实时荧光定量PCR检测的数据处理及结果报告课件.ppt

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1、实 时 荧 光 定 量 PCR检 测的 数 据 处 理 及 结 果 报 告 卫 生 部 临 床 检 验 中 心 李 金 明 基 本 概 念l 线 性 基 线 期 (Linear base-line phase) 为 PCR扩 增 的 四 个 主要 阶 段 之 一 （ 图 ） 。 线 性 基线 期 为 扩 增 最 初 的 1015个 循环 ， 此 时 ， PCR反 应 处 于 起始 阶 段 ， 扩 增 产 物 很 少 ， 所产 生 的 荧 光 信 号 很 低 ， 因 此 ，基 线 荧 光 信 号 可 根 据 此 阶 段产 生 的 荧 光 信 号 来 计 算 。 基 本 概 念l 指 数 期 初

2、期 （ The beginning of exponential phase） 为PCR扩 增 的 四 个 主 要 阶 段 之一 （ 图 ） 。 进 入 扩 增 指 数 期初 期 ， 荧 光 强 度 达 到 一 个 阈值 ， 该 阈 值 通 常 为 基 线 荧 光信 号 均 值 标 准 差 的 10倍 。 扩增 达 到 阈 值 时 的 循 环 数 可 称为 CT（ ABI Prism有 关 文 献 ）或 CP（ LightCycler有 关 文献 ） 。 CT或 CP与 原 始 扩 增 模板 数 量 正 负 相 关 ， 可 通 其 与原 始 模 板 的 函 数 关 系 ， 来 计算 原 始 模

3、 板 的 数 量 。 基 本 概 念l 指 数 期 （ Exponential phase） 为 PCR扩 增 的 四个 主 要 阶 段 之 一 （ 图 ） 。PCR达 到 其 最 大 的 扩 增 阶段 ， 理 想 条 件 下 ， 每 一 循环 后 ， PCR产 物 倍 比 增 加 。 基 本 概 念l 平 台 期 （ Plateau phase） 为 PCR扩 增 的 四 个 主 要 阶段 之 一 （ 图 5-1） 。 扩 增达 到 平 台 期 ， 此 时 ， 荧 光信 号 不 再 随 扩 增 循 环 数 的增 加 而 增 加。 基 本 概 念l Ct值 （ threshold cycle）

4、 或 CP值 （ crossing point） Ct或 CP值 指 的 是 实 时 监 测 扩 增 过 程 的荧 光 信 号 达 到 指 数 扩 增 时 的 循 环 周 期 数 。 主 要的 计 算 方 式 是 以 扩 增 过 程 前 3到 15个 循 环 的 荧光 值 的 10倍 标 准 差 为 阈 值 ， 当 荧 光 值 超 过 阈 值时 的 循 环 数 则 为 阈 值 循 环 数 （ Ct） 。 有 实 验 证明 Ct值 与 样 本 中 的 原 始 拷 贝 数 成 正 比 关 系 。 Ct值 是 当 前 实 时 荧 光 PCR的 主 要 定 量 参 数 。 基 本 概 念l 扩 增 效

5、 率 E（ amplification efficiency） 扩 增效 率 指 的 是 一 个 循 环 后 的 产 物 增 加 量 与 这 个 循环 的 模 板 量 的 比 值 ， 其 值 位 于 0到 1之 间 。 在PCR的 前 20或 30个 循 环 中 ， E值 比 较 恒 定 ， 为指 数 扩 增 期 ， 随 后 E值 逐 步 降 低 ， 直 至 0， 此 时PCR达 到 平 台 期 ， 不 再 扩 增 。 扩 增 效 率 的 计 算可 以 采 用 系 列 稀 释 法 ， 将 稀 释 后 浓 度 的 对 数 值与 所 得 Ct值 做 图 ， 在 一 定 范 围 内 应 该 是 得

