第五章-STR自动分型解析ppt课件

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1、第六章STR自动分型第六章STR自动分型1STR自动分型特点：自动化程度高快速、灵敏、准确、稳定重复性好核心：建立多基因复合扩增体系时采用3-4种荧光染料分别标记不同的STR基因座引物，同一种荧光染料标记的STR基因座扩增产物大小不重复。复合扩增产物的片段分离识别及各个等位基因命名由自动化设备完成。STR自动分型特点：自动化程度高2荧光标记STR复合扩增实质：实质：采用四、五种荧光染料，其中一种用于染料与复合扩增产物混合后同步电泳的分子量内标DNA片段，余下的3或4种染料颜色标记STR基因座。荧光染料标记在引物的5端，扩增后使相应PCR产物的一条链均携带标记引物的荧光染料。使扩增产物在检测设备

2、上易识别。注意事项注意事项:同一荧光标记的不同STR的等位基因片段范围不能重叠，前一个STR最大的等位基因与后一个STR最小的等位基因相距最少10bp。在一个荧光复合扩增体系中，组合荧光染料的发射波长相差越大越好。荧光标记STR复合扩增实质：采用四、五种荧光染料，其中一种用3荧光标记的分析方法荧光标记的分析方法荧光法：亦称荧光PCR技术（fluoresencePCR,F-PCR），是1995年由美国PE公司首先研制成功。在荧光染料与引物保持完整时，荧光报告基团的荧光被荧光抑制基团淬灭，而在荧光染料与引物分离后，荧光报告基团才发出报告荧光，且荧光的强度与PCR产物的数量呈正比。荧光检测仪器透过P

3、CR管壁能直接检测到荧光信号的波长和长度变化。荧光法融汇了PCR的灵敏性、DNA的特异性和光谱技术精确定量的优点，电脑同步跟踪，数据自动化处理，直接探测PCR过程中的变化以获得定量的结果，不需要做PCR后处理或检测，完全闭管操作。荧光标记的分析方法荧光法：亦称荧光PCR技术（fluores4荧光标记方法示意图荧光标记方法示意图毛细管电泳图谱8repeats10repeatsLocus18repeats9repeatsLocus2荧光标记方法示意图毛细管电泳图谱8repeats10re5步骤步骤步骤：1多色荧光标记STR复合扩增。2扩增产物电泳前进行处理。3毛细管电泳分离STR片段，激光诱导的荧

4、光检测，由设备检测并数据化存储。4自动数据采集并分型。荧光颜色分离，计算片段大小，确定各个等位座的基因分型。步骤步骤：6毛细管电泳毛细管电泳毛细管电泳仪的基本结构包括高压直流电源，荧光激发光源，荧光检测器，自动样品盘和控制进样、电泳、检测与记录的计算机。适用范围适用范围：能够检测100500bp范围，长度相差1bp的两个DNA片段。毛细管电泳毛细管电泳仪的基本结构包括高压直流电源，荧光激发光7分离分离DNA片段的机制片段的机制毛细管中的聚合物溶液在一定的浓度下形成筛网状结构。DNA片段在溶液中泳动时，不同片段DNA受到的阻力不同，小片段较大片段受到阻力小，易通过。变性的DNA片段电泳迁移率与片

5、段的大小表现为线性关系。分离DNA片段的机制毛细管中的聚合物溶液在一定的浓度下形成筛8第五章-STR自动分型解析ppt课件9荧光标记STR基因分析技术是利用荧光标记的引物在PCR扩增STR基因座时，使PCR产物的一条链带上荧光标记。这种带有荧光分子的DNA片段在凝胶中从阴极向阳极迁移，按片段长度大小排列，当迁移到阳极端的激光扫描仪的扫描窗口，荧光染料受到激发，发出一定波长的光，按荧光强度记录下来，每一每一个带荧光染料的个带荧光染料的DNA片段电泳轨迹按各自通过激光扫描窗口的片段电泳轨迹按各自通过激光扫描窗口的实际时间被记录下来，以荧光吸收峰来表示每一个片段。实际时间被记录下来，以荧光吸收峰来表

6、示每一个片段。峰值越高，表示该片段量越多；峰出现的时间与片段大小有直接关系，片段越小，峰越早出现。计算机保存所有片段通过扫描窗口的实际时间及其荧光特征。过过 程程荧光标记STR基因分析技术是利用荧光标记的引物10ABI310的检测路径图ABI310的检测路径图11ABI310遗传分析仪遗传分析仪（310GeneticAnalyzer）毛细管聚合胶注射器自动取样盘缓冲液电极缓冲液ABI310遗传分析仪（310GeneticAnaly12毛细管电泳原理毛细管电泳原理毛细管电泳原理13电泳上样前样品处理变性对检验结果的影响对近百份血液(斑)、精斑、烟头及组织等生物样品分型结果进行比较发现，使用310

7、电泳时，样品变性与否不影响检验结果,可简化了检验方法。310上样样品组成为12ul去离子甲酰胺、0.3ul0.5ulROX及lulPCR扩增产物，混匀后即可上样电泳。电泳前未变性而得到与变性一样检验结果的原因可能为：第一去离子甲酰胺(中性或弱酸性)本身有变性作用；第二于7M尿素变性聚丙烯酰胺凝胶毛细管电泳中60电泳时本身可使样品变性；第三上述一、二的联合作用。电泳上样前样品处理变性对检验结果的影响14甲酰胺及ROX对检验结果的影响长久暴露于空气中的去离子甲酰胺被氧化成甲酸盐，后者在电泳进样时有两个不利作用，一是甲酸盐会与PCR产物中的DNA竞争吸附于毛细管上，减少PCR产物中DNA上样量.二是

