细胞分离与胞内产物的溶解生物分离工程

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1、第 十 五 章细 胞 破 碎 生 物 分 离 过 程 的 一 般 流 程本章内容 常见的细胞壁结构细胞破碎技术包涵体的纯化方法本章的主要内容 概 述不 同 类 型 的 细 胞 分 泌 目 标 产 物 的 类 型 ：l 动 物 细 胞 多 分 泌 到 细 胞 外 培 养 液l 植 物 细 胞 多 为 胞 内 产 物l 微 生 物 （ 细 菌 /酵 母 /真 菌 ） 胞 内 、 胞 外 对 于 胞 内 产 物 需 要 收 集 菌 体 或 细 胞 进 行破 碎 。 概 述(大 多 数 情 况 下 ， 抗 生 素 ， 胞 外 酶 ， 一 些 多 糖 ，及 氨 基 酸 等 目 标 产 物 存 在 于 发

2、 酵 液 中 。(有 些 目 标 产 物 存 在 于 生 物 体 中 。l尤 其 是 由 基 因 工 程 菌 产 生 的 大 多 数 蛋 白 质 是在 细 胞 内 沉 积 。l脂 类 物 质 和 一 些 抗 生 素 包 含 在 生 物 体 中 。 概 述细 胞 破 碎 （ cell rupture） 技 术 是 指 利 用 外 力 破坏 细 胞 膜 和 细 胞 壁 ， 使 细 胞 内 物 质 包 括 目 的 产物 成 分 释 放 出 来 的 技 术 。细 胞 破 碎 技 术 是 分 离 纯 化 细 胞 内 合 成 的 非 分 泌型 生 化 物 质 （ 产 品 ） 的 基 础 。为 了 研 究

3、细 胞 破 碎 ， 提 高 其 破 碎 率 ， 有 必 要 了解 各 种 微 生 物 细 胞 壁 的 组 成 和 结 构 。 15.1 细 胞 壁 结 构 对 破 碎 的 影 响Z微 生 物 细 胞 和 植 物 细 胞 外 层 均 为 细 胞 壁 ， 细 胞壁 里 面 是 细 胞 膜 ， 动 物 细 胞 没 有 细 胞 壁 ， 仅 有细 胞 膜 。Z通 常 细 胞 壁 较 坚 韧 ， 细 胞 膜 脆 弱 ， 易 受 渗 透 压冲 击 而 破 碎 ， 因 此 细 胞 破 碎 的 阻 力 主 要 来 自 于细 胞 壁 。Z不 同 细 胞 壁 的 结 构 和 组 成 不 完 全 相 同 ， 故 细

4、胞壁 的 机 械 强 度 不 同 ， 细 胞 破 碎 的 难 易 程 度 也 就不 同 。 细 菌 细 胞 壁 结 构 Z几 乎 所 有 细 菌 的 细 胞 壁 都 是由 肽 聚 糖 组 成 ， 它 是 难 溶 性的 聚 糖 链 ；Z相 邻 聚 糖 链 上 的 短 肽 又 交 叉相 联 ， 构 成 了 细 胞 壁 的 三 维网 状 结 构 ， 包 围 在 细 胞 周 围 ；Z使 细 胞 具 有 一 定 的 形 状 和 强度 。 细 菌 细 胞 壁 结 构u 破 碎 细 菌 的 主 要 阻 力 是 来 自 于 肽 聚 糖 的 网 状 结 构 ，其 网 结 构 的 致 密 程 度 和 强 度 取

5、决 于 聚 糖 链 上 所 存在 的 肽 键 的 数 量 和 其 交 联 的 程 度 。u 革 兰 氏 阴 性 菌 的 细 胞 壁 结 构 与 革 兰 氏 阳 性 菌 有 很 大不 同 。 u 革 兰 氏 阴 性 菌 典 型 的 生 物 是 大 肠 杆 菌 ， 通 过 这 种细 胞 生 产 了 很 多 细 胞 重 组 的 产 物 。药 物 名 称 宿 主 用 途胰 岛 素 大 肠 杆 菌 治 疗 糖 尿 病人 生 长 激 素 大 肠 杆 菌 治 疗 侏 儒 病 -干 扰 素 大 肠 杆 菌 治 疗 毛 状 细 胞 白 血 病 等 酵 母 细 胞 壁 的 结 构 示 意 图u最 里 层 是 由

6、葡 聚 糖 的 细 纤 维组 成 ， 它 构 成 了 细 胞 壁 的 刚性 骨 架 ， 使 细 胞 具 有 一 定 的形 状 ，u上 面 的 是 一 层 糖 蛋 白 ， u最 外 层 是 甘 露 聚 糖 ， 由 1,6-磷 酸 二 酯 键 连 接 成 网 状 。 在该 层 的 内 部 ， 有 甘 露 聚 糖 -酶 的 复 合 物 。u破 碎 酵 母 细 胞 壁 的 阻 力 主 要决 定 于 壁 结 构 交 联 的 紧 密 程度 和 它 的 厚 度 。 真 菌 的 细 胞 壁l 真 菌 的 细 胞 壁 较 厚 ， 主 要 由 多 糖 组 成 ， 其 次还 含 有 较 少 量 的 蛋 白 质 和

7、脂 类 。l 不 同 的 真 菌 ， 细 胞 壁 的 组 成 有 很 大 的 不 同 ，其 中 大 多 数 真 菌 的 多 糖 壁 是 由 几 丁 质 和 葡 聚糖 构 成 ， 少 数 含 纤 维 素 。l 与 酵 母 和 细 菌 的 细 胞 壁 一 样 ， 真 菌 细 胞 壁 的强 度 和 聚 合 物 的 网 状 结 构 有 关 ， 不 仅 如 此 ，它 还 含 有 几 丁 质 或 纤 维 素 的 纤 维 状 结 构 ， 所以 强 度 有 所 提 高 。 l 红 面 包 霉 菌 细 胞 壁 具 有 同 心 圆 层状 结 构 主 要 存 在 三 种 聚 合 物l 最 外 层 (a)是 -和 -

8、葡 聚 糖 的混 合 物 ，l 第 2层 (b)是 糖 蛋 白 的 网 状 结 构l 第 3层 (c)主 要 是 蛋 白 质 ，l 最 内 层 (d)主 要 是 几 丁 质 。红 面 包 霉 菌 细 胞 壁 的 结 构 示 意 图 微 生物 革 兰 氏阳 性 细 菌 革 兰 氏阴 性 细 菌 酵 母 菌 霉 菌壁 厚 20-80 nm 10-13 nm 100-300nm 100-250nm层 次 单 层 多 层 多 层 多 层主 要组 成 肽 聚 糖 (40-90%)多 糖胞 壁 酸蛋 白 质脂 多 糖 (1-4%) 肽 聚 糖 (5-10%)脂 蛋 白脂 多 糖 (11-22%)磷 脂蛋

