选修三基因工程 1.1 DNA重组技术的基本工具

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1、选修三选修三 基因工程基因工程 1.1 1.1 DNADNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具设想一能否培养出具有抗虫性状的抗虫棉呢？能否培养出具有抗虫性状的抗虫棉呢？能否让细菌能否让细菌“吐出吐出”蚕丝蚕丝？设想二能否让微生物产生出人的胰岛素、干能否让微生物产生出人的胰岛素、干扰素等珍贵的药物？扰素等珍贵的药物？设想三经过多年的努力，科学家于20世纪70年代创立了可以定向改造生物的新技术基因工程。基因工程的概念基因工程的概念基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过过体外体外DNADNA重组和转基因重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗等技

2、术，赋予生物以新的遗传特性，创造出传特性，创造出更符合人们需要更符合人们需要的新的生物类型和生的新的生物类型和生物产品。物产品。基因工程的别名基因工程的别名基因拼接技术或基因拼接技术或DNADNA重组技术重组技术操作环境操作环境生物体外生物体外操作对象操作对象基因基因操作水平操作水平DNADNA分子水平分子水平基本过程基本过程剪切剪切拼接拼接导入导入表达表达实质实质基因重组基因重组结果结果人类需要的基因产物人类需要的基因产物解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？“分子手术刀分子手术刀”限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶关键步骤一：从苏云金芽孢杆菌细胞内提取抗

3、虫基因关键步骤一：从苏云金芽孢杆菌细胞内提取抗虫基因关键步骤二：抗虫基因与运载体关键步骤二：抗虫基因与运载体“缝合缝合”成重组成重组DNADNA关键步骤三：将抗虫基因导入棉花细胞关键步骤三：将抗虫基因导入棉花细胞“分子缝合针分子缝合针”DNADNA连接酶连接酶“分子运输车分子运输车”基因进入受体细胞的基因进入受体细胞的载载体体1.11.1、DNADNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具一、限制性核酸内切酶一、限制性核酸内切酶“分子手术分子手术刀刀”分布：作用特点：切点：结果：举例：形成两种末端形成两种末端：黏性末端黏性末端或平末端或平末端主要在主要在原核生物原核生物中中特异性（专一性），即识

4、别特异性（专一性），即识别特定核苷特定核苷酸序列酸序列，切割特定位点，切割特定位点磷酸二酯键磷酸二酯键EcoEcoRIRI限制酶能识别限制酶能识别GAATTCGAATTC序列，并在序列，并在G G和和A A之间切开之间切开末端类型末端类型：一、限制性核酸内切酶一、限制性核酸内切酶“分子手术分子手术刀刀”伸出的核苷酸伸出的核苷酸之间正之间正好好互补配对互补配对，这样的，这样的切口叫切口叫黏性末端黏性末端限制酶在原核生物中的作用限制酶在原核生物中的作用 原核生物容易受到自然界外源原核生物容易受到自然界外源DNADNA的入侵，但的入侵，但是，生物在长期的进化过程中形成了一套完善是，生物在长期的进化过

5、程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNADNA侵侵入时，会利用限制酶将外源入时，会利用限制酶将外源DNADNA切割掉，切割掉，以保以保证自身的安全。证自身的安全。含有某种限制酶的细胞，其含有某种限制酶的细胞，其DNADNA分子中或者不分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。限制酶不能将其切开。要想获得某个特定性状的

6、基因必须要用限制要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？酶切几个切口？可产生几个黏性末端？要切要切2个切口个切口，产生，产生4个黏性末端个黏性末端。如果把两种来源不同的如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶用同一种限制酶来切割，会怎样呢？来切割，会怎样呢？会产生会产生相同的黏性末端相同的黏性末端，然后让两者的黏性末，然后让两者的黏性末端端黏合黏合起来，可以合成起来，可以合成重组的重组的DNA分子分子。讨论：讨论：分子缝合针：分子缝合针：DNADNA连接酶连接酶G A A T T CC T T A A GG A A T T CC T T A A GG C T T

7、 A A A A T T C GG C T T A A A A T T C GG C T T A A A A T T C G用同种限制酶切割DNADNA连接酶的作用是：连接酶的作用是：将互补配对的两个黏性末端连接起来，将互补配对的两个黏性末端连接起来，生成生成磷酸二酯键磷酸二酯键，使之成为一个完整的，使之成为一个完整的DNADNA分子。分子。二、二、DNADNA连接酶连接酶“分子缝合分子缝合针针”C T T A AG A A T T CG 可把可把黏性末端黏性末端之间的之间的缝隙缝隙“缝合缝合”起来，起来，EcoliDNA连接酶或T4DNA连接酶即即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷恢复被限

