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1、实验二实验二+细菌的简单染色细菌的简单染色与革兰氏染色与革兰氏染色一、目的要求一、目的要求1、巩固显微镜的使用方法；、巩固显微镜的使用方法；2、掌握细菌的简单染色和革兰氏染色的原、掌握细菌的简单染色和革兰氏染色的原理和方法。理和方法。二、基本原理二、基本原理革革兰兰氏氏染染色色 用用于于生生物物染染色色的的染染料料主主要要有有碱碱性性染染料料、酸酸性性染染料料和和中性染料三大类。中性染料三大类。碱碱性性染染料料的的离离子子带带正正电电荷荷，能能和和带带负负电电荷荷的的物物质质结结合合。因因细细菌菌蛋蛋白白质质等等电电点点较较低低，当当它它生生长长于于中中性性、碱碱性性或或弱弱酸酸性性的的溶溶液
2、液中中时时常常带带负负电电荷荷，所所以以通通常常采采用用碱碱性性染染料料（如如美美兰兰、结结晶晶紫紫、碱碱性性复复红红或或孔孔雀雀绿绿等）使其着色。等）使其着色。酸酸性性染染料料的的离离子子带带负负电电荷荷，能能与与带带正正电电荷荷的的物物质质结结合合。当当细细菌菌分分解解糖糖类类产产酸酸使使培培养养基基pH下下降降时时，细细菌菌所所带带正正电电荷荷增增加加，因因此此易易被被伊伊红红、酸酸性性复复红红或或刚果红等酸性染料着色。刚果红等酸性染料着色。中中性性染染料料是是前前两两者者的的结结合合物物又又称称复复合合染染料料，如如伊伊红美兰、伊红天青等。红美兰、伊红天青等。简简单单染染色色法法是是只
3、只用用一一种种染染料料使使细细菌菌着着色色以以显显示示其其形形态态，简简单单染染色色不不能能辨辨别别细细菌菌细细胞胞的的构造。构造。革革兰兰氏氏染染色色法法是是1884年年由由丹丹麦麦病病理理学学家家C.Gram所所创创立立的的。革革兰兰氏氏染染色色法法可可将将所所有有的的细细菌菌区区分分为为革革兰兰氏氏阳阳性性菌菌（G+）和和革革兰兰氏氏阴阴性性菌菌（G-）两两大大类类，是是细细菌菌学学上上最最常常用用的的鉴鉴别别染染色色法法。该该染染色色法法所所以以能能将将细细菌菌分分为为G+菌菌和和G-菌菌，是是由由这这两两类类菌菌的的细细胞胞壁结构和成分的不同壁结构和成分的不同所决定的。所决定的。革兰
4、氏阳性和阴性菌细胞壁成分比较革兰氏阳性和阴性菌细胞壁成分比较成分成分 占细胞壁干重的占细胞壁干重的%革兰氏阳性菌革兰氏阳性菌 革兰氏阴性菌革兰氏阴性菌肽聚糖肽聚糖 含量很含量很高高（50-9050-90）含量很含量很低低（1010）磷壁酸磷壁酸 含量较高（含量较高（5050）无无类脂质类脂质 一般一般无无（2 2）含量较高（含量较高（2020）蛋白质蛋白质 无无 含量较高含量较高vG-菌菌的的细细胞胞壁壁中中含含有有较较多多易易被被乙乙醇醇溶溶解解的的类类脂脂质质，而而且且肽肽聚聚糖糖层层较较薄薄、交交联联度度低低，故故用用乙乙醇醇或或丙丙酮酮脱脱色色时时溶溶解解了了类类脂脂质质，增增加加了了
5、细细胞胞壁壁的的通通透透性性，使使结结晶晶紫紫和和碘碘的的复复合合物物易易于于渗渗出出，结结果果细细菌菌就就被被脱色，再经脱色，再经沙黄沙黄复染后就成红色。复染后就成红色。vG 菌菌细细胞胞壁壁中中肽肽聚聚糖糖层层厚厚且且交交联联度度高高，类类脂脂质质含含量量少少，经经脱脱色色剂剂处处理理后后反反而而使使肽肽聚聚糖糖层层的的孔孔径径缩缩小小，通通透透性性降降低低，因因此细菌仍保留初染时的颜色。此细菌仍保留初染时的颜色。三、实验器材三、实验器材1、材料、材料培培养养12-16h的的枯枯草草杆杆菌菌（Bacillus subtilis），培养培养24小时的大肠杆菌（小时的大肠杆菌（Escheric
6、hia coli）2、染色液和试剂、染色液和试剂草草酸酸铵铵结结晶晶紫紫、碘碘液液、95%乙乙醇醇、沙沙黄黄、二二甲甲苯、香柏油苯、香柏油3、器材、器材 废废液液缸缸、洗洗瓶瓶、载载玻玻片片、接接种种环环、酒酒精精灯灯、擦擦镜纸、显微镜等。镜纸、显微镜等。四、实验方法及步骤四、实验方法及步骤1、简单染色、简单染色（1）涂涂片片取取干干净净载载玻玻片片一一块块，在在载载玻玻片片的的左左、右右各各加加一一滴滴蒸蒸馏馏水水，按按无无菌菌操操作作法法取取菌菌涂涂片片，左左边边涂涂枯枯草草杆杆菌菌，右右边边涂涂大大肠肠杆杆菌菌，做做成成浓浓菌菌液液。再再取取干干净净载载玻玻片片一一块块将将刚刚制制成成的
