[工学]酶工程第3章兰州大学酶工程酶的分离纯化课件

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1、工学酶工程第3章兰州大学酶工程酶的分离纯化大规模提取纯化的特殊性 在在选选择择酶酶的的提提取取和和分分离离纯纯化化方方法法时时，必必须须考考虑虑到到小小规规模模工工艺艺过过程程和和大大规规模模工工艺艺过过程程之之间间的的关关系系。酶酶的的提提取取和和分分离离纯纯化化方方法法有有多多种种，但但并并不不是是都都适适合合大大规规模模的的操操作作过过程程。例例如如超超声声波波处处理理、冻冻融融、研研磨磨等等方方法法能能有有效效地地破破碎碎细细胞胞，但但是是扩扩大大这这些些技技术术的的使使用用规规模模，多多数数是是不不实实用用的，有些也效果不佳。的，有些也效果不佳。胞外酶的提取 微微生生物物产产生生的的

2、酶酶分分为为胞胞内内酶酶和和胞胞外外酶酶，胞胞内内酶酶还还分分为为游游离离状状态态和和膜膜结结合合状状态态两两类类。要要得得到到胞胞内内酶酶，必必须须首首先先破破碎碎细细胞胞，使使酶酶从从细细胞胞内内释释放放出出来来，进进入入提提取取液液中中，以以后后的的分分离离纯纯化化步步骤就与胞外酶差不多了。骤就与胞外酶差不多了。一、提取 提提取取指指的的是是使使酶酶从从细细胞胞中中释释放放出出来来，进进入入提提取取液液的的过过程程。提提取取一一般般在在低低温温下下进进行行，低低温温有有利利于于保保持持酶酶的的活活性性，也也能能减减少少蛋蛋白白酶酶对对目目标标酶酶的的水水解解。提提取取液液要要有有适适当当

3、的的pH值值和和离离子子强强度度，通通常常用用一一定定浓浓度度的的缓缓冲冲液液作作为为提提取取液液，根根据据情情况况还还可可以以加加入入一一些些酶酶活活性性的的保保护护剂剂和和蛋蛋白白酶酶抑抑制剂。制剂。酶活性保护剂 牛牛血血清清白白蛋蛋白白（BSA，bovine serum albumin）、明明 胶胶、甘甘 油油、二二 硫硫 苏苏 糖糖 醇醇（DTT）、谷谷胱胱甘甘肽肽（GSH）、巯巯基基乙乙醇醇、金属离子、金属离子、EDTA。蛋白酶抑制剂 苯苯 甲甲 磺磺 酰酰 氟氟（PMSF）、抗抗 蛋蛋 白白 酶酶（antipain）、亮抑酶肽（）、亮抑酶肽（leupeptin）等。）等。1 1化学

4、方法提取（1）碱）碱（2）溶菌酶和）溶菌酶和EDTA（3 3）去垢剂提取）去垢剂提取（4 4）渗透冲击）渗透冲击（1 1）碱提取 这这种种方方法法用用在在各各种种细细菌菌的的小小规规模模和和大大规规模模提提取取中中都都相相当当成成功功。在在提提取取治治疗疗用用的的L-天天冬冬酰酰胺胺酶酶时时，将将细细菌菌置置于于pH1112.5的的碱碱液液中中处处理理20分分钟钟可可将将酶酶提提取取出出来来。碱碱处处理理是是否否适适用用取取决决于于目目标标酶酶在在高高pH下下的的稳稳定定性性。此此法法可可以以使使蛋蛋白白酶酶失失活活，还可以减少医用酶制剂的热源污染。还可以减少医用酶制剂的热源污染。（2 2）溶

5、菌酶和EDTA提取 溶溶菌菌酶酶是是用用鸡鸡蛋蛋清清作作原原料料生生产产的的商商品品酶酶，它它专专一一水水解解细细菌菌细细胞胞壁壁粘粘肽肽（也也叫叫肽肽多多糖糖）部部分分的的-1,4-糖糖苷苷键键，细细胞胞壁壁刚刚性性强强的的革革兰兰氏氏阳阳性性细细菌菌对对这这种种酶酶的的敏敏感感性性要要比比革革兰兰氏氏阴阴性性细细菌菌高高，因因为为细细胞胞壁壁的的刚刚性性在在很很大大程程度度上上是是来来自自细细胞胞壁壁的的粘粘肽肽。当当细细胞胞壁壁崩崩解解后后，最最终终使使细细胞胞外外膜膜破破裂裂的的是是提提取取液的渗透压。液的渗透压。（2）溶菌酶和EDTA提取 单单独独使使用用溶溶菌菌酶酶破破碎碎革革兰兰

6、氏氏阴阴性性细细菌菌的的细细胞胞壁壁很很难难取取得得成成功功，EDTA是是必必需需的的添添加加物物，因因为为EDTA能能螯螯合合维维持持细细胞胞壁壁稳稳定定必必需需的的二二价价阳阳离离子子，可可使使革革兰兰氏氏阴阴性性细细菌菌细细胞胞外外膜膜上上的的脂脂多多糖糖释释放放出出来，这样使溶菌酶可以进入并且作用于粘肽层。来，这样使溶菌酶可以进入并且作用于粘肽层。这这项项技技术术很很少少用用于于细细菌菌酶酶的的大大规规模模提提取取，因因为为溶溶菌菌酶酶的的价价格格较较高高。粗粗制制鸡鸡蛋蛋清清要要便便宜宜得得多多，而而且且常常常常同同样样有有效效。溶溶菌菌酶酶法法是是一一种种使使细细胞胞破破裂裂的非常

7、温和的方法。的非常温和的方法。（3 3）去垢剂提取 无无去去垢垢剂剂（detergent）存存在在时时，膜膜结结合合酶酶大大部部分分存存在在于于离离心心后后的的沉沉淀淀里里，而而上上清清液液里里含含量量很很低低。去去垢垢剂剂可可以以将将膜膜结结合合酶酶溶溶解解下下来来。所所以以提提取取膜膜结结合合酶酶时时必必须须加加去去垢垢剂剂。离离子子型型去去垢垢剂剂的的反反应应性性比比非非离离子子型型的的强强，会会使使酶酶变变性性，所所以以在在提提取取膜膜结结合合酶酶时时用用非非离离子子型型去去垢垢剂剂，常常用用的的是是曲曲拉拉通通。在在提提取取液液中中加加入入0.1的的Triton x-100可可将将膜

8、膜结结合合酶酶洗脱下来。洗脱下来。离子型去垢剂十二烷基硫酸钠（十二烷基硫酸钠（SDS，阴离子型），阴离子型）十六烷基溴化铵（阳离子型）十六烷基溴化铵（阳离子型）非离子型去垢剂吐温（吐温（Tween）曲拉通（曲拉通（Triton）十二烷基麦芽糖苷（十二烷基麦芽糖苷（n-dodecyl-D-altoside，DM）Tween 20Triton X-100（4 4）渗透冲击 渗渗透透冲冲击击（osmotic shock）法法适适用用于于从从一一些些革革兰兰氏氏阴阴性性细细菌菌提提取取酶酶。先先用用缓缓冲冲液液洗洗菌菌体体以以去去掉掉培培养养基基，接接着着把把菌菌体体重重新新悬悬浮浮在在含含20蔗蔗糖