6、到 一条 直 线 ， 利 用 公 式 （ 1） ： E=10-1/K-1（ K为 该直 线 斜 率 ） 即 可 计 算 出 E值 。 基 本 概 念l 绝 对 定 量 （ Absolute quantitation） 绝 对 定 量 是 使 用 一 系 列 稀 释的 已 知 浓 度 的 标 准 品 与 临 床 标 本 同 时 进 行 测 定 ， 根 据 系 列 浓 度 标准 品 的 Ct值 与 起 始 模 板 （ RNA或 cDNA） 量 之 间 的 线 性 比 例 关 系 ，绘 制 标 准 曲 线 。 待 测 标 本 的 浓 度 则 可 根 据 其 测 定 的 Ct值 ， 从 标 准曲 线

7、或 回 归 方 程 计 算 得 到 原 始 模 板 的 数 量 。 这 种 方 法 是 假 定 所 有的 标 准 品 和 临 床 标 本 有 相 近 的 扩 增 效 率 。 系 列 稀 释 标 准 品 的 浓 度应 包 含 临 床 标 本 的 浓 度 范 围 ， 并 且 在 实 时 PCR仪 及 检 测 试 剂 方 法的 准 确 度 和 线 性 范 围 内 。 系 列 稀 释 的 标 准 品 最 好 是 RNA， 也 可 以 是 双 链 DNA片 段 、 单 链DNA或 载 有 靶 序 列 的 质 粒 。 标 准 品 必 须 是 纯 的 ， 与 RNA标 准 品 相比 ， DNA有 相 对 较

8、 好 的 稳 定 性 、 重 复 性 和 敏 感 性 ， 但 其 与 逆 转 录没 有 关 系 ， 不 能 反 映 逆 转 录 效 率 。 基 本 概 念l 相 对 定 量 （ Relative quantitation） 在 相 对 定量 中 ， 标 本 中 特 定 mRNA的 测 定 是 建 立 在 外 标或 参 比 样 本 （ 校 准 品 ） 的 基 础 上 的 。 当 使 用 校准 品 的 时 候 ， 定 量 测 定 结 果 可 表 示 为 靶 RNA/校 准 品 比 值 。 有 多 种 数 学 模 型 可 用 来 计 算 相 对定 量 测 定 的 平 均 正 态 化 的 基 因 表

9、达 。 使 用 不 同的 数 学 模 型 所 得 到 的 结 果 和 标 准 差 均 会 有 所 差异 。 表 5-1比 较 了 不 同 的 数 据 处 理 方 法 及 其 解释 。 基 本 概 念l 标 准 品 （ Standard） 用 来 构 建 标 准 曲 线 的 已知 浓 度 的 样 本 。l 参 比 （ Reference） 用 于 对 检 测 结 果 进 行 标 准化 的 被 动 （ Passive） 或 主 动 （ Active） 信 号 。如 内 标 和 外 标 即 为 主 动 性 参 比 的 例 子 。 主 动 性参 比 意 味 着 信 号 由 PCR扩 增 所 致 ， 主

10、 动 性 参 比有 其 自 己 的 引 物 和 探 针 。 被 动 性 参 比 则 为 非PCR所 致 ， 如 ROX染 料 ， 可 以 校 正 荧 光 信 号 的非 PCR波 动 。 基 本 概 念l 内 源 性 内 标 （ Endogenous control） 为 一 个 出 现 在 每一 个 实 验 样 本 中 的 特 定 RNA或 DNA， 通 过 使 用 内 源 性内 标 这 种 主 动 性 参 比 ， 对 于 加 入 到 每 一 个 反 应 中 的 总RNA量 的 差 异 ， 其 可 以 校 正 靶 mRNA的 定 量 。l 外 源 性 内 标 （ Exogenous contr