9、白 质 葡 聚 糖 (30-40%)甘 露 聚 糖 (30%)蛋 白 质 (6-8%)脂 类 (8.5-13.5%) 多 聚 糖(80-90%)脂 类蛋 白 质细胞壁的组成和结构微 生物 革 兰 氏阳 性 细 菌 革 兰 氏阴 性 细 菌 酵 母 菌 真 菌壁 厚层 次 单 层 多 层 多 层 多 层主 要组 成 肽 聚 糖多 糖胞 壁 酸蛋 白 质脂 多 糖 肽 聚 糖脂 蛋 白脂 多 糖磷 脂蛋 白 质 葡 聚 糖甘 露 聚 糖蛋 白 质脂 类 多 聚 糖脂 类蛋 白 质细胞壁的组成和结构 植 物 细 胞 壁 的 结 构l 对 于 已 生 长 结 束 的 植 物 细 胞 壁 可 分 为 初

10、 生 壁 和 次 生壁 两 部 分 。l 初 生 壁 是 细 胞 生 长 期 形 成 的 。 初 生 壁 一 般 较 薄 （ 13 m） ， 富 有 弹 性 。l 由 多 糖 和 蛋 白 质 构 成 ， 多 糖 主 要 成 分 为 纤 维 素 、 半纤 维 素 和 果 胶 类 物 质 。 纤 维 素 是 长 链 D-葡 聚 糖 ， 许多 这 样 的 长 链 形 成 微 纤 丝 。 l 它 是 构 成 细 胞 壁 的 骨 架 ， 细 胞 壁 的 机 械 强 度 主 要 来自 于 微 纤 丝 。 植 物 次 生 细 胞 壁 某 些 植 物 细 胞 ， 当 生 长 停 止 后 ， 在 细 胞 质 和

11、 初 生细 胞 壁 之 间 形 成 了 次 生 细 胞 壁 。 次 生 壁 一 般 较 厚(4 m以 上 )， 常 有 三 层 组 成 。n 在 次 生 壁 中 ， 纤 维 素 和 半 纤 维 素 含 量 比 初 生 壁 增加 很 多 ， 纤 维 素 的 微 纤 丝 排 列 得 更 紧 密 和 有 规 则 ，而 且 存 在 木 质 素 的 沉 积 。 因 此 次 生 壁 的 形 成 提 高 了 细 胞 壁 的 坚 硬 性 ，使 植 物 细 胞 具 有 很 高 的 机 械 强 度 。 研 磨15.2 细 胞 破 碎 技 术 机 械 破 碎 捣 碎 法研 磨 法匀 浆 法超 声 法 物 理 破 碎

12、 温 度 差 破 碎 法压 力 差 破 碎 法化 学 破 碎 有 机 溶 剂 ：表 面 活 性 剂 ：酸 碱酶 促 破 碎 自 溶 法外 加 酶 制 剂 法通 过 机 械 运 动 产 生 的 剪 切力 ， 使 组 织 、 细 胞 破 碎 。通 过 各 种 物 理 因 素 的 作 用 ，使 组 织 、 细 胞 的 外 层 结 构 破坏 ， 而 使 细 胞 破 碎 。通 过 各 种 化 学 试 剂 对 细 胞膜 的 作 用 ， 而 使 细 胞 破 碎通 过 细 胞 本 身 的 酶 系 或 外加 酶 制 剂 的 催 化 作 用 ， 使细 胞 外 层 结 构 受 到 破 坏 ，而 达 到 细 胞 破

13、碎细 胞 破 碎 方 法 及 其 原 理 一 机 械 法机 械 破 碎 法 又 可 分 为高 压 匀 浆 破 碎 法 （ homogenization）高 速 珠 研 磨 破 碎 法 （ bead grinding）超 声 波 破 碎 法 （ ultrasonication） 采 用 高 压 匀 浆 器 （ 由 高 压 泵 和 匀 浆 阀 组 成 ） 。1.高 压 匀 浆 法（ High-pressure homogenization）细 胞 悬 浮 液 自 高 压 室 针形 阀 喷 出 时 ， 每 秒 速 度高 达 几 百 米 ， 高 速 喷 出的 浆 液 又 射 到 静 止 的 撞击 环

14、上 ， 被 迫 改 变 方 向从 出 口 管 流 出 。 细 胞 在这 一 系 列 高 速 运 动 过 程中 经 历 了 高 速 剪 切 、 碰撞 及 压 力 骤 降 ， 造 成 细胞 破 碎 。 高 压 匀 浆 器 的 种 类高 压 匀 浆 器 的 种 类 较 多 ：p WAB公 司 的 AVP Gaulin 31MR型p Bran and luebbe 公 司 SHL40型p 意 大 利 Niro Soavi高压匀浆机 高 压 匀 浆 法 使 用 时 注 意 事 项u 高 压 匀 浆 器 的 操 作 温 度 上 升 约 - /10MPa为 了 控 制 温 度 的 升 高 ， 可 在 进 口

15、 处 用 干 冰 调 节温 度 ， 使 出 口 温 度 调 节 在 20 左 右 。u 可 以 采 用 单 次 通 过 匀 浆 器 或 多 次 循 环 通 过 等 方式 。u 在 工 业 规 模 的 细 胞 破 碎 中 ， 对 于 酵 母 等 难 破 碎的 及 浓 度 高 或 处 于 生 长 静 止 期 的 细 胞 ， 常 采 用多 次 循 环 的 操 作 方 法 。 高 压 匀 浆 法 适 用 的 范 围大 规 模 细 胞 破 碎 的 常 用 方 法 高 压 匀 浆 法 适 用 的 范 围 ： 酵 母 和 大 多 数 细 菌 细 胞 的 破 碎 ； 料 液 细 胞 浓 度 可 以 很 高 ，

16、 20%左 右 。 不 宜 使 用 高 压 匀 浆 法 。 易 造 成 堵 塞 的 团 状 或 丝 状 真 菌 ， 较 小 的 革 兰 氏 阳 性 菌 ， 含 有 包 含 体 的 基 因 工 程 菌 （ 因 包 含 体 坚 硬 ， 易 损 伤 匀浆 阀 ） 影 响 高 压 匀 浆 器 细 胞 破 碎 因 素被 破 碎 的 细 胞 分 率 符 合 如 下 公 式 ： ln1/(1-R)=KNP (15-1) 式 中 R 破 碎 率 ， 为 N次 循 环 后 ， 蛋 白质 的 释 放 量 Rn与 最 大 释 放 量 Rm之 比 ； K 与 温 度 有 关 的 速 度 常 数 ； P 操 作 压 力