9、糖的的缓缓冲冲液液中中，平平衡衡一一段段时时间间后后，离离心心分分离离出出菌菌体体，这这时时细细胞胞内内的的渗渗透透压压很很高高。将将此此菌菌体体快快速速分分散散到到4的的水水中中，细细胞胞迅迅速速吸吸水水会会引引起起某某些些细细胞胞成成分分的的释释放放，甚甚至至细细胞胞破破裂裂。用用渗渗透透冲冲击击法法从从大大肠肠杆杆菌菌中中提提取取卡卡那那霉霉素素乙乙酰酰转转移移酶酶和和从从费费氏氏发发光光杆杆菌菌中中提提取取虫虫荧荧光光素素酶酶效效果果很很好好。渗渗透透冲冲击击法法不不适适用用于于革革兰兰氏氏阳阳性性细细菌菌酶酶的的释释放放，因因为为革革兰兰氏氏阳阳性性细细菌菌的的细胞壁刚性很强。细胞壁

10、刚性很强。2 2物理方法提取（1）超声波）超声波（2）固体剪切）固体剪切（3）液体剪切）液体剪切（4）研磨或搅拌）研磨或搅拌（5）突然降压法）突然降压法（1）超声波 超超声声波波处处理理可可以以破破碎碎细细菌菌细细胞胞，但但也也有有些些细细菌菌如如链链球球菌菌对对超超声声破破碎碎有有很很强强的的抵抵抗抗力力。超超声声波波处处理理的的效效率率取取决决于于多多种种环环境境因因素素，除除处处理理时时间间外外，还还有有悬悬浮浮介介质质的的pH、温温度度和和离离子子强强度度。实实际际应应用用中中基基本本上上是是靠靠经经验验来来选选定定处处理理条条件件，所所用用的的条条件件随着产物和细菌种类的不同而改变。

11、随着产物和细菌种类的不同而改变。超声波破碎只适用于小量细胞的破碎。超声波破碎只适用于小量细胞的破碎。超声波破碎细胞的原理 超超声声波波作作用用于于液液体体会会产产生生一一种种称称为为空空穴穴作作用用的的现现象象，在在液液体体中中出出现现压压缩缩区区和和稀稀疏疏区区，稀稀疏疏区区中中形形成成的的空空穴穴在在稀稀疏疏区区转转变变成成压压缩缩区区时时，空空穴穴中中产产生生的的气气泡泡被被压压缩缩到到几几千千个个大大气气压压，紧紧接接着着气气泡泡崩崩解解形形成成冲冲击击波波。通通常常认认为为此此冲冲击击波波是产生破坏力的主要因素。是产生破坏力的主要因素。超超声声波波细细胞胞破破碎碎仪仪可可调调节节作作

12、用用功功率率和和作作用用时间。时间。（2 2）固体剪切 将将菌菌体体和和磨磨料料（硅硅藻藻土土）混混合合，或或将将菌菌体体冷冷冻冻到到-20，冷冷冻冻生生成成的的冰冰晶晶作作为为磨磨料料。把把它它们们放放入入金金属属块块上上的的圆圆孔孔内内，插插上上密密接接的的金金属属塞塞，向向塞塞顶顶施施加加150230 MPa的的压压力力。此此法法能能使使特特定定的的悬悬浮浮液液中中的的细细胞胞破破碎碎达达到到很很高高的的百百分分数数，但不能用于大规模地破碎。但不能用于大规模地破碎。固体剪切举例 有有一一种种X压压榨榨机机，每每分分钟钟能能加加工工100克克酿酿酒酒酵酵母母。这这是是把把冷冷冻冻细细胞胞从

13、从一一个个多多孔孔圆圆盘盘挤挤出出而而使使细细胞胞破破碎碎的的，孔孔出出口口处处的的温温度度约约为为-22，细细胞胞的的破破碎碎是是由由于于受受挤挤压压的的细细胞胞通通过过小小孔孔所所产产生的剪切力造成的。生的剪切力造成的。（3 3）液体剪切 液液体体剪剪切切与与固固体体剪剪切切原原理理相相似似。只只是是菌菌体体是是以以悬悬浮浮液液的的形形式式压压过过小小孔孔，小小孔孔的的孔孔径径更更小小，压力为压力为55 MPa、137 MPa、275 MPa等几种。等几种。（4 4）研磨或搅拌 研研磨磨或或搅搅拌拌用用的的磨磨料料为为直直径径0.10.2 mm的的玻玻璃璃珠珠，将将玻玻璃璃珠珠和和细细菌菌

14、悬悬液液混混合合后后，高高速速振振荡荡或或强强烈烈搅搅拌拌，使使细细胞胞破破碎碎。除除以以不不同同速速度度滚滚动动的的玻玻璃璃珠珠之之间间有有研研磨磨作作用用外外，细细胞胞和和玻玻璃璃珠珠之之间间还还存存在在互互相相碰碰撞撞。细细胞胞破破碎碎程程度度取取决决于于搅搅拌拌时时间间、搅搅拌拌速速度度、细细胞胞浓浓度度、玻玻璃璃珠珠大大小小、玻玻璃璃珠珠的的量量等等。现现已已证证实实，根根据据这这些些原原理理制制造造的的生生产产装装置置是是破破碎碎某某些些“硬硬”细细胞胞的的最最有有效效的的方方法法，这这些些“硬硬”细细胞胞包包括括变变异异链链球球菌、溶血链球菌、金黄色葡萄球菌和溶壁微球菌。菌、溶血

15、链球菌、金黄色葡萄球菌和溶壁微球菌。（5 5）突然降压法 将将细细胞胞悬悬浮浮液液装装进进高高压压容容器器，加加高高压压至至30Mpa甚甚至至更更高高，打打开开出出口口阀阀门门，使使细细胞胞悬悬浮浮液液迅迅速速流流出出，出出口口处处的的压压力力突突然然降降低低到到常常压压，细胞迅速膨胀而破碎。细胞迅速膨胀而破碎。爆炸式降压法 突突然然降降压压法法的的另另一一种种形形式式称称为为爆爆炸炸式式降降压压法法，它它是是将将细细胞胞悬悬浮浮液液装装入入高高压压容容器器，通通入入氮氮气气或或二二氧氧化化碳碳气气，加加压压至至550Mpa，振振荡荡几几分分钟钟，使使气气体体扩扩散散到到细细胞胞内内，然然后后

16、突突然然排排除除气气体体，压力骤降，使细胞破碎。压力骤降，使细胞破碎。影响突然降压法破碎效果的因素压压力力差差：一一般般压压力力差差要要达达到到3Mpa以以上上，才才有有较较好的破碎效果。好的破碎效果。压压力力降降低低速速度度：压压力力降降低低速速度度越越快快，破破碎碎效效果果越好，压力若在瞬间骤降，可以达到爆炸性效果。越好，压力若在瞬间骤降，可以达到爆炸性效果。细细胞胞的的种种类类和和生生长长期期：此此法法对对大大肠肠杆杆菌菌等等革革兰兰氏氏阴阴性性菌菌的的破破碎碎效效果果较较佳佳，最最好好使使用用对对数数生生长长期期的细胞。的细胞。3 3提取液（1）盐溶液）盐溶液（2）酸溶液）酸溶液（3）

