工业微生物诱变育种

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1、 营 养 缺 陷 型 菌 株 的 筛 选野 生 型 菌 株 （ wild type strain） ： 从 自 然 界 分 离 到 的 微生 物 在 其 发 生 突 变 前 的 原 始 菌 株营 养 缺 陷 型 （ auxotroph)： 野 生 型 菌 株 经 过 人 工 诱 变 或自 然 变 异 失 去 合 成 某 种 必 需 营 养 （ 氨 基 酸 、 维 生 素 、核 苷 酸 等 ） 的 能 力 ， 只 有 在 基 本 培 养 基 中 补 充 所 缺乏 的 营 养 因 子 (生 长 因 子 )才 能 生 长 繁 殖原 养 型 （ prototroph） : 营 养 缺 陷 型 菌 株

2、经 过 回 复 突 变 或重 组 变 异 后 产 生 的 菌 株 ， 其 营 养 要 求 与 野 生 型 菌 株相 同 营 养 缺 陷 型 菌 株 筛 选 有 关 培 养 基l 基 本 培 养 基 （ minimal medium, MM） ： 仅 能 满 足 野 生 型菌 株 生 长 需 要l 完 全 培 养 基 （ plete medium, CM） ： 凡 可 以 满 足 一 切 营养 缺 陷 型 菌 株 营 养 需 要 的 天 然 或 半 合 成 培 养 基l 补 充 培 养 基 （ supplemental medium, SM） ： 只 能 满 足 相应 营 养 缺 陷 型 菌 株

3、 生 长 需 要 ， 是 在 基 本 培 养 基 中 加 入 了相 应 营 养 缺 陷 型 菌 株 所 不 能 合 成 的 营 养 因 子 。 5.1 营 养 缺 陷 型 菌 株 的 选 育 营 养 缺 陷 性 突 变 为 （ 单 一 ） 基 因 突 变 ，是 产 生 某 种 营 养 因 子 的 代 谢 途 径 中 某 个 关 键酶 合 成 基 因 突 变 造 成 相 应 酶 不 能 产 生 或 不 能发 挥 作 用 ， 从 而 造 成 相 应 营 养 因 子 不 能 产 生l 诱 发 突 变l 筛 选 1步 ： 淘 汰 野 生 型 菌 株l 筛 选 2步 ： 检 出 缺 陷 类 型l 筛 选

4、 3步 ： 鉴 别 缺 陷 种 类 5.1.1营 养 缺 陷 型 的 诱 变 多 用 亚 硝 基 胍 （ NTG） 、 UV、 亚 硝 酸 等 做 诱变 剂 ； 其 中 亚 硝 基 胍 （ NTG） 诱 发 营 养 缺 陷 型 的频 率 极 高 ， 一 般 可 达 10 ； 电 离 辐 射 损 伤 大 ， 一般 不 适 宜 做 营 养 缺 陷 型 诱 变 剂 ； 用 完 全 培 养 基 做后 培 养 5. 1.2 淘 汰 野 生 型 菌 株方 法 1： 抗 生 素 法 细 菌 ： 用 加 有 青 霉 素 的 基 本 培 养 基 分 离 培 养 诱 变 处 理后 的 菌 体 ， 野 生 型 菌

5、株 因 为 繁 殖 产 生 的 子 细 胞 不 能 合成 正 常 细 胞 壁 而 死 亡 ， 而 对 不 能 繁 殖 的 营 养 缺 陷 型 细胞 因 为 在 基 本 培 养 基 中 不 能 繁 殖 而 得 以 保 留 具 体 方 法 和 步 骤 见 P176 5. 1.2 淘 汰 野 生 型 菌 株方 法 1： 抗 生 素 法酵 母 菌 ： 用 加 有 制 霉 菌 素 基 本 培 养 基 分 离 培 养 诱 变 处 理 后的 菌 体 ， 制 霉 菌 素 抑 制 真 菌 细 胞 壁 中 甾 醇 合 成 ， 从 而使 繁 殖 中 的 细 胞 产 生 的 子 细 胞 死 亡 ， 保 留 营 养 缺