17、 ， MPa； 与 微 生 物 种 类 有 关 的 常 数 。 l升 高 压 力 有 利 于 破 碎 ， 减 少 细 胞 的 循 环 次 数 ， 甚 至 一 次 通 过 匀 浆 阀 就 可 达 到 几乎 完 全 的 破 碎 ， 这 样 就 可 避 免 细 胞 碎 片 不 至 过 小 。 但 p大 到 一 定 值 时 对 匀 浆 器 的 磨 损 增 加 ， 也 有 实 验 表 明 p超 生 一 定 值 时 ， R增 加 但 很 慢 。 在 工 业 生 产 中 ， 通 常 采 用 的 压 力 为 55 70Mpa。l破 碎 性 能 还 随 菌 体 种 类 和 生 长 环 境 的 不 同 而 不 同

18、大 肠 杆 菌 的 细 胞 比 酵 母 细 胞 容 易 破 碎 ，生 长 在 简 单 的 合 成 培 养 基 上 的 大 肠 杆 菌 比 生 长 在 复 杂 培 养 基上 容 易 破 碎 。影响高压匀浆器细胞破碎因素 高 压 匀 浆 法 -X-挤 压 器l 改 进 的 高 压 方 法 ： 将 浓 缩 的 菌 体 悬 液 冷 却 至 -25 至 -30 形 成 冰 晶 体 ， 利 用 500MPa以 上 的高 压 冲 击 ， 冷 冻 细 胞 从 高 压 阀 小 孔 中 挤 出 。l 细 胞 破 碎 是 由 于 冰 晶 体 在 受 压 时 的 相 变 ， 包 埋在 冰 中 的 细 胞 变 形 所

19、引 起 的 。l 主 要 用 于 实 验 室 中 。l 优 点 是 适 用 的 范 围 广 ， 破 碎 率 高 ， 细 胞 碎 片 的粉 碎 程 度 低 以 及 活 性 的 保 留 率 高 l 对 冷 冻 一 融 解 敏 感 的 生 化 物 质 不 适 用 。 2） 珠 磨 法 bead millu珠 磨 是 常 用 的 方 法u 细 胞 悬 浮 液 与 极 细 的 玻 璃 小珠 、 石 英 砂 、 氧 化 铝 等 研 磨剂 （ 直 径 小 于 1mm） 一 起 快 速搅 拌 或 研 磨 ， 研 磨 剂 、 珠 子与 细 胞 之 间 的 互 相 剪 切 、 碰撞 ， 使 细 胞 破 碎 ， 释

20、 放 出 内含 物 。 u 在 工 业 规 模 的 破 碎 中 ， 常 采用 高 速 珠 磨 机 WSK卧 式 高 效 全 能 珠 磨 机 高 速 珠 磨 机 工 作 原 理l 磨 室 内 放 置 玻 璃 小 珠 ， 装 在 同 心 轴 上 的 园 盘 搅 拌 器高 速 旋 转 ， 使 细 胞 悬 浮 液 和 玻 离 小 珠 相 互 搅 动 ；l 细 胞 破 碎 是 由 剪 切 力 层 之 间 的 碰 撞 和 磨 料 滚 动 引 起l 在 出 口 处 ， 旋 转 园 盘 和 出 口 平板 之 间 的 狭 缝 很 小 ， 可 阻 挡 玻离 小 珠 ， 使 不 被 料 液 带 出 。l 由 于 操

21、 作 过 程 中 会 产 生 热 量 ，故 磨 室 还 装 有 冷 却 夹 套 ， 以 冷却 细 胞 悬 浮 液 和 玻 离 小 珠 。 Netzsch LM-20型 珠 磨 机A-具有冷却夹套的圆筒形磨室B-具有冷却装置的搅拌轴和圆盘C-环形震动侠缝分离器D-变速马达1和2料液进出口 3和4 搅拌冷却剂进出口5和6磨室冷却剂进出口l 园 盘 以 两 种 位 置 交 错 地 安 装 在 轴 上 ，l 一 种 处 于 径 向 ， 一 种 与 轴 倾 斜 ，l 径 向 盘 使 磨 料 沿 径 向 运 动 ， 倾 斜 盘 则 产 生 轴 向 运 动 。l 由 于 交 错 的 运 动 ， 提 高 了

22、破 碎 效 率 。 珠 磨 机 破 碎 作 用 方 程u 破 碎 作 用 是 相 对 于 时 间 的 一 级 反 应 速 度 过 程 ，符 合 下 列 公 式 ： ln1/(1-R)=Kt 15-2 u R 破 碎 率 ； K一 一 级 反 应 速 度 常 数 ； t一 时 间 。u K与 搅 拌 转 速 、 细 胞 悬 浮 液 浓 度 和 循 环 速 度 、 玻 璃 小 珠装 量 和 珠 体 直 径 ， 以 及 温 度 等 相 关 。珠 磨 法 的 破 碎 率 一 般 控 制 在 80%以 下 ： 降 低 能 耗 、 减 少 大 分子 目 的 产 物 的 失 活 、 减 少 由 于 高 破

23、碎 率 产 生 的 细 胞 小 碎 片 不易 分 离 而 给 后 续 操 作 带 来 的 困 难 。 3） 超 声 波 破 碎l 超 声 波 破 碎 法 （ Ultrasonication)利 用 超 声 波振 荡 器 发 射 的 15-25kHz的 超 声 波 探 头 处 理 细 胞悬 浮 液 。l 超 声 波 振 荡 器 以 可 分 为 槽 式 和 探 头 直 接 插 入 介质 两 种 型 式 ， 一 般 破 碎 效 果 后 者 比 前 者 好 。 l 超 声 波 的 细 胞 破 碎 效 率 与 细 胞 种 类 、 浓 度 和 超声 波 的 声 频 、 声 能 有 关 。 超 声 波 破

24、碎 的 机 理 JY92-II D超 声 波细 胞 粉 碎 机( 一 般 认 为 在 超 声 波 作 用 下 液 体 发 生 空 化 作 用（ cavitation),( 液 体 中 局 部 空 穴 的 形 成 、 增 大 和 闭 合 产 生 极 大的 冲 击 波 和 剪 切 力 ， 引 起 的 粘 滞 性 旋 涡 在 细 胞上 造 成 了 剪 切 力 ， 使 细 胞 内 液 体 发 生 流 动 ， 从而 使 细 胞 破 碎 。( 操 作 过 程 产 生 大 量 的 热 ， 因 此 操 作 需 在 冰 水 或外 部 冷 却 的 容 器 中 进 行 。 超 声 波 破 碎 的 适 用 范 围 超