17、碱溶液）碱溶液（4）有机溶剂）有机溶剂（1 1）盐溶液 大大多多数数酶酶都都溶溶于于水水，在在低低盐盐浓浓度度条条件件下下，酶酶的的溶溶解解度度随随盐盐浓浓度度的的升升高高而而增增加加，这这称称为为盐盐溶溶现现象象。当当盐盐浓浓度度达达到到某某一一界界限限后后，酶酶的的溶溶解解度度随随着着盐盐浓浓度度的的升升高高而而降降低低，这这称称为为盐盐析析现现象象。所所以以一一般般采采用用稀稀盐盐溶溶液液提提取取酶酶，盐盐浓浓度度一一般般控控制制在在20500mmol/L。有有少少数数酶酶，如如霉霉菌菌脂脂肪肪酶酶，用用不不含含盐盐的的清清水水提取效果较好。提取效果较好。盐提取液举例 固固体体发发酵酵生

18、生产产的的麸麸曲曲中中的的淀淀粉粉酶酶、蛋蛋白白酶酶等等胞胞外外 酶酶，用用 140mmol/L的的 氯氯 化化 钠钠 溶溶 液液 或或 2050mmol/L的磷酸缓冲液提取。的磷酸缓冲液提取。酵酵母母醇醇脱脱氢氢酶酶用用500mmol/L的的磷磷酸酸氢氢二二钠钠溶溶液液提取。提取。6-磷磷酸酸葡葡萄萄糖糖脱脱氢氢酶酶用用100mmol/L的的碳碳酸酸钠钠溶溶液提取。液提取。枯枯草草杆杆菌菌碱碱性性磷磷酸酸酶酶用用100mmol/L的的氯氯化化镁镁溶溶液提取。液提取。（2 2）酸溶液 有有些些酶酶在在酸酸性性条条件件下下溶溶解解度度较较大大，且且稳稳定定性性较较好好，这这时时可可用用酸酸溶溶液

19、液提提取取。酸酸浓浓度度也也不不能能太太高高，常常选选用用pH36的的范范围围。如如胰胰蛋蛋白白酶酶可可以用以用0.12mol/L的硫酸溶液提取。的硫酸溶液提取。（3 3）碱溶液 有有些些酶酶在在碱碱性性条条件件下下溶溶解解度度较较大大，且且稳稳定定性性好好，这这时时可可用用碱碱溶溶液液提提取取。如如细细菌菌天天冬冬酰酰胺胺酶可用酶可用pH1112.5的碱溶液提取。的碱溶液提取。（4 4）有机溶剂 有有些些与与脂脂质质结结合合牢牢固固或或含含有有较较多多非非极极性性基基团团的的酶酶，可可以以采采用用能能与与水水混混溶溶的的乙乙醇醇、丙丙醇醇、丁丁醇醇等等有有机机溶溶剂剂提提取取。如如琥琥珀珀酸

20、酸脱脱氢氢酶酶、胆胆碱碱脂脂酶酶、细细胞胞色色素素氧氧化化酶酶等等，采采用用丁丁醇醇提提取取，效效果良好。果良好。4 4影响酶提取的主要因素（1）溶解度）溶解度（2）温度）温度（3）pH值值（4）提取液的体积）提取液的体积（5）材料的破碎程度）材料的破碎程度（6）搅拌）搅拌（1 1）溶解度 一一种种物物质质在在某某一一种种溶溶剂剂中中的的溶溶解解度度大大小小与与该该物物质质的的分分子子结结构构及及所所使使用用的的溶溶剂剂的的理理化化性性质质有有密密切切关关系系。一一般般说说来来，极极性性物物质质在在极极性性溶溶剂剂中中的的溶溶解解度度较较大大，非非极极性性物物质质则则在在非非极极性性溶溶剂剂中

21、中溶溶解解度度较较大大。碱碱性性物物质质在在酸酸性性溶溶液液中中溶溶解解度度较大，而酸性物质在碱性溶液中溶解度较大。较大，而酸性物质在碱性溶液中溶解度较大。（2 2）温度 一一般般说说来来，适适当当提提高高温温度度，可可以以提提高高酶酶的的溶溶解解度度，也也可可以以增增大大酶酶分分子子的的扩扩散散速速度度。但但温温度度过过高高容容易易引引起起酶酶的的变变性性失失活活。对对于于一一些些耐耐热热的的酶酶，可可以以适适当当提提高高提提取取温温度度。但但要要注注意意蛋蛋白白酶酶对对目目标标酶酶的的破破坏坏作作用用，可可在在提提取取液液中中加加入入蛋蛋白酶抑制剂。白酶抑制剂。在在等等电电点点条条件件下下

22、，酶酶分分子子的的溶溶解解度度很很小小。不不同同的的酶酶分分子子等等电电点点不不同同，为为了了提提高高酶酶的的溶溶解解度度，应应避避免使用免使用pH与目标酶等电点相近的提取液。与目标酶等电点相近的提取液。（4 4）提取液的体积 增增加加提提取取液液的的用用量量，可可以以提提高高酶酶的的提提取取率率，但但提提取取液液太太多多，会会使使酶酶的的浓浓度度降降低低，对对进进一一步步分分离离纯纯化化不不利利。所所以以提提取取液液的的总总量量一一般般为为原原料料体体积积的的35倍，最好分几次提取。倍，最好分几次提取。（3 3）pH值（5 5）材料的破碎程度 含含酶酶原原料料破破碎碎后后的的颗颗粒粒越越小小

23、，扩扩散散面面积积越越大大，有利于酶的提取。有利于酶的提取。（6 6）搅拌 适适当当搅搅拌拌可可以以使使提提取取液液中中的的酶酶分分子子迅迅速速离离开开原原料料颗颗粒粒的的表表面面，从从而而增增大大两两相相界界面面的的浓浓度度差差，提高提取的效率。提高提取的效率。二、分离纯化1沉淀法沉淀法7疏水层析疏水层析2透析与超滤透析与超滤8羟基磷灰石层析羟基磷灰石层析3冰冻干燥冰冻干燥9亲和层析亲和层析4液液液双水相抽提液双水相抽提10染料配基层析染料配基层析5凝胶层析凝胶层析11几种新型层析方法几种新型层析方法6离子交换层析离子交换层析12.电泳电泳13结晶法结晶法 酶分离纯化的目的 酶酶的的分分离离

24、纯纯化化是是把把目目标标酶酶与与其其它它杂杂质质分分离离开开，使使目目标标酶酶的的纯纯度度提提高高。酶酶的的纯纯度度用用比比活活性性来来衡衡量量。以以电电泳泳结结果果为为单单带带，且且进进一一步步纯纯化化不不能能提提高高比比活活性性为为达达到到均均一一。酶酶制制剂剂的的用用途途不不同同，对酶纯度的要求也不同。对酶纯度的要求也不同。1 1沉淀法 发发酵酵液液或或提提取取液液的的体体积积一一般般很很大大，其其中中酶酶浓浓度度较较低低。为为了了纯纯化化操操作作方方便便，常常需需将将酶酶液液浓浓缩缩。纯纯化化过过程程中中有有时时也也需需要要将将酶酶液液浓浓缩缩。浓浓缩缩除能缩小酶液体积外，还有一定的纯

