结核病实验室诊断技术及其进展 - 结核病防治网

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1、结核病实验室诊断技术及其进展结核病实验室诊断技术及其进展中国疾病预防控制中心结核病防治临床中心国家结核病参比实验室赵雁林赵雁林2006年年5月月 结核病的诊断结核病的诊断 实验室诊断需要关注的问题实验室诊断需要关注的问题 WHOWHO推荐的肺结核的诊断标准推荐的肺结核的诊断标准 肺结核的实验室诊断肺结核的实验室诊断 结核病的实验室诊断新技术结核病的实验室诊断新技术内内 容容1.1.结构基因组学向功能基因组学转变结构基因组学向功能基因组学转变2.2.基因组学向蛋白组学转变基因组学向蛋白组学转变3.3.以作图为基础的基因鉴定向以序列为基础的以作图为基础的基因鉴定向以序列为基础的基因鉴定转变基因鉴定

2、转变4.4.单基因病研究向多基因病研究转变单基因病研究向多基因病研究转变生物医学研究模式发生变化趋势生物医学研究模式发生变化趋势生物医学研究模式发生变化趋势（续）生物医学研究模式发生变化趋势（续）5.5.对疾病的特异性对疾病的特异性DNADNA诊断向疾病易感性鉴定转变诊断向疾病易感性鉴定转变6.6.分析单个基因作用向研究基因作用的调控机制转变分析单个基因作用向研究基因作用的调控机制转变7.7.研究疾病的病因向研究疾病的病理发生机制转变研究疾病的病因向研究疾病的病理发生机制转变8.8.研究单一种属向研究多种种属转变。研究单一种属向研究多种种属转变。M.tuberculosis H37Rv Col

3、e ST et al.Nature 1998;393:537.441.1万碱基对万碱基对 3924 预测基因预测基因（3995 predicted protein-coding genes)65.6%GC 含量含量重复重复DNADNARepetitive DNA in the Mycobacterium tuberculosis Complex分类：分类：1.串联重复序列串联重复序列Tandem Repeats(TRs）卫星卫星DNA、小卫星小卫星DNA、微卫星微卫星DNA VNTR 2.散在重复序列散在重复序列Interpersed RepeatsGC富含重复序列和主要的串联重复序列富含重复

4、序列和主要的串联重复序列Polymorphic GC-Rich Repetitive Sequence&Major Polymorphic Tandem RepeatsPGRS&MPTS PEPPEMycobacterial Interspersed Repetitive Units MIRUs根据长度、序列组成分为三个根据长度、序列组成分为三个subfamilies,在在H37Rv中大小在中大小在46到到101bp,有有65个拷贝的个拷贝的MIRU在在41个个loci中出现。中出现。MIRU与其它已知重复序列的不同点：与其它已知重复序列的不同点：结构特点（无明显的回文结构）结构特点（无明显的

5、回文结构）插入位点插入位点 编码能力编码能力 具有散在重复序列和具有散在重复序列和VNTR序列的双重特点序列的双重特点散在重复序列散在重复序列范围：范围：基因复制基因复制短的序列重复短的序列重复移动的遗传元件移动的遗传元件IS ElementsREP13E12 FamilyProphageCRISPR Sequences(spoligotyping)clustered regularly interspaced short palindromic repeats实验室检查实验室检查 实验室检查的目的是为了疾病的诊断，要求检测出标本中实验室检查的目的是为了疾病的诊断，要求检测出标本中某物质的真实

6、含量和反应。某物质的真实含量和反应。真实物理含量，即所谓真实物理含量，即所谓“真值真值”由于人类由于人类 认识能力的局限性，认识能力的局限性，使得误差不能完全避免。使得误差不能完全避免。误差分类：误差分类：过失误差过失误差 方法误差（系统误差、随机误差）方法误差（系统误差、随机误差）抽样误差抽样误差 生物误差生物误差肺结核的诊断肺结核的诊断 l结核病人因症就诊是病人发现的主要方式l涂片显微镜检查对于传染性、预后和治疗评价有一定作用。lX-线对于结核病的诊断不是一种特异性的方法 l核酸扩增试验和血清学方法对于结核病的诊断有一定的价值（有待进一步研究）缓慢生长 光产色 堪萨斯、海、猿分枝杆菌 缓慢

7、生长 暗产色 瘰疬、苏加 缓慢生长 不产色 鸟胞内 蟾分枝杆菌 快速生长 偶发、龟 非结核分枝杆菌不能使豚鼠致病1886年Lenman和Neaman命名结核分枝杆菌非非结核分枝杆菌结核分枝杆菌生物标本生物标本生物样本成分千差万别合格的标本如果每毫升灌洗液中超过105 个集落形成单位，某一微生物存在，且有该微生物感染的其他临床表现，则该微生物可能就是病原菌流感病毒和呼吸道合胞体病毒正常情况下不存在于呼吸道。经典免疫学认为，结核的免疫属于传染免疫（infection immunity),又称有菌免疫，即只有当结核菌在体内存在时才有免疫力，一旦体内的细菌被杀灭，免疫力随即消失。机体对结核分枝杆菌能产