25、 声 波 破 碎 是 很 强 烈 的 破 碎 方 法 ， 适 用 于 多 数微 生 物 的 破 碎 。 一 般 杆 菌 比 球 菌 易 破 碎 ， G-细 菌 比 G+细 菌 易 破碎 ， 对 酵 母 菌 的 效 果 较 差 。 但 超 声 波 产 生 的 化 学 自 由 基 团 能 使 某 些 敏 感 性活 性 物 质 失 活 。 超 声 波 破 碎 的 有 效 能 量 利 用 率 极 低 由 于 对 冷 却 的 要 求 相 当 苛 刻 ， 所 以 不 易 放 大 ，但 。 技 术 原 理 效 果 成 本 举 例匀 浆 法(孔 型 ) 须 使 细 胞 通 过 的 小孔 ， 使 细 胞 受 到

26、 剪切 力 而 破 碎 剧 烈 适 中 细 胞 悬 浮 液 大 规 模处 理珠 磨 破 碎法 细 胞 被 玻 璃 珠 或 铁珠 捣 碎 剧 烈 便 宜 细 胞 悬 浮 液 和 植 物细 胞 的 大 规 模 处 理超 声 波 法 用 超 声 波 的 空 穴 作用 使 细 胞 破 碎 适 中 昂 贵 细 胞 悬 浮 液 小 规 模处 理研 磨 法 细 胞 被 研 磨 物 磨 碎 适 中 便 宜匀 浆 法(片 型 ) 细 胞 被 搅 拌 器 劈 碎 适 中 适 中 动 物 组 织 及 动 物 细胞不同机械破碎方法的比较 非 机 械 破 碎 方 法酶 溶 破 碎 法 （ enzyme lysis）化

27、学 破 碎 法 （ chemical treatment）去 垢 剂 破 碎 法 （ detergents）渗 透 压 冲 击 破 碎 法 （ osmotic shock）冻 融 破 碎 法 （ freezing and thawing） 二 非 机 械 法非 机 械 方 法 很 多1 酶 解2 化 学 法 溶 胞3 物 理 法n 渗 透 压 冲 击 n 冻 结 和 融 化n 干 燥 法其 中 酶 法 和 化 学 法 溶 胞 应 用 最 广 。二 1 酶 解 （ 酶 溶 法 Enymatic lysis)酶 解 是 利 用 溶 解 细 胞 壁 的 酶 处 理 菌 体 细 胞 ， 使 细胞 壁

28、受 到 破 坏 后 ， 再 利 用 渗 透 压 冲 击 等 方 法 破坏 细 胞 膜 。1） 外 加 酶 法 常 用 的 溶 酶 溶 菌 酶 、-1， 3-葡 聚 糖 酶 、-1， 6-葡 聚 糖 酶 、蛋 白 酶 、甘 露 糖 酶 、糖 苷 酶 、肽 键 内 切 酶 、壳 多 糖 酶 等 外 加 酶 法n 酶 解 法 的 特 点 是 专 一 性 强 ， 因 此 在 选 择 酶 系 统 时 ， 必须 根 据 细 胞 的 结 构 和 化 学 组 成 来 选 择 。l 溶 菌 酶 （ lysozyme)能 专 一 性 地 分 解 细 胞 壁 上 肽 聚 糖 分子 的 -1,4糖 苷 键 ， 因 此

29、 主 要 用 于 细 菌 类 细 胞 壁 的 裂解 。 革 兰 氏 阳 性 菌 悬 浮 液 中 加 入 溶 菌 酶 ， 很 快 就 产 生溶 壁 现 象 。 但 对 于 革 兰 氏 阴 性 菌 ， 单 独 采 用 溶 菌 酶 无效 果 ， 必 须 与 螯 合 剂 EDTA一 起 使 用 。l 放 线 菌 的 细 胞 壁 结 构 类 似 于 革 兰 氏 阳 性 菌 ， 以 肽 聚 糖为 主 要 成 分 ， 所 以 也 能 采 用 溶 菌 酶 ，l 酵 母 和 真 菌 由 于 细 胞 壁 的 组 分 主 要 是 纤 维 素 、 葡 聚 糖 、几 丁 质 等 ， 常 用 蜗 牛 酶 、 纤 维 素

30、酶 、 多 糖 酶 等 。 l 植 物 细 胞 壁 的 主 要 成 分 是 纤 维 素 ， 常 采 用 纤 维 素 酶 和半 纤 维 素 酶 裂 解 。 外 加 酶 法有 时 采 用 几 种 酶 的 混 合 物 会 产 生 更 好 的 效 果 ， 加入 时 需 确 定 相 应 的 次 序 。 对 酵 母 细 胞 采 用 酶 法 破 碎 时 ， 先 加 入 蛋 白 酶 作用 蛋 白 质 -甘 露 聚 糖 结 构 ， 使 二 者 溶 解 ， 再 加 入葡 聚 糖 酶 作 用 裸 露 的 葡 聚 糖 层 ， 最 后 只 剩 下 原 生质 体 ， 这 时 若 缓 冲 液 的 渗 透 压 变 化 ， 则

31、 细 胞 膜 破裂 ， 释 出 胞 内 产 物 。 酶 解 法 的 特 点 优 点 ：u发 生 酶 解 的 条 件 温 和u能 选 择 性 地 释 放 产 物u胞 内 核 酸 等 泄 出 量 少 ， 细 胞 外 形 较 完 整缺 点 ：溶 酶 价 格 高 ，溶 酶 法 通 用 性 差 （ 不 同 菌 种 需 选 择 不 同 的 酶 )产 物 抑 制 的 存 在 。 酶 解 -自 溶 作 用 l 自 溶 作 用 是 酶 解 的 另 一 种 方 法 ， 利 用 生 物 体 自身 产 生 的 酶 来 溶 胞 ， 而 不 需 外 加 其 他 的 酶 。l 在 微 生 物 代 谢 过 程 中 ， 大 多

32、 数 都 能 产 生 一 种 能水 解 细 胞 壁 上 聚 合 物 的 酶 ， 以 便 生 长 过 程 继 续下 去 。l 自 溶 作 用 ： 改 变 其 生 长 环 境 （ 温 度 、 、 缓冲 液 ） ， 可 以 诱 发 产 生 过 剩 的 这 种 酶 或 激 发 产生 其 它 的 自 溶 酶 ， 以 达 到 自 溶 目 的 。l 缺 点 是 ： 易 引 起 所 需 蛋 白 质 的 变 性 ， 自 溶 后 细胞 悬 浮 液 粘 度 增 大 ， 过 滤 速 度 下 降 。 某 些 化 学 试 剂 ， 如 有 机 溶 剂 、 变 性 剂 、 表 面 活 性 剂 、抗 生 素 、 金 属 螯 合

