引物设计实例分析ppt课件

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1、引物设计实例分析引物设计实例分析引物设计实例分析1引物设计基本原则引物长度（primer length）产物长度（product length）序列Tm值(melting temperature)G+C含量（composition）引物二聚体及发夹结构 （duplex formation and hairpin）阅读框引物设计基本原则引物长度（primer length）21.引物的长度 一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74，即Taq酶的最适温度1.引物的长度 一般为15-30bp，常用的32.产物的长度 扩增片段长度为100600碱基

2、对.2.产物的长度 扩增片段长度为100600碱基对.43.Tm值 引物的Tm值一般控制在55-60度,尽可能保证上下游引物的Tm值一致,一般不超过2度.如果引物中的G+C含量相对偏低,则可以使引物长度稍长,而保证一定的退火温度.Tm=2(A+T)+4(C+G)3.Tm值 引物的Tm值一般控制在55-654.引物的GC含量 有效引物中(G+C)的比例为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。4.引物的GC含量 有效引物中(G+65.引物自身 引物间3端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败 5.引物自身 71.打开软件，调入序列 1.打开软件，调入

3、序列 82、选择路径，选择序列文件名，加入右框 2、选择路径，选择序列文件名，加入右框 93、序列文件显示如图，点击“primer”；4.按照引物设计的原理，设定引物的各种参数，点击“确定”进行引物搜寻 3、序列文件显示如图，点击“primer”；4.按照引物105、等待引物搜寻，显示结束后，点击“确定”。5、等待引物搜寻，显示结束后，点击“确定”。116、按照搜寻结果显示，逐条分析，在主窗口中检查该引物对的二级结构情况，依次筛选 6、按照搜寻结果显示，逐条分析，在主窗口中检查该引物对的二级12Primer Premier5的引物评价窗口Primer Premier5的引物评价窗口13任务任务

4、用绿色荧光蛋白用绿色荧光蛋白(GFP)标记蛋白标记蛋白NR1任务14SPBamHIpcDNA3.1NR1Plasmid 1:Plasmid 2GFPSPBamHIpcDNA3.1NR1Plasmid 1:P15SPBamHI(GGATCC)pcDNA3.1NR1-1aGFPSPBamHI(GGATCC)pcDNA3.1NR1-1aG16 121 ggggctccta gagaacccgg gggcgcttga ccgcgcgcgg gcggcccgcg ggtcgtacat 181 cgcgaggtcg tcgcactcgc gcaacccaga gccaggcccg ctgtgcccgg a

5、gctcatgag 241 caccatgcac ctgctgacat tcgccctgct tttttcctgc tccttcgcc c gcgcggatcc 301 cgaccccaag atcgtcaaca tcggcgcggt gctgagcacg cgcaagcatg aacagatgtt 361 ccgcgaggca gtaaaccagg ccaataagcg acacggctct tggaagatac agctcaacgc 421 cacttctgtc acccacaagc ccaacgccat acagatggcc ctgtcagtgt gtgaggacct 481 catct

6、ctagc caggtctacg ctatcctagt tagccacccg cctactccca acgaccactt 541 cactcccacc cctgtctcct acacagctgg cttctacaga atccctgtcc tgggactgac 601 tacccgaatg tccatctact ctgacaagag tatccacctg agtttccttc gcacggtgcc 661 gccctactcc caccagtcca gcgtctggtt tgagatgatg cgagtctaca actggaacca 721 catcatcctg ctggtcagcg acg

7、accacga gggacgggca gcgcagaagc gcttggagac 781 gttgctggag gaacgggagt ccaaggcaga gaaggtgctg cagtttgacc caggaaccaa NR1的编码序列的编码序列(4000bp)红色红色为信号肽,蓝色蓝色为BamHI酶切位点,下划线下划线标出酶切位点的阅读框 NR1的编码序列(4000bp)红色为信号肽,蓝色为Ba17ATGGTGAGCAAG GGCGAGGAGC TGTTCACCGG GGTGGTGCCC ATCCTGGTCG AGCTGGACGG CGACGTAAAC GGCCACAAGT TCAGCGT

8、GTC CGGCGAGGGC GAGGGCGATG CCACCTACGG CAAGCTGACC CTGAAGTTCA TCTGCACCAC CGGCAAGCTG CCCGTGCCCT GGCCCACCCT CGTGACCACC TTCGGCTACG GCCTGCAGTG CTTCGCCCGC TACCCCGACC ACATGAAGCA GCACGACTTC TTCAAGTCCG CCATGCCCGA AGGCTACGTC CAGGAGCGCA CCATCTTCTT CAAGGACGAC GGCAACTACA AGACCCGCGC CGAGGTGAAG TTCGAGGGCG ACACCCTGGT