25、化作用。除能缩小酶液体积外，还有一定的纯化作用。（1 1）盐析法 不不同同的的蛋蛋白白质质在在不不同同的的盐盐浓浓度度下下溶溶解解性性不不同同，在在低低温温下下往往酶酶溶溶液液中中慢慢慢慢加加入入某某种种盐盐，在在不不同同的的盐盐浓浓度度下下有有不不同同的的蛋蛋白白质质沉沉淀淀出出来来，离离心心可可获获得得不不同同的的蛋蛋白白质质沉沉淀淀组组分分，这这叫叫分分级级沉沉淀淀。常常用用的的盐盐是是硫硫酸酸铵铵，因因为为它它在在低低温温下下溶溶解解度度高高，对对大大多多数酶无毒，价廉，有时对酶还有稳定作用。数酶无毒，价廉，有时对酶还有稳定作用。盐析法的操作 在在低低温温下下往往酶酶液液中中慢慢慢慢加

26、加入入硫硫酸酸铵铵粉粉末末并并搅搅拌拌，使使酶酶液液中中的的硫硫酸酸铵铵浓浓度度越越来来越越高高，不不同同的的蛋蛋白白质质在在不不同同的的硫硫酸酸铵铵浓浓度度下下沉沉淀淀出出来来。采采用用分分级级沉沉淀淀的的办办法法，既既能能沉沉淀淀出出目目标标酶酶，又又能能得得到到较较高高的的纯纯化化倍倍数数（纯纯化化后后的的比比活活性性除除以以纯纯化化前前的的比比活活性为纯化倍数）。性为纯化倍数）。盐析法举例 从从大大肠肠杆杆菌菌菌菌株株W3310提提取取青青霉霉素素酶酶是是一一个个典典型型的的例例子子。先先加加硫硫酸酸铵铵至至20浓浓度度（w/v），这这时时酶酶尚尚未未沉沉淀淀，离离心心除除去去已已沉沉

27、淀淀的的杂杂蛋蛋白白；再再加加硫硫酸酸铵铵至至56浓浓度度（w/v），沉沉淀淀出出青青霉霉素素酶酶，酶酶纯纯化化了了5倍倍，同同时时使使体体积积60升升的的样样品品缩缩减减到到重重2.4 kg的浆状沉淀物。的浆状沉淀物。（2 2）有机溶剂沉淀 常常用用来来沉沉淀淀蛋蛋白白质质的的有有机机溶溶剂剂是是乙乙醇醇、甲甲醇醇、丙丙酮酮。不不同同的的蛋蛋白白质质在在不不同同的的有有机机溶溶剂剂浓浓度度下下沉沉淀淀出出来来。离离心心后后的的蛋蛋白白质质沉沉淀淀尽尽快快除除去去有有机机溶溶剂剂，以以免酶在有机溶剂中时间太长而变性。免酶在有机溶剂中时间太长而变性。（3 3）三氯乙酸沉淀 离心后的蛋白质沉淀离心

28、后的蛋白质沉淀尽快恢复到中性尽快恢复到中性pH，以，以免酶在酸性环境下时间太长而变性。免酶在酸性环境下时间太长而变性。（4 4）PEG沉淀 聚乙二醇对聚乙二醇对蛋白质有保护作用，用蛋白质有保护作用，用PEG分分级沉淀纯化效果很好。级沉淀纯化效果很好。PEG2000、4000、6000、8000都可以用。都可以用。沉淀法要注意酶溶液沉淀法要注意酶溶液的的pH、离子强度、蛋、离子强度、蛋白质浓度、温度等条件。白质浓度、温度等条件。热处理沉淀杂蛋白 对对于于耐耐热热的的酶酶还还可可以以采采用用热热变变性性的的方方法法，高高温温下下短短时时间间处处理理，许许多多不不耐耐热热的的蛋蛋白白质质发发生生沉淀

29、，离心后耐热的目标酶保留在上清液中。沉淀，离心后耐热的目标酶保留在上清液中。2 2透析与超滤 透透析析是是将将酶酶液液装装在在半半透透膜膜做做成成的的口口袋袋里里，置置于于透透析析液液中中，酶酶液液中中的的小小分分子子物物质质可可以以透透过过半半透透膜膜进进入入到到透透析析液液中中，而而大大分分子子的的酶酶不不能能透透过半透膜。过半透膜。超超滤滤类类似似于于普普通通的的过过滤滤，只只是是滤滤孔孔很很小小，滤膜的性质以其截留分子量来衡量。滤膜的性质以其截留分子量来衡量。（1 1）透析 将酶液装进透析袋中，置于适当的缓冲液将酶液装进透析袋中，置于适当的缓冲液中，在低温下搅拌，更换几次透析液，可除去

30、中，在低温下搅拌，更换几次透析液，可除去酶液中高浓度的盐及一些小分子杂质，也能起酶液中高浓度的盐及一些小分子杂质，也能起到换缓冲液的作用。到换缓冲液的作用。在装有酶液的透析袋外加在装有酶液的透析袋外加固体固体Sephadex或或PEG吸水，可浓缩酶液。吸水，可浓缩酶液。（2 2）超滤 超超滤滤也也是是一一种种既既可可纯纯化化又又可可浓浓缩缩的的技技术术，它它是是利利用用不不同同孔孔径径的的超超滤滤膜膜，截截留留下下不不同同分分子子量量的的蛋蛋白白质质，从从而而使使分分子子量量不不同同的的蛋蛋白白质质分分离离开开，从从而而达达到到浓缩和纯化的目的。浓缩和纯化的目的。超滤的方式有压滤、真空吸滤和离

31、心超滤三种。超滤的方式有压滤、真空吸滤和离心超滤三种。微孔超滤膜 微微孔孔超超滤滤膜膜类类似似于于传传统统的的滤滤膜膜。膜膜是是刚刚性性的的，上上面面有有随随机机分分布布的的、平平均均大大小小为为50500nm的的孔孔。这这样样，小小分分子子会会通通过过膜膜，而而大大分分子子则则会会被被膜膜挡挡住住。这这种种膜膜的的缺缺点点是是中中等等大大小小的的分子容易堵在孔中，使膜的通透能力逐渐下降。分子容易堵在孔中，使膜的通透能力逐渐下降。各向异性扩散膜 各各向向异异性性扩扩散散膜膜的的出出现现，超超滤滤技技术术取取得得了了突突破破性性的的进进展展，使使超超滤滤成成为为大大规规模模分分离离和和纯纯化化酶

32、酶的的一一种种有有用用技技术术。各各向向异异性性膜膜是是由由一一种种高高度度加加固固的的很很薄薄的的“皮皮”（0.15m）和和作作为为支支持持物物的的支支撑撑在在下下面面的的较较厚厚（20m1mm）的的多多孔孔下下层层结结构构组组成成的的。因因为为活活性性层层很很薄薄，因因此此具具有有极极高高的的通通透透速速率率，而而支支持持物物的的多多孔孔性性又又使使得得任任何何通通过过膜膜的的分分子子不不被被支支持持物物所所阻阻留。留。极化层 超超滤滤时时溶溶剂剂的的流流动动可可被被浓浓度度极极化化作作用用急急剧剧降降低低。这这是是由由于于在在膜膜表表面面形形成成一一层层排排阻阻的的溶溶质质，从从而而阻阻