6、 陷 型细 胞 方 法 2： 菌 丝 过 滤 法 真 菌 和 放 线 菌 等 丝 状 菌 的 野 生 型 菌 株 在 基 本培 养 基 中 产 生 菌 丝 体 ， 而 营 养 缺 陷 型 菌 株 以 孢 子形 式 存 在 ， 不 能 萌 发 。 把 诱 变 处 理 后 的 孢 子 悬 液用 液 体 基 本 培 养 基 培 养 ， 适 温 振 荡 培 养 ， 使 野 生型 孢 子 萌 发 形 成 菌 丝 体 ， 用 灭 菌 脱 脂 棉 、 滤 纸 等除 去 菌 丝 体 ， 再 培 养 ， 再 过 滤 。 重 复 3 4次 ， 最大 限 度 地 除 去 野 生 型 菌 株 ， 然 后 再 分 离

7、方 法 3： 高 温 杀 菌 法 对 产 芽 孢 菌 ， 先 用 完 全 培 养 基 对 诱 变 后 的 菌株 培 养 到 产 生 芽 孢 ， 再 用 基 本 培 养 基 培 养 一 定 时间 ， 野 生 型 芽 孢 萌 发 成 营 养 细 胞 ， 缺 陷 型 芽 孢 不能 萌 发 ， 这 时 用 80 处 理 一 定 时 间 ， 野 生 型 营 养细 胞 被 杀 灭 ， 而 缺 陷 型 芽 孢 因 为 耐 热 而 存 活 。 5. 1.3 营 养 缺 陷 型 的 检 出方 法 1： 点 植 对 照 法 （ 见 图 7.12) 5. 1.3 营 养 缺 陷 型 的 检 出方 法 2： 影 印

8、法 （ 见 图 7.13) 5. 1.3 营 养 缺 陷 型 的 检 出方 法 3： 夹 层 法 （ 见 图 7.14) 5. 1.3 营 养 缺 陷 型 的 检 出方 法 3： 限 量 补 充 法 P178 在 基 本 培 养 基 中 补 充 微 量 营 养 缺 陷 型 菌 株 所不 能 合 成 的 营 养 物 质 ， 野 生 型 菌 株 生 长 快 、 菌 落大 ， 而 营 养 缺 陷 型 菌 株 生 长 慢 、 菌 落 小 。 5. 1.4 营 养 缺 陷 型 的 鉴 定 测 定 营 养 缺 陷 菌 株 所 需 营 养 因 子 的 种 类5. 1.4.1 鉴 定 方 法 方 法 一 ：

9、把 纯 化 好 的 缺 陷 型 菌 株 与 基 本 培 养 基 倒 混 合 平 板 或 涂 布 平 板 ， 再 在 平 板 上 点 接 各 种 营 养 物质 （ 最 好 稀 释 成 一 定 浓 度 ， 用 滤 纸 片 法 接 入 ） ，适 温 培 养 ， 观 察 生 长 圈 。 此 法 可 以 在 一 个 平 板 上对 一 株 菌 进 行 多 种 营 养 因 子 进 行 测 定 方 法 二 ： 在 基 本 培 养 基 中 加 入 某 种 营 养 物 质 ， 倒 混合 平 板 ， 再 点 接 菌 株 ， 观 察 生 长 圈 。 此 法 可 同 时对 多 个 菌 株 进 行 测 定 5. 1.4.

10、2 缺 陷 型 鉴 定 步 骤 营 养 因 子 类 别 测 定 营 养 因 子 种 类 测 定 复 证 试 验 步 骤 1： 缺 陷 型 营 养 因 子 类 别 测 定 ： 用 各 类 营 养 因 子的 代 表 物 质 的 混 合 物 ： 氨 基 酸 混 合 物 、 酪 素 水 解 物 或 代 表 氨 基 酸 类 酵 母 浸 汁 ， 其 中 氨 基 酸 、 维 生 素 、 碱 基 都 有 维 生 素 混 合 物 ， 代 表 维 生 素 类 核 酸 碱 基 混 合 物 ， 代 表 核 苷 酸 类 步 骤 2： 缺 陷 型 营 养 因 子 种 类 测 定 缺 陷 型 营 养 因 子 类 别 确 定

11、 后 ， 再 用 该 类 营 养因 子 的 各 种 代 表 物 质 纯 净 物 做 试 验 ， 以 确 定 其 缺陷 哪 一 种 或 几 种 营 养 因 子 。 可 以 先 把 该 类 物 质 分成 几 组 进 行 测 定 ， 逐 步 缩 小 范 围 ， 最 后 菌 体 测 定到 种 类 (P180) 常 用 浓 度 ： 氨 基 酸 110mg/mL;维 生 素 类0.010.1mg/mL 氨 基 酸 和 维 生 素 分 组 分 别 见 P182表 7.14和 表 7.15 5.2 营 养 缺 陷 型 突 变 株 的 应 用l 工 业 微 生 物 育 种 中 ， 用 于 积 累 代 谢 中 间