33、 剂 等 ， 可 以 改 变 细 胞 壁 或 膜 的 通 透性 （ 渗 透 性 ） ， 从 而 使 胞 内 物 质 有 选 择 地 渗 透 出 来 。2 化 学 渗 透 法 （ Chemical permeation）该 法 取 决 于 化 学 试 剂 的 类 型 以 及 细 胞 壁 膜 的 结 构 与 组 成 。 n 酸 处 理 可 以 使 蛋 白 质 水 解 成 氨 基 酸 ， 通常 采 用 6mol/L HCl。n 碱 能 溶 解 细 胞 壁 上 脂 类 物 质 或 使 某 些 组分 从 细 胞 内 渗 漏 出 来 。成 本 低 ， 反 应 激 烈 ， 不 具 选 择 性 。（ 1） 酸

34、 、 碱 处 理 法 细 胞 破 碎 常 用 的 表 面 活 性 剂 ：十 二 烷 基 硫 酸 钠 （ SDS， 阴 离 子 型 ） ； 。非 离 子 型 如 Triton X-100和 吐 温 （ Tween） 等对 疏 水 性 物 质 具 有 很 强 的 亲 和 力 ， 能 结 合 并 溶 解 磷 脂 ， 破 坏内 膜 的 磷 脂 双 分 子 层 ， 使 某 些 胞 内 物 质 释 放 出 来 。（ 2） 表 面 活 性 剂无 论 表 面 活 性 剂 是 阴 离 子 、 阳 离 子 还 是 非 离 子 型 ，都 是 两 性 的 ， 既 能 和 水 作 用 也 能 和 脂 作 用 ，能 与

35、细 胞 壁 上 的 脂 蛋 白 结 合 ， 形 成 微 泡 ， 使 膜 的 通透 性 增 加 或 溶 解 能 分 解 细 胞 壁 中 的 磷 脂 ， 使 细 胞 结 构 破 坏 ， 胞 内 物质 被 释 放 出 来 。有 机 溶 剂 可 采 用 丁 酯 、 丁 醇 、 丙 酮 、 氯 仿 和 甲 苯 等 （ 3） 有 机 溶 剂（ 4） EDTA螯 合 剂处 理 G-细 菌 ， 对 细 胞 壁 外 层 有 破 坏 作 用 。G-细 菌 的 壁 外 层 结 构 通 常 靠 二 价 阳 离 子 Ca2+或 Mg2+结 合 脂 多 糖和 蛋 白 质 来 维 持 ， 一 旦 EDTA将 Ca2+或 M

36、g2+螯 合 ， 大 量 的 脂 多 糖分 子 将 脱 落 ， 使 细 胞 壁 外 层 膜 出 现 洞 穴 。 u通 用 性 差 ；u时 间 长 ， 效 率 低 ， 一 般 胞 内 物 质 释 放 率 不 超 过 50%；u有 些 化 学 试 剂 有 毒 。u化 学 试 剂 的 加 入 常 会 给 随 后 产 物 的 纯 化 带 来 困 难 ， 并 影 响 最 终 产 物 纯 度化 学 渗 透 法 特 点 ：缺点l对 产 物 释 放 有 一 定 的 选 择 性 ， 可 使 一 些 较 小 分 子量 的 溶 质 如 多 肽 和 小 分 子 的 酶 蛋 白 透 过 ， 而 核 酸 等大 分 子 量

37、 的 物 质 仍 滞 留 在 胞 内 ；l细 胞 外 形 完 整 ， 碎 片 少 ， 浆 液 粘 度 低 ， 易 于 固 液分 离 和 进 一 步 提 取 。优点 3 物 理 法u渗 透 压 冲 击 法u冻 结 -融 化 法u干 燥 法 1） 渗 透 压 冲 击 法 渗 透 压 冲 击 是 较 温 和 的 一 种 破 碎 方 法 ，n 将 细 胞 放 在 高 渗 透 压 的 溶 液 中 （ 如 一 定 浓 度 的 甘 油 或蔗 糖 溶 液 ） ， 由 于 渗 透 压 的 作 用 ， 细 胞 内 水 分 便 向 外渗 出 ， 细 胞 发 生 收 缩 ， 当 达 到 平 衡 后 ， 将 介 质 快

38、 速 稀释 ， 或 将 细 胞 转 入 水 或 缓 冲 液 中 ， 由 于 渗 透 压 的 突 然变 化 ， 胞 外 的 水 迅 速 渗 入 胞 内 ， 引 起 细 胞 快 速 膨 胀 而破 裂 。 仅 适 用 于 细 胞 壁 较 脆 弱 的 细 胞 或 细 胞 壁 预 先 用 酶 处 理或 在 培 养 过 程 中 加 入 某 些 抑 制 剂 （ 如 抗 生 素 等 ） ， 使细 胞 壁 有 缺 陷 ， 强 度 减 弱 。 2） 冻 结 -融 化 法 将 细 胞 放 在 低 温 下 冷 冻 （ 约 -15 ） ， 然 后 在 室 温 中融 化 ， 反 复 多 次 而 达 到 破 壁 作 用 。

39、一 方 面 能 使 细 胞 膜 的 疏 水 键 结 构 破 裂 ， 从 而 增 加 细 胞的 亲 水 性 能 ，另 一 方 面 胞 内 水 结 晶 ， 形 成 冰 晶 粒 ， 引 起 细 胞 膨 胀 而破 裂 。适 用 于 细 胞 壁 较 脆 弱 的 菌 体 ， 破 碎 率 较 低 ， 需 反 复 多次 ， 此 外 ， 在 冻 融 过 程 中 可 能 引 起 某 些 蛋 白 质 变 性 。 使 细 胞 结 合 水 分 丧 失 ， 从 而 改 变 细 胞 的 渗 透 性 。 当 采 用 丙 酮 、丁 醇 或 缓 冲 液 等 对 干 燥 细 胞 进 行 处 理 时 ， 胞 内 物 质 就 容 易

40、被 抽提 出 来 。气 流 干 燥 主 要 适 用 于 酵 母 菌 ， 一 般 在 25-30 的 气 流 中 吹 干 ；真 空 干 燥 多 用 于 细 菌 。冷 冻 干 燥 适 用 于 不 稳 定 的 生 化 物 质3） 干 燥 法气 流 干 燥真 空 干 燥喷 雾 干 燥冷 冻 干 燥 选 择 破 碎 方 法 的 依 据 ：u细 胞 处 理 量 ； u细 胞 壁 强 度 和 结 构 (高 聚 物 交 联 程 度 、 种类 和 壁 厚 度 )；u目 标 产 物 对 破 碎 条 件 的 敏 感 性 ； u破 碎 程 度 ；u目 标 产 物 的 选 择 性 释 放 选 择 性 释 放 目 标 产