33、碍碍溶溶剂剂流流动动。由由此此层层造造成成的的对对溶溶剂剂流流动动的的阻阻抗抗会会逐逐渐渐增增高高，直直到到离离开开极极化化层层的的溶溶质质扩扩散散速速率率与与溶溶质质沉沉积积速速率率相相等等为为止止。超超滤滤装装置置设设计计的的目目标标是是使使极极化化层层保保持持在在最最小小值值。实实验验室室的的装装置置是是采采用用搅搅拌拌方方式式增增加加溶溶质质从从极极化化层层离离开开的的速速率率来来达达到到的的。在在较较大大的的装装置置中中，采采用用高高速速通通过过中中空空通通道道的的方方式式来减少极化层的形成。来减少极化层的形成。蛋白质的超滤特性 蛋蛋 白白 质质 的的 超超 滤滤 特特 性性 是是

34、可可 变变 的的。Westmacott（1972）研研究究了了大大肠肠杆杆菌菌部部分分纯纯化化的的青青霉霉素素酶酶制制剂剂的的超超滤滤特特性性，他他使使用用一一种种截截留留分分子子量量30,000的的各各向向异异性性膜膜，由由于于缓缓冲冲液液的的pH和和盐盐浓浓度度不不同同，酶酶的的通通透透量量变变化化在在1.6到到55之之间间；最最高高通通透透量量是是在在pH5.16.2下下，接接近近酶酶的的等等电电点点；在在pH8.0时时，把把缓缓冲冲液液的的浓浓度度从从1 mmol/L提提高高到到30 mmol/L，通通透透量量从从1.6增增加加到到20；加加EDTA也也提高酶的通透量，而尿素有相反的作

35、用。提高酶的通透量，而尿素有相反的作用。析滤 通通过过控控制制影影响响蛋蛋白白质质超超滤滤特特性性的的因因素素，可可使使纯纯化化倍倍数数得得到到明明显显的的提提高高，例例如如大大肠肠杆杆菌菌青青霉霉素素酶酶的的纯纯度度可可提提高高7倍倍。超超滤滤也也可可用用于于快快速速去去除除大大量量的的低低分分子子量量溶溶质质，如如从从酶酶液液中中去去掉掉乙乙醇醇或脱盐，这种过程称为析滤。或脱盐，这种过程称为析滤。3 3冰冻干燥 在在一一密密闭闭容容器器中中对对结结冰冰的的酶酶液液抽抽真真空空，可可使使水水分分升升华华并并抽抽走走，达达到到浓浓缩缩或或干干燥燥的的目目的的。生生物物制制品品最最后后往往往往用

36、用冰冰冻冻干干燥燥法法制制成成成成品品，便便于于贮贮存存和和运运输输。冰冰冻冻干干燥燥的的成成品品使使用用时时加加入入溶溶剂剂（缓缓冲冲液液）后后能能迅迅速速溶溶解解。在在冰冰冻冻干干燥燥前前酶酶液液一一般般应应先先脱脱盐盐，否否则则会会因因形形成成低低共共熔熔混混合合物物，导导致致干干燥燥不不完全、大量发泡和蛋白质变性。完全、大量发泡和蛋白质变性。4 4液液双水相抽提 以以往往通通常常用用离离心心或或过过滤滤的的方方法法使使酶酶从从发发酵酵液液或或菌菌体体匀匀浆浆液液中中分分离离。但但在在中中试试或或扩扩大大生生产产时时，或或因因要要求求相相当当大大容容量量的的高高速速冷冷冻冻离离心心机机（

37、离离心心力力10,000g），或或因因粘粘稠稠而而又又微微细细的的物物质质堵堵塞塞滤滤器器而而致致失失败败。70年年代代初初发发展展起起来来的的液液液液双双水水相相抽抽提提技技术术不不仅仅在在一一定定程程度度上上可可解解决决此此棘棘手手问问题题，且且可可使使酶酶与与多多糖糖、核核酸酸等等可可溶溶性性杂杂质质分分离离，具具有有一一定的提纯效果，有相当的实用价值。定的提纯效果，有相当的实用价值。液液双水相抽提的原理 抽抽提提在在制制药药、化化工工等等行行业业是是一一种种普普遍遍应应用用和和行行之之有有效效的的分分离离提提纯纯技技术术。这这种种抽抽提提的的相相系系统统多多系系有有机机溶溶剂剂组组成成

38、，由由于于大大多多数数酶酶在在有有机机溶溶剂剂中中不不仅仅溶溶解解性性能能差差，而而且且易易变变性性失失活活，因因此此未未能能广广泛泛地地用用于于酶酶的的抽抽提提。早早在在1896年年Beijerinck就就发发现现了了亲亲水水性性聚聚合合物物（hydrophi-lic polymer）水水溶溶液液的的不不相相溶溶性性（incompatibility），今今日日的的液液液液双双水水相相抽抽提提技技术即基于此。术即基于此。原理（续）当当水水溶溶液液中中含含有有一一种种或或一一种种以以上上的的亲亲水水性性聚聚合合物物时时，若若聚聚合合物物的的浓浓度度达达到到一一定定的的阈阈值值以以上上，就就会会形

39、形成成不不相相混混溶溶的的、可可分分离离的的两两相相，这这两两相相都都是是水水溶溶液液。亲亲水水性性聚聚合合物物对对多多数数的的酶酶有有稳稳定定作作用用，因因此此为为酶酶提提供供了了一一个个易易溶溶而而又又不不易易破破坏坏的的抽抽提提环环境境。细细胞胞碎碎片片、多多糖糖、酯酯、核核酸酸以以及及酶酶的的性性质质不不同同，在在两两相相中中分分配配的的情情况况也也不不相相同同，在在多多数数情情况况下酶可与这些杂质迅速而有效地分离。下酶可与这些杂质迅速而有效地分离。原理（续）原原则则上上多多数数的的（但但不不是是所所有有的的）亲亲水水性性的的天天然然或或合合成成的的聚聚合合物物水水溶溶液液在在一一定定

40、的的条条件件下下相相混混 均均 可可 形形 成成 分分 离离 的的 双双 水水 相相，如如 聚聚 乙乙 二二 醇醇（polyethylene glycol）与与右右旋旋糖糖酐酐（dextran），或或聚聚乙乙二二醇醇与与磷磷酸酸钾钾盐盐水水溶溶液液相相混混时时均均可可形形成成分分离离的的双双水水相相。相相的的组组成成及及其其形形成成分分离离相相时时聚聚合物的浓度间的关系可用相图表示。合物的浓度间的关系可用相图表示。双水相的相图相图的说明 液液液液双双水水相相抽抽提提的的相相图图是是一一条条双双曲曲线线，在在双双曲曲线线的的上上方方溶溶液液可可形形成成分分离离的的两两相相，在在下下方方则则为为均

41、均相相。T点点对对应应的的坐坐标标表表示示上上相相的的组组成成，B点点对对应应的的坐坐标标表表示示下下相相的的组组成成。T1、T2、T3 及及B1、B2、B3 称称为为节节点点，连连接接节节点点的的直直线线称称为为节节线线，在在同同一一节节线线上上任任何何一一点点的的上上相相及下相的组成相同，但相体积是不同的。及下相的组成相同，但相体积是不同的。相图的说明 C为为临临界界点点，在在C点点上上相相和和下下相相的的组组成成和和体体积积都都相相同同，加加入入极极少少量量的的水水即即可可导导致致分分离离的的两两相相转转变变成成均均相相。当当体体系系的的总总组组成成为为P点点时时，体体系系分分为为两两相

