酶 相 对 分 子 质 量 为 14.6X103， 由129个 氨 基 酸 组 成 的 单 肽 链 蛋 白 质 ， 含有 4对 二 硫 键 。 溶 菌 酶 分 子 近 椭 圆 形 ， 大 小 为4.5nmX3.0nmX3.0nm。 它 的 构 象 比 较 复杂 ， 螺 旋 仅 占 25%， 在 分 子 的 一 些 区域 有 伸 展 着 的 片 层 构 象

6、。 溶 菌 酶 是 一 种 葡 糖 苷 酶 ， 能 催 化 水 解 NAM的 C1和 NAG的 C4之 间 的 糖 苷 键 ， 但 不 能 水解 NAG C1和 NAM C4之 间 的 （ 1-4） 糖 苷键 。 几 丁 质 是 甲 壳 类 动 物 甲 壳 中 所 含 的 多糖 ， 仅 由 NAG残 基 通 过 （ 1-4） 糖 苷 键 连接 而 成 ， 几 丁 质 也 是 溶 菌 酶 的 底 物 。 溶 菌 酶 的 内 部 几 乎 全 部 是 非 极 性 的(nonpolar) 。 疏 水 的 相 互 作 用 在 溶 菌酶 的 折 叠 构 象 中 起 重 要 作 用 。 在 溶 菌 酶分 子

7、 的 表 面 ， 有 一 个 比 较 深 的 裂 缝 ， 其大 小 恰 好 能 容 纳 多 糖 底 物 的 6个 单 糖 ，这 是 溶 菌 酶 的 活 性 部 位 。 底 物 与 酶 结 合 后 ，酶 催 化 哪 一 个 键 水 解 呢 ？ 用 大 小 不 同 的 NAG寡 聚 体 作 底 物 测 定 被 溶菌 酶 水 解 的 相 对 速 率 ， 结 果 发 现 ， 少 于 4个糖 的 寡 聚 体 水 解 速 率 甚 小 ， 当 由 四 聚 体 增加 到 五 聚 体 时 ， 水 解 速 率 猛 增 500倍 ， 五 聚体 增 加 到 六 聚 体 ， 速 率 增 加 近 8倍 ， 六 聚 体增

8、加 到 八 聚 体 ， 速 率 不 再 变 化 。 这 种 情 况与 X射 线 晶 体 结 构 分 析 结 果 一 致 ， 活 性 部 位所 在 的 裂 缝 (cleft)正 好 被 6个 糖 残 基 所 装满 。 （ NAG） 3是 溶 菌 酶 的 竞 争 抑 制 剂 ， 因 此 A-B，B-C糖 苷 键 均 不 可 能 是 被 水 解 的 键 。 C环 的空 间 对 NAM来 说 体 积 太 大 ， 只 能 是 NAG。C-D也 不 可 能 成 为 裂 解 的 部 位 ， 而 NAM不能 适 合 到 部 位 C中 ， 进 一 步 排 除 了 另 外 一 个裂 解 部 位 ： E-F键 。

9、胞 壁 多 糖 是 一 个 NAM和NAG交 替 的 高 聚 物 ， 从 而 NAM不 能 占 据 部位 C时 也 就 不 能 占 据 部 位 E。 细 菌 的 细 胞 壁多 糖 恰 好 具 有 NAM-NAG键 ， 所 以 水 解 部 位只 能 发 生 在 D-E之 间 。 用 X射 线 晶 体 结 构 分 析 法 研 究 了 竞 争 性 抑 制剂 （ NAG） 3仅 仅 占 据 了 大 约 半 个 裂 缝 。 从活 性 部 位 的 几 何 大 小 看 出 酶 的 最 小 底 物 应该 是 （ NAG） 6。 实 验 中 用 （ NAG） 6为 底物 ， 确 实 能 被 酶 迅 速 水 解

10、。 酶 活 性 部 位 刚好 能 容 纳 一 个 六 糖 分 子 ， A、 B、 C、 D、 E、F表 示 6个 糖 残 基 的 位 置 ， 只 是 第 4个 糖 残 基D环 因 空 间 的 原 因 必 须 由 正 常 的 椅 式 变 形 为能 量 较 高 的 半 椅 式 或 “ 沙 发 ” 构 造 。 因 此糖 苷 键 的 稳 定 性 减 低 ， 键 就 容 易 从 这 里 断裂 。 进 一 步 的 问 题 是 酶 的 催 化作 用 ， 究 竟 键 是 在 糖 苷 键原 子 的 哪 一 侧 被 裂 解 的 ？ 回 答 这 个 问 题 可 以 在 H218O溶 液 中 酶 促 水解 底 物 （