7、的枯枯草草杆杆菌菌液液挑挑2-3环环涂涂在在左左边边制制成成薄薄的的涂涂面面，将将大大肠肠杆杆菌菌的的浓浓菌菌液液取取2-3环环涂涂在在右右边边制制成成薄薄涂涂面面。亦亦可可直直接在载玻片上制薄的涂面，注意取菌不要太多。接在载玻片上制薄的涂面，注意取菌不要太多。（2）晾干）晾干让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方文让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方文火烘干。火烘干。（3）固定）固定手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）。次固定（以不烫手为宜）。（4）染色）染色将固定过的涂片放在废液缸上的搁架上，将固定过的涂片放在废液缸上的搁架上，加加沙黄
8、沙黄染色染色1-2min。（5）水洗）水洗用水洗去涂片上的染色液。用水洗去涂片上的染色液。（6）干燥）干燥将洗过的涂片放在空气中晾干或用吸水纸将洗过的涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸干。吸干。（7）镜检）镜检先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油一滴，将油镜头浸入油滴中仔细调焦观油一滴，将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的形态。察细菌的形态。涂片涂片干燥干燥固定固定染色染色水洗水洗镜检镜检简单染色方法简单染色方法干燥干燥2、革兰氏染色、革兰氏染色（1）涂片）涂片与简单染色涂片相同；与简单染
9、色涂片相同；（2）晾干）晾干与简单染色法相同；与简单染色法相同；（3）固定）固定与简单染色法相同；与简单染色法相同；（4）初初染染将将玻玻片片置置于于废废液液缸缸玻玻片片搁搁架架上上，加加适适量量（以以盖盖满满细细菌菌涂涂面面）的的结结晶晶紫紫染染色色液染色液染色1min；（5）水洗）水洗倾去染色液，用水小心地冲洗；倾去染色液，用水小心地冲洗；（6）媒染）媒染滴加滴加碘液碘液，媒染，媒染1min；（7）水洗）水洗用水洗去碘液；用水洗去碘液；（8）脱色）脱色将玻片倾斜，连续滴加将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇乙醇脱色脱色20-25s至流出液无色，立即水洗；至流出液无色，立即水洗；（9）复染）复染滴
10、加滴加沙黄沙黄复染复染5min；（10）水洗）水洗用水洗去涂片上的沙黄染色液；用水洗去涂片上的沙黄染色液；（11）晾干）晾干将染好的涂片放空气中晾干或者用吸将染好的涂片放空气中晾干或者用吸水纸吸干；水纸吸干；（12）镜检）镜检镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。性。五五注意事项注意事项1、革革兰兰氏氏染染色色成成败败的的关关键键是是酒酒精精脱脱色色。如如脱脱色色过过度度，革革兰兰氏氏阳阳性性菌菌也也可可被被脱脱色色而而染染成成阴阴性性菌菌；如如脱脱色色时时间间过过短短，革革兰兰氏氏阴阴性性菌
11、菌也也会会被被染染成成革革兰兰氏氏阳阳性性菌菌。脱脱色色时时间间的的长长短短还还受受涂涂片片厚厚薄薄及及乙乙醇醇用用量量多多少少等等因因素素的的影影响响，难难以以严严格格规规定定，需要多加练习；需要多加练习；2、选选用用幼幼龄龄的的细细菌菌。G+菌菌培培养养12h-16h，E.coli培培养养24h。若若菌菌龄龄太太老老，由由于于菌菌体体死死亡亡或或自自溶溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。六六思考题及作业题思考题及作业题1、当当对对未未知知菌菌进进行行革革兰兰氏氏染染色色时时，如如何何保保证操作正确及结果可靠？证操作正确及结果可靠？2、简述革兰氏染色的原理和步骤。简述革兰氏染色的原理和步骤。球菌球菌杆菌杆菌大肠杆菌大肠杆菌革兰氏阴性菌革兰氏阴性菌革兰氏阳性菌革兰氏阳性菌结束语结束语谢谢大家聆听！谢谢大家聆听！21
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