8、生抗体，但无免疫保护作用。TB accelerates the progression of HIV disease结核免疫结核免疫结核病的诊断结核病的诊断咳嗽、咯痰大于等于咳嗽、咯痰大于等于 3周周AFB X 3 广谱抗生素治疗10-14天 如果症状没有改善,重复 AFB,X-线 诊断 TB 抗结核治疗抗结核治疗If 1 positive,X-ray and evaluation If 2/3 positive:Anti-TB Rx阴性阴性显微镜涂片检查较显微镜涂片检查较显微镜涂片检查较显微镜涂片检查较 X-X-线线线线检查更检查更检查更检查更 客观、可信客观、可信客观、可信客观、可信专家组

9、一直同意诊断专家组一直同意诊断特异性显微镜涂片检查的特异性显微镜涂片检查的特异性显微镜涂片检查的特异性显微镜涂片检查的特异性较较较较 X-X-线线线线检查好检查好检查好检查好X-线线诊断结核病的过诊问题诊断结核病的过诊问题NTI,Ind J Tuberc,1974过诊过诊HIV/AIDS中涂阳肺结核病人的比例中涂阳肺结核病人的比例010203040506070HIV NegativeEarly HIVLate HIVAFB positivity in TB patients积极治疗传染源可以减少结核病的传播涂阳病人的传染性是涂阴病人的 4-20 倍如果不给予治疗一个涂阳病人可以传染10-15人

10、/年如果不给予治疗涂阳病人更容易死亡Rouillon A.Tubercle 1976;57:275-99结核病变在体内的演变和播散 在没有HIV感染的人群中，结核杆菌感染者在其一生中 大约有10%的人会发病 In the absence of HIV,about 10%of people infected with TB will develop TB disease.在TB/HIV双重感染者中约50%的感染者会成为结核病患者 In people co-infected with HIV and TB,about 50%may develop TB disease TB 加速和恶化 HIV/A

11、IDS的疾病进展 TB accelerates the progression of HIV diseaseTB和和HIV 双重感染双重感染TB and HIV co-infection TB是PLWHA人群中的主要致死原因 TB is the leading cause of death in people living with HIV&AIDS 不管是否感染HIV，结核病是可以被治愈的传染病 TB can be cured whether a patient is co-infected with HIV or not,with the same treatment regimenTB和

12、和HIV 双重感染双重感染TB and HIV co-infection (cont)低治愈率 Low cure rate高死亡率High mortality rates during treatment高复发率High rates of TB recurrence问问 题题Problems 涂阴肺结核的过诊Over-diagnosis of sputum smear-negative PTB 涂阳肺结核的漏诊Under-diagnosis of sputum smear-positive PTB 肺外结核病的误诊Missed diagnosis of extra-pulmonary TB问问

13、 题题Problems（cont)International standards for Tuberculosis care 结核病关怀结核病关怀-国际标国际标准准 Diagnosis:标准 1.所有不能解释的进行性、持续咳嗽2-3周的可以症状者都应该进行结核病相关检查STANDARD 1.All persons with otherwise unexplained productive cough lasting twothree weeks or more should be evaluated for tuberculosis.诊诊 断断 Diagnosis标准 2.所有肺结核的可疑症状

14、者都应该进行痰涂片显微镜检查（至少两次痰涂片检查，至少包含一份晨痰）STANDARD 2.All patients(adults,adolescents,and children who are capable of producing sputum)suspected of having pulmonary tuberculosis should have at least two,and preferably three,sputum specimens obtained for microscopic examination.When possible,at least one earl

15、y morning specimen should be obtained.诊诊 断断 Diagnosis标准 3.所有的肺结核可疑症状者，都应该对其病变部位来源的合格标本进行显微镜涂片检查，如果条件允许可以做培养和组织病理学检查。STANDARD 3.For all patients(adults,adolescents,and children)suspected of having extrapulmonary tuberculosis,appropriate specimens from the suspected sites of involvement should be obta

16、ined for microscopy and,where facilities and resources are available,for culture and histopathological examination.诊诊 断断 Diagnosis标准 4.所有胸部影象学检查可疑肺结核的病人，应该对其痰标本进行微生物学检查。Standard 4.All persons with chest radiographic findings suggestive of tuberculosis should have sputum specimens submitted for micro