11、 NAG） 6， 发 现 只 有 D糖 C1上 含有 18O， 而 E糖 的 C4羟 基 只 含 普 通 的 O，由 此 可 知 这 个 键 断 裂 在 D糖 基 的 C1和 E残基 的 糖 苷 键 的 O之 间 。 分 析 D-E键 周 围 的微 环 境 ， 最 活 泼 的 基 团 显 然 是 Asp52和Glu35， 它 们 分 别 位 于 糖 苷 键 两 侧 。Asp52位 于 糖 苷 键 的 一 侧 ， 而 Glu35在 另一 侧 。 这 两 个 酸 性 侧 链 具 有 明 显 不 同 的 微环 境 。 Asp52是 在 一 个 明 显 的 极 性环 境 中 ， 在 那 里 它 在 一

12、 个 复 杂 的 氢键 网 络 中 起 着 氢 键 受 体 的 作 用 。 相反 ， Glu35位 于 非 极 性 区 。 这 样 ，在 pH5下 ， 这 是 溶 菌 酶 水 解 几 丁 质的 最 适 pH， 即 溶 菌 酶 活 性 最 大 。Asp52侧 链 羧 基 为 解 离 的 COO-形 式 ，而 Glu35则 为 质 子 化 未 电 离 的COOH形 式 。 侧 链 基 团 的 氧 原 子 与这 个 糖 苷 键 的 距 离 大 约 是 0.3nm。 Phillips等 人 根 据 上 述 研 究 资 料 提 出 溶菌 酶 的 催 化 作 用 机 制 ， 要 点 如 下 ：（ 1） G

13、lu35的 COOH提 供 一 个 H+到 D环 和 E环 间 的 糖 苷 键 O原 子 上 。 H+的 转 移 使 D环 的 C1键 与 糖 苷 键 O原 子间 的 键 断 开 ， 并 形 成 正 C离 子 过 渡 态中 间 产 物 。 （ 2） 含 有 E及 F残 基 的 NAG二 聚 体 离 开酶 分 子 。（ 3） 正 碳 离 子 中 间 产 物 进 一 步 与 来 自溶 剂 的 OH-发 生 反 应 。 Glu35质 子 化 ， 由A、 B、 C和 D残 基 组 成 的 NAG四 聚 体 通过 扩 散 离 开 酶 分 子 ， 然 后 溶 菌 酶 为 新 一轮 催 化 过 程 做 好

14、了 准 备 。 上 述 的 催 化 机 制 中 ， 关 键 要 素 为 ： （ 1） 广 义 的 酸 催 化 ， Glu35以 酸 的形 式 提 供 质 子 ， 他 的 糖 苷 键 氧 原 子 的 距离 为 0.3nm， 正 式 合 适 的 作 用 距 离 。 （ 2） 正 碳 离 子 中 间 产 物 的 形 成 与 稳定 ， 一 方 面 由 于 Asp52带 有 负 电 荷 的 羧酸 基 通 过 静 电 相 互 作 用 稳 定 D环 中 C1的正 电 荷 ； 另 一 方 面 由 于 D环 的 形 变 ， 由椅 式 构 象 变 为 半 椅 式 ， 使 D环 上 C1、 C2、C5和 O都 在

15、一 个 平 面 上 ， 氧 原 子 的 负 电性 可 以 使 正 碳 离 子 稳 定 。 因 此 可 以 说 ，在 结 合 底 物 时 ， 酶 迫 使 底 物 采 取 了 接 近于 过 渡 态 的 构 象 。 随 着 DNA技 术 的 新 技 术 的 发 展 ， 使 以 前被 分 解 的 基 因 的 任 何 多 肽 的 中 间 缺 失 、添 加 或 替 换 成 为 了 可 能 。 通 过 定 点 诱 变技 术 的 使 用 ， DNA的 核 苷 酸 序 列 可 以 特殊 地 变 更 以 至 多 肽 的 氨 基 酸 可 以 被 任 何调 查 者 选 择 的 氨 基 酸 代 替 。 蛋 白 质 中

16、的任 何 氨 基 酸 可 以 被 替 代 ， 并 且 调 查 者 能确 定 所 有 蛋 白 质 分 子 产 生 的 持 续 的 变 更 。 最 早 把 定 点 诱 变 使 用 到 溶 菌 酶 研 究 的在 1989年 被 发 表 。 在 论 文 中 ， Asp52和 Glu35都 被 作 为 对 象 研 究 ， 研 究 是测 试 那 些 氨 基 酸 残 余 被 代 替 的 突 变 蛋白 质 的 活 性 。 像 先 前 研 究 的 预 期 结 果一 样 ， 这 些 突 变 蛋 白 质 只 有 很 少 甚 至没 有 催 化 活 性 。 Phillips根 据 晶 体 学 研 究 提 出 的 底 物 结合 方 式 和 催 化 作 用 机 制 ， 曾 在 各 种 化学 实 验 中 受 到 检 验 。 所 有 实 验 结 果 都支 持 这 个 晶 体 学 假 设 。 我 们 可 以 下 结 论 的 是 三 十 多 年前 Phillips所 提 出 的 反 应 过 程 是经 得 起 时 间 的 考 验 。 谢 谢 ！