9、 GAACCGCATC GAGCTGAAGG GCATCGACTT CAAGGAGGAC GGCAACATCC TGGGGCACAA GCTGGAGTAC AACTACAACA GCCACAACGT CTATATCATG GCCGACAAGC AGAAGAACGG CATCAAGGTG AACTTCAAGA TCCGCCACAA CATCGAGGAC GGCAGCGTGC AGCTCGCCGA CCACTACCAG CAGAACACCC CCATCGGCGA CGGCCCCGTG CTGCTGCCTAC CAGTCCGCCC TGAGCAAAGA CCCCAACGAG AAGCGCGATC A

10、CATGGTCCT GCTGGAGTTC GTGACCGCCG CCGGGATCAC TCTCGGCATG GACGAGCTGT ACAAGTAAGFP序列(700bp)GFP序列(700bp)18引物要求PCR扩增GFPGFP两边添加BamHI酶切位点保证NR1的阅读框不改变引物要求PCR扩增GFP195 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA 3 3 TACCACTCGTTCCCGCTCCTCGAGAGCCGTACCTGCTCGACATGTTCATT 5GFP序列5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC TCTCGGC

11、ATGGACGAGCTGTACAAGTAA 3 3 TACCACTCGTTCCCGCTCCTCGCGTACCTGCTCGACATGTTCATT 5Primer1:5ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC.AGAGCCGTACCTGCTCGACATGTTCATT 5 Primer2Primer1:5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC.Primer2:5 TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA.Primer1:5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC.Primer2:5 CTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA.第一步：扩增第一步：扩增GFP基

12、本序列基本序列变性变性,引物复性引物复性GFP序列3 TACCACTCGTTCCCGCTCCTCG20第二步：GC比值；Tm值Primer1:5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA.Primer2:5 CTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA.Primer1:5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA（GC:60%,Tm：64）Primer2:5 CTTGTACAGCTCGTCCATGCC（GC:57%,Tm：66）第二步：GC比值；Tm值Primer1:5 ATG21第三步：酶切位点Primer1:5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA（GC:60%,Tm：64）Pr

13、imer2:5 CTTGTACAGCTCGTCCATGCC（GC:57%,Tm：66）BamHI:ggatccPrimer1:5 ggatccATGGTGAGCAAGGGCGAGGA Primer2:5 ggatccCTTGTACAGCTCGTCCATGCC 第三步：酶切位点Primer1:5 ATGGTGA22第四步：阅读框atgagcaccatgcacctgctgacattcgccctgcttttttcctgctccttcgcc cgc gcg gat ccc gaccccaag atcgtcaaca tcggcgcggt gctgagcacg cgcaagcatg aacagatgttc

14、cgcgaggca gtaaaccagg ccaataagcg acacggctct tggaagatac agctcaacgccacttctgtc acccacaagc ccaacgccat acagatggcc ctgtcagtgt gtgaggacct.Primer1:5 ggatccATGGTGAGCAAGGGCGAGGANR1序列：序列：Primer1:5 ggatccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGA第四步：阅读框atgagcaccatgcacctgctgac23atgagcaccatgcacctgctgacattcgccctgcttttttcctgctccttcgcc c

15、gc gcg gat ccc gaccccaag atcgtcaaca tcggcgcggt gctgagcacg cgcaagcatg aacagatgttccgcgaggca gtaaaccagg ccaataagcg acacggctct tggaagatac agctcaacgccacttctgtc acccacaagc ccaacgccat acagatggcc ctgtcagtgt gtgaggacctNR1序列：序列：5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA 3 GFP序列cgc gcg gat ccTATGGTG

16、AGCAAGGGCGAGGAGC TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAG?ggat ccc gaccccaag atcgtcaaca tcggcgcggt gctgagcacg cgcaagcatg aacagatgttccgcgaggca gtaaaccagg ccaataagcg acacggctct tggaagatac agctcaacgccacttctgtc acccacaagc ccaacgccat acagatggcc ctgtcagtgt gtgaggacct插入插入GFP后的组合序列后的组合序列atgagcaccatgcacctgctgacattcgcc24Primer2:5 ggatccCTTGTACAGCTCGTCCATGCCPrimer2:5 gg atc cct CTTGTACAGCTCGTCCATGCCPrimer2:5 ggatccCTTGTACAG25第五步 保护序列Primer1:5 GCGGggatccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAPrimer2:5 GCGCggatccctCTTGTACAGCTCGTCCATGCC第五步 保护序列Primer1:5 GCGGgg26引物设计实例分析ppt课件27