11、ol） 为 一 个 以 已 知 浓度 加 入 至 每 个 样 本 中 的 特 性 确 定 的 RNA或 DNA， 外 源性 主 动 性 参 比 通 常 为 体 外 构 建 的 ， 可 作 为 内 阳 性 质 控以 鉴 别 由 PCR抑 制 所 致 的 假 阴 性 。 外 源 性 参 比 也 可 用来 校 正 样 本 提 取 或 cDNA逆 转 录 合 成 的 效 率。 实 时 荧 光 PCR外 标 绝 对 定 量 的 数学 模 型l 在 实 时 荧 光 PCR中 ， 每 个 模 板 的Ct值 与 该 模 板 的起 始 拷 贝 数 的 对数 存 在 线 性 关 系 ，起 始 拷 贝 数 越 多

12、，Ct值 越 小 。 实 时 荧 光 PCR外 标 绝 对 定 量 的 数学 模 型l 利 用 已 知 起 始 拷 贝数 的 外 部 标 准 品 可做 出 标 准 曲 线 ， 在现 有 实 时 荧 光 PCR中 ， 大 部 分 以 纵 坐标 为 Ct值 ， 横 坐 标为 起 始 拷 贝 数 ， 少部 分 以 纵 坐 标 为 起始 拷 贝 数 ， 横 坐 标为 Ct值 。 实 时 荧 光 PCR外 标 绝 对 定 量 的 数学 模 型l 只 要 获 得 未 知 标本 的 Ct值 ， 即 可从 标 准 曲 线 上 计算 出 该 标 本 的 起始 拷 贝 数 ， 这 是采 用 外 标 进 行 实时

13、荧 光 PCR绝 对定 量 的 基 本 原 理 。 基 本 计 算 公 式 的 推 导 Yn = X ( 1+E )n (1)其 中 ， Yn 为 第 n个 循 环 后 扩 增 产 物 的 量 ， X为 原 模 板 数 ， E为扩 增 效 率 ， n为 扩 增 循 环 数 。在 扩 增 达 到 阈 值 线 时 ， 此 时 ， n = Ct， 于 是 ， 扩 增 产 物 的 量 为 ： YCt = X ( 1+E )Ct (2) YCt 为 荧 光 信 号 达 到 阈 值 强 度 时 扩 增 产 物 的 量 。 在 阈 值 线 设定 以 后 ， 它 就 是 一 个 常 数 。 （ 2） 式 两

14、边 同 时 取 对 数 ， 得 ： Log Y Ct = LogX ( 1+E )Ct (3) 亦 即 ： Log YCt = LogX +Ct Log ( 1+E ) （ 4） 基 本 计 算 公 式 的 推 导l 如 果 扩 增 效 率 为 100%， 亦 即 E=1， 扩 增 反应 管 中 原 始 拷 贝 数 为 10， 扩 增 产 物 达 到1000分 子 拷 贝 ， 则 预 计 的 Ct = （ Log 1000 -Log 10） = 2 = 6.64。 因 此 ， 如果 已 知 原 始 模 板 拷 贝 数 为 1， 扩 增 产 物 达1000分 子 拷 贝 时 ， 其 Ct 多 少

15、 ， 也 可 对 样 本 稀 释 后 再 检 测 ； 如 低 于 此 范 围 ，则 报 告 多 少 ， 如 103拷 贝 数 /ml， 而 不 能 报 告 为 0拷贝 数 /ml或 阴 性 。l 定 性 测 定 结 果 报 告 :报 告 “ 阳 性 ” 或 “ 阴 性 ” , “检 出 ”或 “ 未 检 出 ” , “反 应 ” 或 “ 未 反 应 ” 报 告 中 所 应 具 备 的 信 息l 标 题 ， 例 如 “ 检 测 报 告 ” l 报 告 的 唯 一 性 标 识 （ 如 序 号 ） l 检 测 标 本 的 特 性 和 状 态 l 检 测 标 本 的 接 收 时 间 和 进 行 检 测 的 时 间l 采 用 的 检 测 方 法 l 实 验 操 作 及 校 核 人 员 的 签 字 ， 以 及 签 发 日 期 l 检 测 报 告 中 应 给 出 参 考 结 果 或 范 围 谢 谢！