12、 产 物l 作 为 杂 交 、 重 组 育 种 的 遗 传 标 记l 用 于 微 生 物 代 谢 途 径 研 究l 在 转 化 、 转 导 、 原 生 质 体 融 合 、 质 粒 和 转 座 子 研究 中 用 作 标 记 菌 株 6 温 度 敏 感 突 变 株 的 筛 选 P184 温 度 敏 感 突 变 株 （ temperature-sensitive mutant, TS突 变 体 ） ： 突 变 株 在 一 定 温 度 范 围 内 （ 许 可 温 度 ） 正 常 生 长 ， 其 表 型和 野 生 型 没 有 区 别 ， 但 超 出 这 一 温 度 范 围 （ 非 许 可 温 度 ） ，

13、则 不 能 生 长 或 生 长 微 弱 甚 至 死 亡 （ 条 件 致 死 ） 或 某 些 代 谢停 止 或 减 弱 。 TS突 变 主 要 是 由 必 需 基 因 发 生 突 变 ， 致 使 该 基 因 在 一 定 温度 条 件 下 无 法 正 常 表 达 ， 或 其 编 码 的 酶 失 活 ， 造 成 细 胞 不能 正 常 生 长 。 6.1 TS突 变 株 的 选 育 方 法6.1.1 TS突 变 株 的 诱 发 TS突 变 主 要 由 基 因 错 义 突 变 所 致 ， 要 选 择 易 于 引起 碱 基 置 换 的 亚 硝 基 类 、 磺 酸 酯 类 化 合 物 ， 或 亚硝 酸 、

14、UV等 诱 变 剂 。6.1.2 淘 汰 野 生 型 菌 株 /TS菌 株 富 集 培 养 1 抗 生 素 法 ： 加 入 抗 生 素 ， 在 非 许 可 温 度 下 培 养一 定 时 间 ， 杀 灭 在 该 温 度 下 生 长 的 野 生 型 菌 株 ，再 离 心 除 去 抗 生 素 ， 分 离 2 其 它 方 法 (P185) H 3放 射 性 同 位 素 前 体 法 6.1.3 TS突 变 株 分 离 筛 选l 富 集 培 养 后 ， 用 完 全 培 养 基 先 在 许 可 温 度 下 培养 ， 再 用 影 印 法 、 点 植 法 等 方 法 在 许 可 温 度 和 非许 可 温 度 下

15、 分 别 培 养 ， 对 照 结 果 即 可 检 出 TS突 变体 ；l 也 可 同 一 平 板 先 在 非 许 可 温 度 培 养 ， 长 出 野 生型 菌 株 ， 做 好 记 号 ， 再 转 许 可 温 度 培 养 ， 则 后 长出 的 为 TS菌 株 。 6.2 TS突 变 株 在 发 酵 工 业 中 应 用6.2.1 在 谷 氨 酸 发 酵 中 的 应 用 增 加 谷 氨 酸 产 量 的 关 键 在 于 改 变 菌 体 的 细 胞 膜结 构 和 功 能 ， 通 过 一 些 有 效 方 法 使 谷 氨 酸 产 生 菌 由谷 氨 酸 非 积 累 型 转 变 为 积 累 型 。 Momose

16、 等 以 乳 糖 发 酵 杆 菌 NO2256为 出 发 菌株 ， 选 育 出 细 胞 膜 结 构 或 功 能 缺 损 的 TS突 变 株 88号 ， 通 过 温 度 来 调 节 细 胞 膜 透 性 。 当 在 许 可 温 度(30 )下 培 养 繁 殖 得 到 一 定 量 菌 体 后 ， 升 温 致 非 许可 温 度 (37 )培 养 ， 使 细 胞 膜 的 合 成 、 结 构 或 功 能发 生 障 碍 ， 结 果 突 变 株 能 在 高 浓 度 生 物 素 培 养 基 中分 泌 大 量 谷 氨 酸 。 6.2.2 TS突 变 株 在 丝 氨 酸 发 酵 中 的 应 用 P189 以 C1化