8、制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键酸二酯键T4 DNA连接酶连接酶还可把还可把平末端之间的缝隙平末端之间的缝隙“缝合缝合”起来，但效率较低起来，但效率较低T T4 4DNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA连接酶连接酶区别区别1 1区别区别2 2相同点相同点寻根问底寻根问底DNA连接酶与连接酶与DNA聚合酶是一回事吗聚合酶是一回事吗?为什么为什么?1)1)只能将只能将单个核苷酸单个核苷酸连连接到已有的核酸片段上，接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键形成形成磷酸二酯键磷酸二酯键1)1)在在两个两个DNADNA片段之片段之间间形成磷酸二酯键形成磷酸二

9、酯键2)2)以以一条一条DNADNA链为模板链为模板，将将单个核苷酸单个核苷酸通过磷酸通过磷酸二酯键连接成一条互补二酯键连接成一条互补的的DNADNA链链2)2)将将DNADNA双链上的双链上的两个两个缺口同时连接缺口同时连接起来，起来，不需要模板不需要模板酶的种类作用底物作用实质形成产物限制酶DNA连接酶DNA聚合酶DNA解旋酶与与DNADNA几种有关的四种酶几种有关的四种酶DNA分子DNA分子片段脱氧核苷酸DNA分子切断磷酸二酯键形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键断开碱基对之间的氢键氢键DNA片段(平末端或黏性末端）重组DNA分子与亲代DNA分子相同的DNA分子形成单链DNA运载体的作用：运载体

10、的作用：携带目的基因进入受体细胞，使目的基因在受体细携带目的基因进入受体细胞，使目的基因在受体细胞中稳定存在并表达。胞中稳定存在并表达。三、基因的运载体三、基因的运载体“分子运输车分子运输车”能否用能否用SARS病毒作为基因载体？病毒作为基因载体？作为载体，若没有切割位点将怎样？作为载体，若没有切割位点将怎样？携带目的基因的载体是否进入了受体细胞，携带目的基因的载体是否进入了受体细胞，如何鉴定？如何鉴定？假如目的基因导入受体细胞后不能复制，假如目的基因导入受体细胞后不能复制，将怎样？将怎样？从化学组成看，载体应含有什么成分？从化学组成看，载体应含有什么成分？双链双链DNADNA不能不能不能进行

11、不能进行DNADNA重组重组载体上应有标记基因载体上应有标记基因可能造成基因丢失可能造成基因丢失运载体必须具备的条件：运载体必须具备的条件：1、能够在宿主细胞中复制并稳定地保存；、能够在宿主细胞中复制并稳定地保存；2、具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接；、具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接；3、具有某些标记基因，便于进行筛选。（如抗菌素、具有某些标记基因，便于进行筛选。（如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等）4、对受体细胞无害、对受体细胞无害运载体的作用：运载体的作用：携带目的基因进入受体细胞，使目的基因在受体细携带目的基因进入受体细胞，使目

12、的基因在受体细胞中稳定存在并表达。胞中稳定存在并表达。常用的运常用的运载体有：体有：质粒，粒，噬菌体的衍生物，噬菌体的衍生物，动植物病毒等植物病毒等三、基因的运载体三、基因的运载体“分子运输车分子运输车”最常用的运载体最常用的运载体质粒质粒分布：存在于许多分布：存在于许多细菌细菌以及以及酵母菌酵母菌等生物中等生物中;最最常用的质粒是常用的质粒是大肠杆菌的质粒大肠杆菌的质粒。本质：细胞染色体本质：细胞染色体(或拟核或拟核)外外能自主复制能自主复制的小的小型环状型环状DNADNA分子。分子。真正被用作真正被用作载体的体的质粒，都是在天然粒，都是在天然质粒的基粒的基础上上进行行人工改造的。人工改造的

13、。基因的运输工具基因的运输工具质粒质粒能复制并带着能复制并带着插入的目的基插入的目的基因一起复制因一起复制有切割位点有切割位点有标记基因的有标记基因的存在，将来可存在，将来可用含青霉素的用含青霉素的培养基鉴别。培养基鉴别。抗四环素基因抗四环素基因重组重组DNA四环素四环素生长被抑制生长被抑制正常生长正常生长四环素四环素1 1、基因工程的步骤？、基因工程的步骤？预习预习1.21.2：2 2、基因库、基因文库、基因组文库、部分基因文、基因库、基因文库、基因组文库、部分基因文库、库、cDNAcDNA文库的区别？文库的区别？3 3、PCRPCR反应的过程，三个温度；反应的过程，三个温度；4 4、基因表达载体各部分的作用；、基因表达载体各部分的作用；