41、 物 的 一 般 原 则 仅 破 坏 或 破 碎 存 在 目 标 产 物 的 位 置 周 围l 当 目 标 产 物 存 在 于 细 胞 膜 附 近 时 ， 可 采 用 较 混 和 的方 法 ， 如 酶 溶 法 、 渗 透 压 冲 击 法 和 冻 结 融 化 法 等 。当 目 标 产 物 存 在 于 细 胞 质 内 时 ， 则 需 采 用 强 烈 的 机械 破 碎 法 l 当 目 标 产 物 处 于 与 细 胞 膜 或 细 胞 壁 结 合 的 状 态 时 ，调 节 溶 液 PH值 ， 离 子 强 度 或 添 加 与 目 标 产 物 具 有 亲和 性 的 试 剂 如 ： 螯 合 剂 、 表 面 活

42、 性 剂 等 ， 使 目 标 产物 容 易 溶 解 释 放 。(2)机 械 破 碎 法 和 化 学 法 并 用 可 使 操 作 条 件 更 加 温和 ， 在 相 同 的 目 标 产 物 释 放 率 条 件 下 ， 降 低 细胞 的 破 碎 程 度 。 讨 论 题 ： 青 霉 素 酰 化 酶 细 胞 破 碎 的 研 究 一 . 化 学 法 20%(W/V)大 肠 杆 菌 悬 浮 液 + B.A 37 搅 拌 高速 离 心 测 上 清 液 酶 活 。1.处 理 时 间 R% 2.5h 2. 丁 酯 用 量条 件 ： 37 ， 搅 拌 3小 时适 宜 的 B.A加 量 为 12% ， 释 放 率 R

43、=55%12%55%R 12%2.03U/mg比活 二 . 化 学 法 冻 融 法 结 合 加 B.A(12%,37 搅 拌 3h） 菌 悬 液 冻 融 (冻 结 14h 融 化 ) 释 放 率 70%； 比 活 2.69 u/mg 三 . 化 学 超 声 波 振 荡 法 结 合 先 丁 酯 处 理 ， 再 超 声 波 （ 90秒 ） ， 释 放 率 72% 小 型 设 备 ， 不 能 工 业 大 规 模 生 产 。四 . 高 压 匀 浆 法 20%(W/V)菌 悬 液 ， P=50MPa， N=3。 释 放 率 R=38.4%， 原 因 :细 胞 破 碎 后 ,仍 有 较 多 酶 吸 附 在

44、 细 胞 碎 片 上 。五 . 高 压 匀 浆 化 学 法 结 合 先 高 压 匀 浆 ， 再 加 10%丁 酯 ， 37 搅 拌 3h， 高 速 离 心 (3万 rpm)，释 放 率 ： R=60%六 . 珠 磨 直 径 0.4mm玻 璃 珠 。 释 放 率 ： R=95% 破碎率的测定细 胞 破 碎 后 ， 大 量 带 电 荷 的 内 含 物 被 释 放 到 水 相 ， 使 导 电 率 上 升 。 直 接 测 定 法 目 的 产 物 测 定 法 导 电 率 测 定 法 采 用 染 色 法 把 破 碎 的 细 胞 与 未 破 碎 的 细 胞 区 别 开 来 。如 破 碎 的 革 兰 氏 阳

45、性 菌 可 染 成 革 兰 氏 阴 性 菌 的 颜 色 ；采 用 革 兰 氏 染 色 法 染 色 酵 母 破 碎 液 ， 完 整 的 细 胞 呈 紫色 ， 而 受 损 害 的 细 胞 呈 亮 红 色 。将 破 碎 后 的 细 胞 悬 浮 液 离 心 ， 测 定 上 清 液 中 目 的 产 物 含 量或 活 性 ， 并 与 100%破 碎 率 的 标 准 值 比 较 ， 计 算 其 破 碎 率 。 破 碎 技 术 的 研 究 方 向 多 种 破 碎 方 法 相 结 合化 学 法 、 酶 法 、 机 械 法 相 结 合 。酶 法 与 高 压 匀 浆 、 超 声 波 震 荡 、 鳌 合 剂 、 渗

46、透 压 法 结 合如 用 溶 解 酶 预 处 理 面 包 酵 母 ， 然 后 高 压 匀 浆 ， 95MPa压力 下 匀 浆 4次 ， 总 破 碎 率 接 近 100%。 而 单 独 采 用 高 压 匀浆 法 ， 同 样 条 件 下 破 碎 率 只 有 32%。有 机 溶 剂 与 冻 融 法 、 干 燥 法 结 合 破 碎 技 术 的 研 究 方 向-与 上 游 过 程 相 结 合v在 发 酵 培 养 过 程 中 ， 培 养 基 、 生 长 期 、 操 作 参 数 （ 如 pH、温 度 、 通 气 量 、 搅 拌 转 速 、 稀 释 率 等 ） 等 因 素 都 对 细 胞 壁膜 的 结 构 与

47、 组 成 有 一 定 的 影 响 。v在 生 长 后 期 ， 加 入 某 些 能 抑 制 或 阻 止 细 胞 壁 物 质 合 成 的 抑制 剂 (如 青 霉 素 )， 继 续 培 养 一 段 时 间 后 ， 新 分 裂 的 细 胞 其细 胞 壁 有 缺 陷 ， 利 于 破 碎 ；v选 择 较 易 破 碎 的 菌 种 作 为 寄 主 细 胞 ， 如 革 兰 氏 阴 性 细 菌 ；v用 基 因 工 程 的 方 法 对 菌 种 进 行 改 造 ， 如 在 细 胞 内 引 进 噬 菌体 基 因 ， 培 养 结 束 后 ， 控 制 一 定 条 件 （ 如 温 度 等 ） ， 激 活噬 菌 体 基 因 ，

48、 使 细 胞 自 内 向 外 溶 解 ， 释 放 出 内 含 物 。 破 碎 技 术 研 究 方 向 -与 下 游 工 程 相 结 合举 例 ： 萃 取 破 碎 法 提 取 酵 母 醇 脱 氢 酶 （ inclusion bodies IBs)15.4 基 因 工 程 包 含 体 的 纯 化基因工程菌培养液不同表达形式的前处理(胞 外 分 泌 型 表 达 ： 离 心 ,收 集 液 相 浓 缩 纯 化 。(胞 内 表 达 ：l胞 内 可 溶 性 表 达 ： 离 心 ,收 集 菌 体 细 胞 破 碎 离 心 ，收 集 上 清 纯 化l胞 内 周 质 表 达 ： 离 心 ,收 集 菌 体 低 浓 度