17、 合 物 为 唯 一 碳 源 的 微 生 物 合 成 细 胞 组分 是 通 过 丝 氨 酸 途 径 来 实 现 的 （ 见 图 7.19).要 提 高丝 氨 酸 产 量 ， 关 键 在 于 阻 断 丝 氨 酸 降 解 。 日 本 味之 素 公 司 的 Moringga筛 选 到 TS突 变 株 ， 它 们 在30 丝 氨 酸 降 解 正 常 ， 但 在 38 40 失 去 降 解 丝氨 酸 的 能 力 ， 因 而 大 量 分 泌 丝 氨 酸6.2.3 微 生 物 单 细 胞 蛋 白 （ SCP） 的 生 产 P 189 7 抗 噬 菌 体 菌 株 的 选 育7.1 噬 菌 体 概 述l噬 菌

18、体 的 特 点l烈 性 噬 菌 体 及 其 繁 殖l温 和 性 噬 菌 体 及 其 繁 殖 -溶 源 化l噬 菌 体 的 专 一 性l噬 菌 体 的 变 异 7.1 噬 菌 体 概 述l 专 一 性 噬 菌 体 的 获 得 、 纯 化l 噬 菌 斑l 烈 性 噬 菌 体 效 价 测 定 重 层 琼 脂 法 （ 见 P192图7.20) 每 mL中 所 含 有 的 侵 染 性 噬 菌 体 粒 子 数 称 为 效价 ， 单 位 为 U/mL 刺 突 tail pins噬 菌 体 形 态（ Phage, bacteriophage） 95nm95nm headnecktail（ 24环 ） 尾 丝

19、(tail fibers) 65nm 烈 性 噬 菌 体 繁 殖 -裂 解 途 径 JSU-micro 吸 附 ： 病 毒 表 面 的 结 合 蛋 白 与 细 胞 的 受 体 蛋 白 形 成 专 一 结合 。 病 毒 有 较 严 格 的 宿 主 专 一 性侵 入 与 脱 壳 ： 病 毒 粒 子 进 入 细 胞 并 蜕 去 衣 壳 ， 关 键 是 病 毒 核 酸进 入 细 胞 。 囊 膜 和 衣 壳 脱 去 ， 核 酸 释 放 ， 病 毒 粒 子 解 体释 放 ： 病 毒 粒 子 从 细 胞 中 释 放 ， （ 再 去 侵 染 周 围 的 其 它 细 ） 。 裂解 式 ： 细 胞 破 裂 ， 病

20、 毒 粒 子 一 起 释 放 ， 出 现 一 步 生 长 ； 温 和 式 ：细 胞 不 死 不 破 ， 病 毒 粒 子 逐 步 释 放 ， 囊 膜 病 毒 此 时 获 得 囊 膜生 物 合 成 ： 病 毒 核 酸 转 录 、 复 制 、 蛋 白 合 成 。 由 病 毒 遗 传 信 息“ 指 挥 ” ， 细 胞 执 行 ， 合 成 出 多 套 病 毒 核 酸 和 衣 壳 蛋 白装 配 ： 生 物 合 成 的 多 套 病 毒 核 酸 和 衣 壳 蛋 白 组 装 成 很 多 完 整 的病 毒 粒 子 。 依 靠 生 物 大 分 子 间 的 分 子 作 用 力 自 动 完 成 繁 殖 -烈 性 噬 菌

21、 体 的 裂 解 途 径 JSU-micro 噬 菌 斑 (plaque)： 在 培 养 敏 感 指 示 菌 的 平 板 上因 病 毒 繁 殖 而 使 一 定 区 域 的 菌 体 裂 解 ， 出 现 透 明 的 溶菌 斑 块 下 层 培 养 基 双 层 培 养 基敏 感 菌 +上 层 培 养 基噬 菌 体 稀 释 液 培 养噬 菌 斑噬 菌 斑 敏 感 菌 菌 苔 JSU-micro 双 层 平 板 法琼 脂 平 板 菌 液 +噬 菌 体 试 样 +琼 脂 培 养 基培 养 10天 计 数 噬 菌 斑噬 菌 斑 数 =单 位 试 样 中 噬 菌 体 数 噬 菌 斑 照 片 JSU-micro