17、biological examination.诊诊 断断 Diagnosis标准 5.涂阴肺结核的诊断标准：至少3个痰涂片检查阴性；胸部影象学检查可疑肺结核；对广谱抗生素试验性治疗无效（除外喹诺酮类）。对这样的病人如果条件允许，应该做培养；对已知或疑似HIV感染者，应加快对其的诊断进程。STANDARD 5.The diagnosis of sputum smear-negative pulmonary tuberculosis should be based on the following criteria:at least three negative sputum smears(inc

18、luding at least one early morning specimen);chest radiography findings consistent with tuberculosis;and lack of response to a trial of broad-spectrum antimicrobial agents.(NOTE:Because the fl uoroquinolones are active against M.tuberculosis complex and,thus,may cause transient improvement in persons

19、 with tuberculosis,they should be avoided.)For such patients,if facilities for culture are available,sputum cultures should be obtained.In persons with known or suspected HIV infection,the diagnostic evaluation should be expedited.诊诊 断断 Diagnosis标准 6.对有症状的涂阴儿童胸腔结核患者的诊断应该根据胸部影象学检查可疑肺结核、暴露史或结核感染（TST阳性

20、或 干扰素释放试验）。对这样的病人如果条件允许，应该通过（排出物、洗胃或引痰等方式）得到痰标本进行培养。STANDARD 6.The diagnosis of intrathoracic(i.e.,pulmonary,pleural,and mediastinal or hilar lymph node)tuberculosis in symptomatic children with negative sputum smears should be based on the finding of chest radiographic abnormalities consistent with

21、 tuberculosis and either a history of exposure to an infectious case or evidence of tuberculosis infection(positive tuberculin skin test or interferon gamma release assay).For such patients,if facilities for culture are available,sputum specimens should be obtained(by expectoration,gastric washings,

22、or induced sputum)for culture.诊诊 断断 Diagnosis当前可得的结核病诊断方法当前可得的结核病诊断方法What methods are available now to detect TB 涂片显微镜检查(Microscopy)ZN FM 培养 (Culture)Conventional media MGIT BACT-3D ALERT ESP etc.核酸扩增法（NAAT）Amplicor MTB、MTD Gen-Probe、SDA Quanti-PCR Genechip 血清学方法(Serological method)QuantiFERON T-SPO

23、T TB ELISA etc.其他(Other)FAST-Plaque(phage)HPLC etc.传统的结核病实验室检查方法#Capacity to detect when 10,000 bacilli per ml sputum*Capacity to detect when 102-3 CFU per ml sputum ZN FM Solid Liquid PPDSensitivity 40-60%50-70%85%70-85%?Timing 48hours 48hours up to 8 weeks 2weeks 72hoursCost cheap expensive cheap

24、expensive cheap Stain#Culture*TST真空采血管使用指南1.8,2.4,4.0,5.0抗凝剂:枸橼酸钠与血样比为1:4采血后立即颠倒混匀8次试验前混匀标本全血血细胞沉降率试验 Black 黑色1.8,2.0,2.7,4.5抗凝剂:枸橼酸钠与血样比为1:9采血后立即颠倒混匀8次试验前混匀标本全血血液凝固试验 Lt Bule 浅兰色2.0,2.5,3.0,3.5,4.0,5.0,6.0,10.0抗凝剂:K2EDTA或K3EDTA采血后立即颠倒混匀8次试验前混匀标本全血血液学常规试验 Lavender 紫色 5.0抗凝剂K2EDTA 和惰性分离胶采血后立即颠倒混匀8次室温

25、离心1100g，10分钟血浆分子生物学诊断 White 白色2.5,3.5,4.0,5.0,6.0,9.5,11.0,13.0惰性胶体促凝剂 采血后立即颠倒混匀5次静置30分钟离心 血清快速血清分离生化 Gold 金黄色管 2.0,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,10.0抗凝剂:肝素钠、锂、氨 采血后立即颠倒混匀8次离心血浆快速血浆生化 Green 绿色3.0,5.3,7.0促凝剂：纤维蛋白酶采血后立即颠倒混匀8次静置5分钟离心血清快速血清生化 Orange 桔红色2.0,3.0,4.0,5.0,7.0,10.0,15.0,20.0无（内壁涂有硅酮）采血后不需颠倒混匀 静置1小时 离心

26、 血清血清生化 Red 红色采血量(ml)添 加 剂制 备 步 骤 标本类 型临床用途 管 盖 颜 色 痰涂片显微镜检查Z-N 萋尼二氏染色,需要 5,000-10,000 个CFU/毫升100 x 油镜看完300个视野大概需要15分钟40-70%灵敏度,90%特异性 FM 荧光染色灵敏度较ZN染色高10%UnevenToo thickSloughed offUnderdecolorized Good Smear Poor Smear萋尼氏染色不同痰标本呈现的物理性状不同痰标本呈现的物理性状唾液唾液脓痰脓痰血痰血痰粘液痰（水样）粘液痰（水样）Culture of the organismsLi