42、相，上上相相组组成成为为T1，下下相相组组成成为为B1。当当P点点在在T1B1节节线线上上移移动动时时，上上下下两两相相的的组组成成不变，但二者的体积发生变化。不变，但二者的体积发生变化。影响相图的因素 相相图图是是选选择择形形成成分分离离两两相相时时所所含含多多聚聚物物或或盐盐的的量量的的依依据据。有有些些相相图图可可从从资资料料中中查查得得，也也可可通通过过试试验验获获得得所所需需的的相相图图。除除多多聚聚物物或或盐盐的的浓浓度度可可影影响响双双相相的的形形成成外外，多多聚聚物物的的分分子子量量、温温度度、放放置置时时间间及及体体系系中中存存在在的的低低分分子子物物质质等等均可影响双相的形

43、成。均可影响双相的形成。各种双水相系统组分组分聚丙二醇聚丙二醇甲甲基基聚聚丙丙二二醇醇、聚聚乙乙二二醇醇、聚聚乙乙烯烯醇醇、聚聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基葡聚糖、右旋糖酐乙烯吡咯烷酮、羟丙基葡聚糖、右旋糖酐聚乙二醇聚乙二醇聚乙烯醇、右旋糖酐、聚蔗糖聚乙烯醇、右旋糖酐、聚蔗糖甲基纤维素甲基纤维素羟甲基葡聚糖、右旋糖酐羟甲基葡聚糖、右旋糖酐乙基羟乙基纤维素乙基羟乙基纤维素 右旋糖酐右旋糖酐羟丙基葡聚糖羟丙基葡聚糖右旋糖酐右旋糖酐聚蔗糖聚蔗糖右旋糖酐右旋糖酐聚乙二醇聚乙二醇硫硫酸酸镁镁、硫硫酸酸铵铵、硫硫酸酸钠钠、甲甲酸酸钠钠、酒酒石石酸钾钠酸钾钠酶在两相中的分配系数 单单位位体体积积上上相相中中酶酶的的

44、活活性性与与单单位位体体积积下下相相中中酶酶的的活活性性之之比比K称称为为分分配配系系数数：K=CTCB，式式中中CT为为单单位位体体积积上上相相中中酶酶的的活活性性，CB为为单单位位体体积积下下相相中中酶酶的的活活性性。多多聚聚物物或或磷磷酸酸盐盐的的量量、pH值值、离离子子强强度度及及被被抽抽提提物物的的量量均均可可影影响响分分配配系系数数。蛋蛋白白质质的的分分配配系系数数通通常常在在0.110之之间间。分分配配系系数数的的大大小小及及上上下下相相体体积积之之比比与与分分离离效效果果有有关关，分分配配系系数数远远大大于于1且且上上相相体体积积较较大大时时分分离离效效果果较较好好，收收率率较

45、较高。高。收率的计算公式YT为上相收率，为上相收率，YB为下相收率，为下相收率，VT和和VB分别分别为上、下相的体积，为上、下相的体积，K为分配系数。为分配系数。双水相抽提的应用特点 常常用用的的液液液液双双水水相相抽抽提提系系统统有有两两种种类类型型。第第一一类类相相系系统统由由聚聚乙乙二二醇醇和和右右旋旋糖糖酐酐组组成成，形形成成两两相相后后上上相相为为聚聚乙乙二二醇醇富富相相（PEG-rich phase），下下相相为为右右旋旋糖糖酐酐富富相相（dextran-rich phase）。第第二二类类相相系系统统由由聚聚乙乙二二醇醇和和盐盐（常常用用的的为为磷磷酸酸钾钾或或硫硫酸酸铵铵）组组

46、成成，上上相相仍仍为为聚聚乙乙二二醇醇富富相相，下下相相为为盐盐富富相相。无无论论哪哪种种类类型型，各各相相均均含含有有70以以上上的的水分，故为酶的溶解与抽提提供了适宜的环境。水分，故为酶的溶解与抽提提供了适宜的环境。双水相抽提的应用特点 所所需需设设备备比比较较简简单单，仅仅需需一一个个可可使使粗粗提提液液与与两两相相系系统统充充分分混混合合及及放放置置的的贮贮罐罐和和低低速速离离心心机机或或使使两两相迅速分离的分离器。相迅速分离的分离器。操操作作方方便便，条条件件温温和和。在在液液液液双双水水相相抽抽提提中中，由由于于聚聚乙乙二二醇醇、右右旋旋糖糖酐酐这这类类多多聚聚物物可可作作为为酶酶

47、活活性性的的稳稳定定剂剂，即即使使在在常常温温下下操操作作酶酶活活性性也也不不易易损损失失。若若相相系系统统选选择择合合适适，收收率率一一般般可可在在8090。此此法法不不仅仅能能使使酶酶和和细细胞胞碎碎片片、多多糖糖、酯酯、核核酸酸等等杂杂质质迅迅速速分分开开，而而且且有有一一定定的的提提纯纯效效果果，提提纯纯倍倍数数可可为为220倍倍。双水相连续抽提 液液液液双双水水相相抽抽提提技技术术在在开开始始时时仅仅用用于于粗粗提提液液的的处处理理，现现已已发发展展到到用用于于后后处处理理工工艺艺的的精精制制阶阶段段，即即经经几几次次连连续续的的液液液液双双水水相相抽抽提提使使产产品品获获得得相相当

48、当高高的的纯纯度度。如如由由保保依依地地尼尼假假丝丝酵酵母母发发酵酵产产生生的的甲甲酸酸脱脱氢氢酶酶经经四四次次连连续续抽抽提提得得到到总总收收率率为为70，纯纯度度大大于于70的的产产品品。此此产产品品的的质质量量符符合合NADH辅辅酶酶再再生生酶酶膜膜反反应应器器用用酶酶的的需需要要，同同时时由由于于工工艺艺简简单单，原原材材料料成成本本低低，产产品品价价格格大大幅幅度度地地降降低。低。5 5凝胶层析（凝胶过滤、分子筛层析、排阻层析）（凝胶过滤、分子筛层析、排阻层析）凝凝胶胶层层析析的的原原理理可可以以用用3-氯氯-1,2-环环氧氧丙丙烷烷交交联联的的Sephadex凝凝胶胶（交交联联葡葡

49、聚聚糖糖凝凝胶胶）来来说说明明。所所用用的的葡葡聚聚糖糖（也也称称为为右右旋旋糖糖酐酐）是是由由肠肠膜膜明明串串珠珠菌菌产产生生的的产产物物，葡葡萄萄糖糖残残基基主主要要以以-1,6-糖糖苷苷键键连连接接。交交联联程程度度受受所所用用的的3-氯氯-1,2-环环氧氧丙丙烷烷含含量量控控制制，从从而而决决定定了了凝凝胶胶基基质质的的水水合合（复复得得水水）程程度度及及凝凝胶胶的的孔孔隙隙度度。每每单单位位干干重重凝凝胶胶复复得得的的水水越越多多，其其孔孔隙隙度度也也越越大大，它它所所能能分分级级分分离离的的分分子子也也越越大大。葡葡聚聚糖糖交联剂之比越大，孔隙度也越大，反之孔隙度小。交联剂之比越大