49、 溶 菌 酶 或 渗 透压 冲 击 等 溶 解 目 标 物 离 心 ,收 集 上 清 液 纯 化 。l不 溶 性 包 涵 体 ： 离 心 ,收 集 菌 体 细 胞 破 碎 离 心 ,收 集沉 淀 包 涵 体 洗 涤 目 标 蛋 白 变 性 溶 解 复 性 纯 化 。 外 源 蛋 白 在 大 肠 杆 菌 中 的 积 累蛋 白 产 物 占 菌 体 总 蛋 白 外 源 蛋 白 的 积 累人 胰 岛 素 50% 形 成 包 涵 体 -丙 酰 胺 酶 20% 在 细 胞 间 区 -人 体 干 扰 素 25% 形 成 包 涵 体凝 乳 酶 原 形 成 包 涵 体牛 生 长 激 素 30% 形 成 包 涵

50、体 -内 酰 胺 酶 形 成 间 区 包 涵 体人 胰 岛 素 原 5%26% 形 成 包 涵 体 Z包 涵 体 ： 一 种 蛋 白 质 不 溶 性 聚 集 体 ， 包 括 目 标 蛋 白 、 菌 体 蛋 白 等 。目 标 蛋 白 一 级 结 构 是 正 确 的 ， 但 立 体 结 构 是 错 误 的 ， 所 以 没 有 生物 活 性 。Z包 涵 体 的 形 成 ： 大 肠 杆 菌 中 目 标 产 物 的 表 达 水 平 过 高 ， 超 过 正 常代 谢 水 平 ， 过 多 表 达 产 物 聚 集 在 细 胞 内 ， 形 成 不 溶 性 的 包 涵 体 。Z高 表 达 产 生 的 积 聚 物

51、在 细 胞 内 部 形 成 不 溶 物 原 因 ？ 蛋 白 过 量 积 聚 ， 超 过 溶 解 度 ， 导 致 沉 淀 ； 蛋 白 生 成 太 快 ， 分 子 间 疏 水 基 团 相 互 作 用 而 聚 集 沉 淀 ； 蛋 白 生 成 太 快 ， 分 子 内 部 二 硫 键 的 错 误 连 接 导 致 沉 淀 ； 表 达 蛋 白 过 多 ， 与 其 结 合 /诱 导 组 分 不 足 ， 不 能 形 成 溶 解 状 态 蛋 白 质 自 身 不 稳 定 。包 含 体 的 构 成 基 因 工 程 包 涵 体 的 纯 化 方 法收 集 菌 体 细 胞细 胞 破 碎包 涵 体 的 洗 涤目 标 蛋 白

52、的 变 性 溶 解目 标 蛋 白 的 复 性包 含 体 的 出 现 不 仅 增 加 了生 物 分 离 设 计 的 难 度 ， 也为 蛋 白 质 折 叠 机 理 研 究 提出 了 新 的 课 题 。欲 获 得 天 然 活 性 态 的 目 标产 物 ， 必 需 分 离 包 含 体 后 ，溶 解 包 含 体 并 使 其 中 的 目标 蛋 白 恢 复 应 有 的 天 然 活性 。 包 涵 体 获 得几 种 常 见 的 工 艺 路 线 (一 )机 械 破 碎(高 压 匀 浆 、 高 速 珠 磨 ）离 心 提 取 包 含 体加 变 性 剂 溶 解除 变 性 剂 复 性 特 点 :是 利 用 了 包 含 体

53、 与 细 胞 碎 片 的 密 度 差 ， 用离 心 法 将 包 含 体 与 细 胞 碎 片 和 可 溶 性 蛋 白 质 分开 ， 获 得 了 干 净 的 包 含 体 ， 再 对 包 含 体 溶 解 复性 。优 点 ： 摆 脱 了 大 量 的 杂 蛋 白 、 核 酸 、 热 原 、 内 毒素 等 杂 质 ， 使 后 面 的 分 离 纯 化 简 单 了 。 从 这 个角 度 上 讲 ， 包 含 体 的 形 成 对 分 离 纯 化 亦 有 好 处 。缺 点 :要 经 过 几 次 离 心 才 能 除 去 大 部 分 的 细 胞 碎片 ， 加 工 时 间 较 长 。路 线 1 的 特 点 包 涵 体 获

54、 得几 种 常 见 的 工 艺 路 线 （ 二 ）机械破碎膜分离获得包涵体加变性剂溶解包含体除变性剂复性 路 线 （ 二 ） 应 用 了 膜 分 离 技 术 ， 用 微 孔膜 除 去 可 溶 性 蛋 白 质 。u优 点 是 封 闭 式 操 作 ， 不 污 染 环 境 也 不 受环 境 污 染 ， 能 量 消 耗 也 比 离 心 法 少 。u缺 点 ： 细 胞 碎 片 和 包 含 体 一 起 被 膜 挡 住 ，难 以 分 开 ； 而 且 膜 的 堵 塞 和 浓 差 极 化 常常 导 致 可 溶 性 蛋 白 质 的 滞 留 。路 线 2 的 特 点 包 涵 体 获 得几 种 常 见 的 工 艺 路

55、 线 （ 三 ）化学破碎（加变性剂）离心除细胞碎片除变性剂复性 l 用 化 学 法 破 碎 ， 所 采 用 的 试 剂 既 可 以 破 碎又 可 以 溶 解 包 含 体 ， 将 两 道 工 序 和 为 一 道 ，节 省 了 设 备 和 时 间 ， 比 前 两 者 更 适 合 于 实验 室 操 作 。l 缺 点 是 所 有 的 可 溶 性 杂 质 都 没 有 除 去 ， 混杂 在 产 物 中 间 ， 给 后 续 分 离 带 来 困 难 。 路 线 三 ： 1）包涵体的洗涤l细胞破碎后，包含体呈颗粒状，致密。l洗涤的重要性：收集的沉淀中，除包涵体外，还包括许多杂质，如膜蛋白、肽聚糖、脂多糖等，复性

56、时会与目标蛋白一起复性形成杂交分子而聚集，给后步纯化带来困难。l洗涤剂：温和的表面活性剂、蔗糖、低浓度的弱变性剂（如尿素）或脱氧胆酸等。能溶解除去部分膜蛋白和脂质类杂质。l洗涤剂浓度以溶解杂质，不溶解包涵体中表达产物为原则。 2）目标蛋白的变性溶解 包涵体中不溶性的目标蛋白必须溶解到液相中，才能进一步纯化。一般水溶液很难将其溶解，只有采用蛋白质变性才能使其形成可溶性的形式。 常用变性剂： 5-8 mol/L盐酸胍和6-8 mol/L尿素, 作用：破坏离子间相互作用； 表面活性剂如1-2 SDS，作用：破坏蛋白质肽链间的疏水相互作用。 PH9.0的碱溶液和有机溶剂，使用较少。影响变性因素：时间、