27、quefaction,decontamination,concentrationSoild media-Egg-based(Lowenstein-Jensen),agar-based(Middlebrook 7H10 and 7H11),biphasic mediaLiquid media-Middlebrook 7H9,7H12 Identification by biochemical testsThe entire process:4 to 6 weeksDrug susceptibility test:add 3 to 6 weeks BACTEC TB systemTubes wit

28、h a fluorescent compound in silicone bottom,which is sensitive to oxygen presenceComparison of the BACTEC MGIT 960 with Lowenstein-Jensen medium(1-2w vs 6-8w)The recovery rates-94%(117/124)vs 75.8%(94/124);TTDs(time to detection)-10.7 vs 30.6 dDisadvantage-inability to observe colonial morpgology,mi

29、xture culture,high costChien HP et al,Int J Tuberc Lung Dis,2000 Serodiagnosis of TuberculosisAntigen 60IgG(%)IgM(%)Active PTB(n=147)76.29.52Active EPTB(n=90)58.910Inactive TB(n=153)18.31.6Non TB dz(n=517)9.70.6Sensitivity69.610.5Specificity92.199.4Positive predicted v67.9Negative predicted v89.2Luh

30、 KT,Yu CJ,Respirology 1996MethodSensitivity Specificity Predictive value(%)Accuracy (%)(%)Positive Negative (%)COBAS AMPLICOR80.6 100 100 98.6 98.6Culture86.1 100 100 99.0 99.0Microscopy36.1 99.4 95.4 65.0 94.2Polymerase chain reaction(PCR)Jan IS et al,J Formos Med Assoc 1998 Factors Contributing to

31、 the Increase in TB CasesHIV epidemicIncreased immigration from high-prevalence countriesTransmission of TB in congregate settings(e.g.,correctional facilities,long-term care)Deterioration of the public health care infrastructureTransmission and Pathogenesis of TBCaused by Mycobacterium tuberculosis

32、(M.tuberculosis)Spread person to person through airborne particles that contain M.tuberculosis,called droplet nucleiTransmission occurs when an infectious person coughs,sneezes,laughs,or singsProlonged contact needed for transmission 10%of infected persons will develop TB disease at some point in th

33、eir livesSites of TB DiseasePulmonary TB occurs in the lungs85%of all TB cases are pulmonary Extrapulmonary TB occurs in places other than the lungs,including the:LarynxLymph nodesPleura(membrane surrounding each lung)Brain and spineKidneys Bones and jointsMiliary TB occurs when tubercle bacilli ent

34、er the bloodstream and are carried to all parts of the body不是每个暴露在传染源中的人都会被传染不是每个暴露在传染源中的人都会被传染 Probability of transmission depends on:Infectiousness Type of environment Length of exposure 10%of infected persons will develop TB disease at some point in their lives潜伏性感染和结核病潜伏性感染和结核病潜伏性感染潜伏性感染结核病结核病结核

35、分枝杆菌存在于体内结核菌素试验通常为阳性胸部 x-线检查通常无异常胸部 x-线检查通常异常痰涂片、培养阴性痰涂片、培养阳性无症状有症状（咳嗽、发热、体重减少）没有传染性通常在治疗之前有传染性不是结核病病人结核病患者全球采取了有利措施来遏制结核病全球采取了有利措施来遏制结核病结核病在人类历史上肆虐超过3000年Sources:DeAngelis CD,Flanagin A.Tuberculosis a global problem requiring a global solution.JAMA.2005;293:2793-2794.Nerlich AG,Hans CJ,Zink A,et al

36、.Molecular evidence for tuberculosis in an ancient Egyptian.Lancet.1997;350:1404.Cited in DeAngelis CD,Flanagin A.World Health Organization.Global Tuberculosis Control:Surveillance,Planning,Financing.Geneva,Switzerland:World Health Organization;2005.ReportWHO/HTM/TB/2005.Cited in DeAngelis CD,Flanag

37、in A.Whalen CC.Diagnosis of latent tuberculosis infection.JAMA.2005;293:2785-2788.当前三分之一的人已经感染了结核菌 据估计在2005年,全球有 9百万结核病人被诊断,有 200万人死于结核病 -4000万新感染者 80%的新发病人来源于 23个国家-50%+在孟加拉,中国,印度,印尼和尼日利亚早期诊断早期诊断提高认识提高认识积极治疗积极治疗减少歧视减少歧视提高依存性提高依存性The standards of care1.鉴别易感人群鉴别易感人群 2.治疗与督导治疗与督导3.评估评估 HIV/AIDS、耐药和流动人口等耐药和流动人口等消除结核病的目标已经非常清晰谢 谢Thank you for your attention