50、，孔隙度也越大，反之孔隙度小。凝胶层析原理 若若将将一一混混合合物物上上样样到到柱柱的的上上端端，洗洗脱脱时时，大大分分子子量量的的分分子子因因不不能能进进入入凝凝胶胶颗颗粒粒内内部部的的孔孔隙隙而而最最先先流流出出，而而小小分分子子量量的的分分子子因因能能进进入入凝凝胶胶颗颗粒粒内内部部，延延长长了了行行进进的的路路线线而而后后流流出出。不不能能进进入入凝凝胶胶颗颗粒粒内内部部的的最最小小分分子子的的分分子子量量称称为为该该凝凝胶胶的的排排阻阻限限度度。在在能能进进入入凝凝胶胶颗颗粒粒内内部部的的分分子子当当中中，分分子子量量较较大大的的先先流流出出，分分子子量量较较小小的的后后流流出出，这

51、这样样就就能能将将不不同同分分子子量量大大小小的的物物质质分分开开。将将洗洗脱脱液液分分部部收收集集，找找出出酶酶活活性峰所在的管，即可得到纯化的酶。性峰所在的管，即可得到纯化的酶。凝胶层析的原理分分子子太太大大，都都不不能能进进入入凝凝胶胶颗颗粒粒，大大小小不不等等的的分分子子最最早早同时流出。同时流出。分分子子太太小小，都都能能进进入入到到凝凝胶胶颗颗粒粒的的最最小小孔孔中中，大大小小不不等等的的分分子子最最晚同时流出。晚同时流出。有有效效分分离离范范围围，按按分分子子从从大大到到小小依次流出。依次流出。排阻限度排阻限度凝胶层析柱的再生用洗脱液一直洗即可使柱再生。用洗脱液一直洗即可使柱再生

52、。交联葡聚糖柱层析洗脱曲线凝胶层析的分配系数 凝凝胶胶层层析析过过程程是是溶溶质质分分子子在在流流动动的的溶溶剂剂相相和和多多孔孔胶胶粒粒构构成成的的固固定定相相的的内内部部孔孔隙隙间间进进行行扩扩散散分分配配的的过过程程。分分配配系系数数Kav可可简简单单地地从从以以下下公公式式得得出：出：Kav(VeVo)/(VtVo)式式中中Ve从从柱柱上上洗洗脱脱下下溶溶质质需需溶溶剂剂的的体体积积，Vo外水体积，外水体积，Vt柱床的总体积。柱床的总体积。利用凝胶层析测定蛋白质的分子量 经经验验表表明明，Kav值值与与分分子子量量的的对对数数成成反反比比。凝凝胶胶层层析析除除可可用用于于分分离离分分子

53、子量量不不同同的的蛋蛋白白质质分分子子外外，还还可可用用来来测测定定蛋蛋白白质质分分子子的的分分子子量量。先先用用若若干干种种已已知知分分子子量量的的蛋蛋白白质质分分别别测测出出其其Kav值值，以以分分子子量量的的对对数数为为纵纵坐坐标标，以以Kav值值（或或简简单单地地以以洗洗脱脱体体积积）为为横横坐坐标标，作作出出标标准准曲曲线线，再再测测出出未未知知分分子子量量蛋蛋白白质质的的Kav值值（或或洗洗脱脱体体积积），在在曲曲线上可查出其分子量的对数。线上可查出其分子量的对数。凝胶层析介质的型号 Sephadex有有不不同同的的型型号号，如如Sephadex G-100，Sephadex G-

54、25等等。Sephacryl是是交交联联的的烯烯丙丙基基葡葡聚聚糖糖和和N,N甲甲叉叉双双丙丙烯烯酰酰胺胺共共聚聚物物，如如Sephacryl S-100,S-200,S-300,S-400,S-500,S-1000等，后面的数字越大则孔隙度越大。等，后面的数字越大则孔隙度越大。凝胶层析介质的型号 近近年年来来，除除了了上上述述Sephadex和和Sephacryl外外，还还有有多多种种材材料料用用作作凝凝胶胶层层析析的的基基质质，如如聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺（Bio Gel P系系列列）、琼琼脂脂糖糖（Sepharose 2B，4B，6B和和Bio Gel A系系列列）、交交联联琼琼脂脂糖糖（S

55、epharose CL-2B，CL-4B，CL-6B）、高高度度交交联联琼琼脂脂糖糖（Superose 6，12）、交交联联琼琼脂脂糖糖和和葡葡聚聚糖糖（Superdex 30，75，200）、聚聚苯苯乙乙烯烯、琼琼脂脂糖糖聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺混混合合物物、多多孔孔玻玻璃璃和和聚聚甲甲基基丙丙烯烯酸酸甲甲酯酯等等。（一一般般是是后后面面的的数数字字越越大大孔孔隙隙度度越大，但越大，但Sepharose相反）。相反）。SephadexSephadex的型号和特性型号型号干颗粒直径干颗粒直径（m）干胶吸水量干胶吸水量（ml/g）干胶溶胀度干胶溶胀度（ml/g）蛋白质分离范围蛋白质分离范围 G104

56、0120 1.00.123 700G25粗粗中中细细超超细 100 30050 15020 8010 402.50.2461kD5kDG50粗粗中中细细超细超细 1003005015020801040 5.00.39111.5kD30kDG100超细超细 40 12010 40101.515204kD150kD4kD100kDG200超细超细 40 12010 40202.030405kD600kD5kD250kDSepharose的型号与特性型号型号琼脂糖含琼脂糖含量（量（%）湿颗粒直径湿颗粒直径（m）蛋白蛋白质分离范围分离范围 2B2206070kD40000kD4B4146060kD20

57、000kD6B645165 10kD4000kD6 6离子交换层析 离离子子交交换换剂剂分分为为阳阳离离子子交交换换剂剂和和阴阴离离子子交交换换剂剂两两类类，阳阳离离子子交交换换剂剂的的衬衬质质上上带带有有阳阳离离子子交交换换基基团团，常常见见的的阳阳离离子子交交换换基基团团有有-SO3H、-COOH、-CH2COOH(CM)等等；阴阴离离子子交交换换剂剂的的衬衬质质上上带带有有阴阴离离子子交交换换基基团团，常常见见的的阴阴离离子子交交换换基团有基团有-NH3Cl、二乙基胺乙基（、二乙基胺乙基（DEAE）等。）等。离子交换层析分离蛋白质的原理 蛋蛋白白质质分分子子上上具具有有各各种种阴阴阳阳离

58、离子子基基团团，在在一一定定的的pH和和离离子子强强度度下下，这这些些基基团团可可与与离离子子交交换换剂剂上上的的相相应应基基团团进进行行离离子子交交换换，使使蛋蛋白白质质分分子子吸吸附附到到离离子子交交换换剂剂上上。改改变变pH和和（或或）离离子子强强度度又可将这些吸附的蛋白质洗脱下来。又可将这些吸附的蛋白质洗脱下来。离子交换层析分离蛋白质的原理 在在一一定定的的上上样样和和洗洗脱脱条条件件下下，不不同同蛋蛋白白质质分分子子所所带带的的净净电电荷荷和和电电荷荷密密度度不不同同，分分子子大大小小也也不不同同，它它们们与与离离子子交交换换剂剂的的结结合合力力不不同同，结结合合力力较较弱弱的的先先