57、pH、离子强度、变性剂种类和浓度。 原 理 ： 在 变 性 剂 溶 液 中 ， 溶 解 的 蛋 白 质 呈 变 性状 态 ， 即 蛋 白 质 高 级 结 构 被 破 坏 ， 但 一 级 结 构和 共 价 键 没 有 破 坏 。 当 部 分 变 性 剂 被 除 去 后 ，蛋 白 质 会 重 新 折 叠 成 具 有 活 性 的 正 确 构 型 ， 该过 程 称 复 性 。复 性 方 法 ：l稀 释 法 除 变 性 剂 加 入 大 量 水 或 缓 冲 液 。l膜 分 离 法 除 变 性 剂 透 析 、 超 滤 、 电 渗 析 。l层 析 法 ： 凝 胶 层 析 ，高效疏水层析 3） 目标蛋白的复性

58、蛋白质复性影响因素：u变性剂浓度u目标蛋白浓度；upH和离子强度； u氧化还原条件。 还原剂： 二硫苏糖醇、-巯基乙醇、还原型谷胱甘肽；氧化剂： 氧化型谷胱甘肽; 碱性下通空气。 复 性 区 多 聚 物 生 成 区 絮 凝 沉 淀 区盐酸胍浓度mol/L红血球碳酐酶复性操作中变性剂 与蛋白质浓度对复性的影响蛋白质浓度 mol/L 肿 瘤 坏 死 因 子 相 关 凋 亡 诱 导 配 体 蛋 白 在 E.coli中 的 高 密 度 发酵 过 程 中 以 两 种 形 式 表 达 ： 细 胞 内 有 活 性 的 可 溶 性 蛋 白 形 式 （ 约 占 目 标 蛋 白 的 30%） 无 活 性 的 包

59、涵 体 形 式 （ 约 占 目 标 蛋 白 的 70%） 。 悬 浮 破 壁PBS洗 涤离 心 硫 铵 沉 淀 亲 和 层 析 阳 离 子 交 换 层 析溶 解 复 性 亲 和 层 析湿 菌 体发 酵 液 干 净 菌 体上 清 液包 涵 体纯 品 活 性 检 测 破 壁 液 离 心离 心 液 洗 涤 举例：TRAIL的分离纯化 1. 包 涵 体 的 洗 涤 粗 制 包 涵 体 用 50mM磷 酸 盐 缓 冲 液 ， 含 150mM NaCl pH=7.4 (1:3 w/v) 洗 涤 2-3次 ； 用 含 有 1M NaCl的 磷 酸 缓 冲 液 洗 涤 1次 (1:3 w/v)， 将 粘 附

60、其 表 面 的 大 部 分 蛋 白 及 水 溶 性 杂 质 除 去 ； 用 6M尿 素 及 0.5%TritonX-100 联 合 洗 涤 1次 (1:3 w/v)， 去 除 另 一 些 杂 蛋 白 ， 这 时 得 较 纯 包 涵 体 （ 纯 度 达 80%左 右 ） ； 用 SDS-PAGE电 泳 检 测 纯 度 。 2. 包 涵 体 的 变 性 溶 解 洗 涤 后 包 涵 体 用 含 有 30mM DTT及 5mol/l盐 酸 胍 的 Tris 缓 冲 液 pH =8.0 (1:5 w/v)变 性 溶 解 室 温 搅 拌 2h， 95%以 上 的 包 涵 体 可 被 溶 解 ； 离 心 ，

61、 13000rpm， 20min 弃 沉 淀 得 到 溶 解 液 。 3. 包 涵 体 复 性 （ 间 歇 式 流 加 稀 释 复 性 法 ）l以 含 DTT和 ZnSO4的 Tris-HCl为 复 性 缓 冲 液 ， 再 添 加 0.4M L-Arg， 0.5M尿 素 ， 0.5M NaCl作 为 蛋 白 聚 集 抑 制 剂 ，l变 性 溶 解 液 可 多 次 流 加 ， 每 次 流 加 的 时 间 是 以 上 一 次 流 加蛋 白 已 达 到 部 分 复 性 为 准 。 本 实 验 中 ， 流 加 间 隔 时 间 确 定 为90min， 每 次 流 加 浓 度 为 150mg/L， 变 性

62、 液 流 加 次 数 可 高 达 6次 ， 最 终 浓 度 可 达 到 1mg/ml， 4 缓 慢 搅 拌 一 段 时 间 ，l对 50mM Tris-HCl， 300mM NaCl， 0.1M尿 素 及 0.2mM ZnSO4 混 合 液 透 析 过 夜 ， 透 析 后 离 心 除 去 复 性 过 程 中 聚 集 的 蛋 白 ，l超 滤 浓 缩 （ 也 可 用 硫 酸 铵 沉 淀 进 行 浓 缩 ） 得 复 性 蛋 白 液 。 5. 复 性 后 纯 化 复 性 浓 缩 后 蛋 白 金 属 亲 和 层 析 吸 附 洗 涤 ： 40mmol/L咪 唑 ， 洗 除 非 特 异 性 吸 附 的 杂

63、蛋 白 洗 脱 ： 100mmol/L咪 唑 目 标 蛋 白 纯 度 达 95%以 上 （ 由 SDS-PAG E和 RP-H PLC鉴 定 ） 收 率 75% 包 含 体 产 物 分 离 工 艺 （ 牛 生 长 激 素 分 离 提 取 ） 来 自 发 酵 罐 的 菌 体 经 过 离 心 除 去 培 养 液 后加 入 缓 冲 液 悬 浮 ， 通 入 高 压 匀 浆 器 反 复 破 碎 三次 。 匀 浆 经 过 离 心 和 水 洗 除 去 细 胞 碎 片 ， 再 添加 溶 菌 酶 、 EDTA和 促 进 剂 以 除 去 脂 蛋 白 和 未破 碎 的 细 胞 。 包 含 体 经 离 心 沉 淀 和

64、 水 洗 后 进 行变 性 溶 解 ， 溶 解 剂 为 6mol/L盐 酸 胍 。 溶 解 的 同时 通 入 空 气 氧 化 以 打 断 错 误 连 接 的 双 硫 键 。 离心 除 去 沉 淀 ， 含 变 性 蛋 白 质 的 上 清 液 经 超 滤 浓缩 后 过 凝 胶 柱 除 去 杂 蛋 白 ， 再 加 入 复 性 缓 冲 液进 行 透 析 复 性 。 复 性 过 程 中 产 生 的 絮 凝 沉 淀 用离 心 除 去 。包 含 体 产 物 分 离 工 艺（ 牛 生 长 激 素 分 离 提 取 ） 思 考 题 常 用 的 细 胞 破 碎 方 法 有 哪 些 在 选 择 细 胞 破 碎 方 法 时 需 要 考 虑 哪 些因 素 ？ 基 因 工 程 包 含 体 的 纯 化 方 法 。