22、繁 殖 温 和 噬 菌 体 的 溶 源 化 途 径有 些 噬 菌 体 侵 入 细 菌 后 ， 其 核 酸 能 整 合 到 细 菌染 色 体 上 , 成 为 前 噬 菌 体 ， 与 细 菌 染 色 体 一 起复 制 、 一 起 传 给 子 细 胞 。 这 类 噬 菌 体 称 为 温 和噬 菌 体 ， 这 种 繁 殖 途 径 称 为 溶 源 化 途 径 ； 含 有前 噬 菌 体 的 细 菌 称 为 溶 源 化 细 菌 。前 噬 菌 体 偶 尔 会 脱 离 细 菌 染 色 体 ， 自 行 消 失 ， 或进 入 裂 解 途 径 大 量 繁 殖 ， 裂 解 细 菌 JSU-micro 溶 源 菌 的 特

23、 性细 菌 的 溶 源 性 具 有 遗 传 性溶 源 菌 对 同 源 噬 菌 体 具 有 免 疫 性溶 源 性 细 菌 在 培 养 中 不 易 被 查 觉 非 溶 源 细 胞自 发 裂 解 和 诱 导 裂 解 ： 有 少 数 前 噬 菌 体可 自 发 或 诱 发 裂 解 宿 主 细 胞 ， 进 入 裂 解 途 径溶 源 性 细 胞 可 获 得 一 些 新 的 生 理 特 性复 愈 :溶 源 菌 失 去 前 噬 菌 体 烈 性 噬 菌 体 污 染 造 成 发 酵 工 业 损 失 严 重 ：轻 者 使 发 酵 周 期 延 长 、 产 量 下 降 ， 重 者 造 成 倒 罐温 和 噬 菌 体 污 染

24、 难 于 发 觉噬 菌 体 危 害 的 防 治 ： 定 期 更 换 菌 种 、 抗噬 菌 体 菌 株 选 育 、 药 物 防 治 JSU-micro 噬 菌 体 的 危 害 及 其 防 治 7.2 抗 噬 菌 体 菌 株 的 选 育 程 序 抗 噬 菌 体 菌 株 的 选 育 程 序 （ 以 专 一 噬 菌 体 做选 择 因 子 ） ： 菌 株 诱 变 处 理 分 离 在 含 有 噬 菌 体的 平 板 上 挑 取 抗 性 菌 落 ， 制 备 斜 面 菌 种 用含 有 噬 菌 体 的 液 体 培 养 基 摇 瓶 培 养 筛 选 （ 重 复 23次 ） 分 离 在 含 有 噬 菌 体 的 平 板

25、上 挑 取 抗 性菌 落 抗 性 菌 株 的 特 性 试 验 具 体 过 程 见 P195196 7.3 抗 噬 菌 体 菌 株 的 特 性 研 究7.3.1 抗 噬 菌 体 稳 定 性 试 验 ： 分 别 接 种 到 含 高 浓 度 噬菌 体 的 斜 面 培 养 基 、 种 子 培 养 基 和 发 酵 培 养 基 中培 养 一 定 时 间 ， 再 用 重 层 琼 脂 法 培 养 ， 看 是 否 出现 噬 菌 斑 ； 还 要 做 连 续 传 代 培 养 ， 看 抗 性 是 否 稳定 。7.3.2 抗 性 菌 株 的 产 量 性 能7.4 抗 噬 菌 体 菌 株 选 育 实 例 P197200

26、思 考 题1 名 词 解 释 ： 微 生 物 诱 变 育 种 ； 基 本 培 养 基 ； 完 全 培 养 基 ； 补 充 培 养 基 ； 营 养 缺 陷 型 菌 株 ； 温 度 敏 感 突 变 株2 微 生 物 诱 变 育 种 主 要 阶 段3 诱 变 前 的 主 要 准 备 工 作4 诱 变 育 种 的 主 要 步 骤5 最 适 剂 量 的 选 择 原 则6 突 变 株 筛 选 方 法 和 原 则7 自 身 产 物 耐 受 筛 选 法8 琼 脂 块 法 筛 选 方 法 的 原 理 和 步 骤9 淘 汰 野 生 型 菌 株 , 保 留 营 养 缺 陷 型 菌 株 的 方 法 和 原 理 10 营 养 缺 陷 型 的 鉴 定 方 法 , 图 示 和 文 字 说 明 11 营 养 缺 陷 型 的 鉴 定 步 骤