59、洗洗脱脱（elute）下下来来，结结合合力力较较强强的的后后洗洗脱脱下下来来，从从而达到分离的目的。而达到分离的目的。洗洗脱脱的的方方式式有有单单一一溶溶液液洗洗脱脱、阶阶段段洗洗脱脱和和梯梯度度洗洗脱脱等等。洗洗脱脱时时可可改改变变洗洗脱脱液液的的pH，也也可可改改变变洗洗脱脱液的离子强度，甚至二者同时改变。液的离子强度，甚至二者同时改变。蛋白质的离子交换性质 在在一一般般情情况况下下，碱碱性性蛋蛋白白质质（等等电电点点大大于于pH7.0）在在pH小小于于等等电电点点时时带带正正电电荷荷，被被阳阳离离子子交交换换剂剂吸吸附附；酸酸性性蛋蛋白白质质（等等电电点点小小于于pH7.0）在在pH大大

60、于于等等电电点点时时带带负负电电荷荷，被被阴阴离离子交换剂吸附。子交换剂吸附。离子交换层析一般在偏中性条件下上样。离子交换层析一般在偏中性条件下上样。离子交换剂衬质的种类 离离子子交交换换剂剂的的衬衬质质（也也称称载载体体）常常见见的的有有树树 脂脂、纤纤 维维 素素（cellulose）、葡葡 聚聚 糖糖 凝凝 胶胶（Sephadex）、琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶（Sepharose）、丙丙烯酸共聚物（烯酸共聚物（Trisacryl）等。）等。离子交换树脂 离离子子交交换换树树脂脂物物理理性性能能稳稳定定，蛋蛋白白质质吸吸附附容容量量高高，装装柱柱时时沉沉降降迅迅速速，洗洗脱脱时时允允许许高高流流

61、速速，但但它它的的高高吸吸附附力力在在用用于于蛋蛋白白质质纯纯化化时时却却往往往往是是缺缺点点，因因为为蛋蛋白白质质可可能能经经受受不不住住从从树树脂脂上上洗洗脱脱下下来来所所必必需需的的激激烈烈条条件件，所所以以不不常常用用于于蛋蛋白白质质的纯化。的纯化。离子交换纤维素 离离子子交交换换纤纤维维素素价价格格较较廉廉，交交换换容容量量较较低低，一一般般为为离离子子交交换换树树脂脂交交换换容容量量的的十十分分之之一一，洗洗脱条件温和，是常用的离子交换剂。脱条件温和，是常用的离子交换剂。离子交换SephadexSephadex 离离子子交交换换Sephadex凝凝胶胶是是在在Sephadex G-

62、25或或Sephadex G-50上上引引入入DEAE或或CM基基团团制制备成的。备成的。以以Sephadex G-50为为衬衬质质的的离离子子交交换换凝凝胶胶具具有有高高蛋蛋白白容容量量，但但它它们们较较软软，而而且且在在缓缓冲冲液液pH或或离离子子强强度度改改变变时时会会收收缩缩或或膨膨胀胀，不不宜宜用用于柱层析。于柱层析。离子交换SepharoseSepharose和TrisacrylTrisacryl 把把DEAE或或CM基基团团引引入入交交联联琼琼脂脂糖糖或或丙丙烯烯酸酸共共聚聚物物可可得得到到离离子子交交换换Sepharose和和Trisacryl。这这两两种种类类型型的的离离子子

63、交交换换剂剂是是由由小小而而均均匀匀的的、能能确确保保高高流流速速的的珠珠形形颗颗粒粒组组成成，具具有有高高蛋蛋白白容容量量。它它们们在在一一般般层层析析压压力力下下不不变变形形，更更重重要要的的是是它它们们在在离离子子强强度度改改变变时时及及极极端端pH下下都都不不会会收收缩缩或或膨膨胀胀，因因此此可可在在柱柱中中再再生，在大规模操作时这是很主要的优点。生，在大规模操作时这是很主要的优点。离子交换剂的再生阳离子交换剂：阳离子交换剂：0.5N HCl0.5N NaOH0.5N HCl水水平衡平衡阴离子交换剂：阴离子交换剂：0.5N NaOH0.5N HCl0.5N NaOH水水平衡平衡“批式”

64、离子交换 离离子子交交换换剂剂除除用用于于柱柱层层析析外外，还还可可用用于于“批批式式（batch）”方方法法。它它是是把把离离子子交交换换剂剂加加到到具具有有一一定定离离子子强强度度和和pH的的大大体体积积酶酶液液中中，使使酶酶交交换换到到离离子子交交换换剂剂上上，把把吸吸附附了了酶酶的的离离子子交交换换剂剂与与溶溶液液分分开开，再再将将离离子子交交换换剂剂放放入入小小体体积积洗洗脱脱液液中中洗洗脱脱。这这样样不不仅仅能能使使酶酶得得到到一一定定的的纯纯化化，还可达到浓缩的目的。还可达到浓缩的目的。“批式”法的优缺点 批批式式方方法法操操作作简简便便，但但一一般般来来说说，批批式式方方法法比

65、比柱柱层层析析纯纯化化效效果果差差，但但对对某某些些等等电电点点离离中中性性很很远远的的酶酶来来说说，采采用用批批式式方方法法也也能能得得到到较较好好的的纯纯化化效效果果。如如用用CM-纤纤维维素素批批式式法法可可将将等等电电点为点为pH8.6的的L-天冬酰胺酶纯化天冬酰胺酶纯化100倍。倍。7 7疏水层析 Shaltiel等等人人在在1972年年发发现现溴溴化化氰氰活活化化的的琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶被被碳碳链链长长短短不不同同的的烃烃类类衍衍生生物物取取代代后后，可可选选择择性性地地吸吸附附某某些些酶酶。进进一一步步的的研研究究表表明明，这这种种选选择择性性的的吸吸附附作作用用是是琼琼脂脂糖糖

66、凝凝胶胶介介质质与与酶酶之间的疏水力作用的结果。之间的疏水力作用的结果。疏水层析的原理 酶酶分分子子的的表表面面既既有有亲亲水水性性的的基基团团或或区区域域，也也有有非非极极性性的的疏疏水水基基团团(如如亮亮氨氨酸酸、异异亮亮氨氨酸酸、缬缬氨氨酸酸、苯苯丙丙氨氨酸酸)或或区区域域。疏疏水水基基团团或或区区域域可可在在酶酶分分子子的的表表面面，也也可可处处于于亲亲水水区区域域包包围围之之中中，形形成成疏疏水水性性的的小小孔孔或或袋袋。在在一一定定的的条条件件下下，琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶上上的的疏疏水水基基团团可可以以和和酶酶分分子子表表面面或或孔孔袋袋中中的的疏疏水水基基团团发发生生疏疏水水相相互互作作用用，使使酶酶分分子子吸吸附附到到凝凝胶胶上上。用用能能减减弱弱疏疏水水相相互互作作用用的的洗洗脱脱液液洗洗脱脱，就就能能把把疏疏水相互作用强弱不等的物质依次洗脱下来。水相互作用强弱不等的物质依次洗脱下来。疏水层析介质 目目前前常常用用的的三三种种疏疏水水层层析析介介质质是是Butyl-Sepharose CL-4B、Phenyl-Sepharose CL-4B和和Octyl-Sepharo