8、甲酸盐本身会淬灭荧光，这两个作用的结果是降低毛细管电泳检测灵敏度，使本该能检见PCR扩增产物的结果表现为阴性。PCR扩增后模板DNA量会成千上百万倍增长，有时分析结果时虽可以看到很高PCR峰，但无法分析这些结果，原因是甲酸盐甲酸盐竞争的结果使竞争的结果使ROX进样量很少进样量很少(甲酸盐也能降解DNA)，无法比对分析。所以，去离子甲酰胺应分装于去离子甲酰胺应分装于0.5ml离心管内，冰冻离心管内，冰冻保存，防止氧化，每次使用一个保存，防止氧化，每次使用一个；电泳时ROX用量应合适，太多则浪费，太少则电泳顺序越靠后的样品，有可能无法分析结果。去离子甲酰胺较甲酰胺纯度为高，可增加毛细管电泳检测灵敏

9、度。甲酰胺及ROX对检验结果的影响长久暴露于空15DNA 分型分型电泳对荧光颜色不同的电泳对荧光颜色不同的DNADNA片断的峰进行长片断的峰进行长度检测，并对应不同的颜色。度检测，并对应不同的颜色。DNADNA片断与内片断与内标比较后确定长度。标比较后确定长度。最后与以同样方式确定的等位基因最后与以同样方式确定的等位基因LadderLadder比比较，得到未知样本的较，得到未知样本的PCRPCR产物片断分型。产物片断分型。DNA分型电泳对荧光颜色不同的DNA片断的峰进行长度检测，16310分析原始图谱分析原始图谱（Rawdata）310分析原始图谱（Rawdata）17第五章-STR自动分型解

10、析ppt课件18STR等位基因分型流程数据收集数据收集确定峰确定峰标记峰标记峰与与Ladder对比对比Genotype读取等读取等位基因位基因颜色分离颜色分离分析者浏览数据分析者浏览数据确定结果确定结果GeneScanGenotyperSTR等位基因分型流程数据收集确定峰标记峰与Ladder对比19光谱分离前的现象荧光检测器对多色荧光信号进行检测时，荧光染料间的发射波长差值越小，不同的荧光染料间存在明显的光谱交叉重叠,光谱交叉重叠形成的干扰信号就越强。当干扰信号达到和超过数据分析设定的阈值时，就被误判为一个片段峰，一个荧光标记在不同荧光在相同的位置上显示大小不同的伪峰、无法识别片段。光谱分离前

11、的现象荧光检测器对多色荧光信20光谱分离光谱分离概念：概念：每种荧光染料标记的特殊颜色的一系列片段峰单独区分出来，同时消除不同颜色间的干扰峰，这个处理过程就叫光谱分离。步骤：1设定一个判断信号峰的信号强度阈值。根据一个峰信号最强的颜色，将该峰归到相对应的颜色组中，就可以把峰信号归到不同的颜色组中。2消除一种颜色峰中的存在的其他的干扰信号。重点：建立matrix文件根据Matrix数值表，消除干扰信号，只保留单一、最强的颜色峰。该峰的峰高和面积在处理前后无变化。光谱分离概念：每种荧光染料标记的特殊颜色的一系列片段峰单独区21matrix文件Matrix数值表数值表：用来定量表现荧光片段峰中各种颜

12、色信号强度相对的比例关系的数值表，在STR荧光标记检测分析技术中称为Matrix数值表。matrix文件：文件：由此数值表构成的相应计算机文件称为matrix文件。matrix文件是在电泳matrix标准品时，计算各种颜色峰之间的平均干扰强度值而获得。注意事项：当更换缓冲液、毛细管、激光管、荧光检测器等物时，需重新建立matrix文件。matrix文件Matrix数值表：用来定量表现荧光片段峰中22第五章-STR自动分型解析ppt课件23矩阵处理矩阵处理(Matix)矩阵处理(Matix)24Matrix及Ladder对结果分析的影响1对于使用仪器，国外实验室通常做法是一般每隔36个月做一次M

13、atrix，以有利于得到准确的分析结果。2每次电泳时都应同时电泳Ladder，如果采用以前做的Ladder分析Profilerplus9个STR位点时，大部分检材大片段STR位点D18S51、D7S820在3l0上均能自动标上等位基因名称时，仍可采用该Ladder分析电泳结果。如果多数等位基因表现为OLAllele(offladderallele)则应考虑重新电泳Ladder。Matrix及Ladder对结果分析的影响1对于使用仪器25毛细管的更换ABI公司早先推荐检验STR的毛细管电泳次数为100次，以后又提高到200300次。大量使用后认为，一般情况下，每根毛细管电泳可超过千次。更换毛细管

14、的条件为：首先电泳时引物峰出现后吸收值基线高于2048RFU以上；其次TH019.3、10等位基因无法区分；其三在其它条件均不改变的条件下，分析已知血斑结果时，杂峰多。其中第二点最为重要。毛细管的更换ABI公司早先推荐检验S26DNA片段分子量计算分子量内标：含有一系列已知碱基数的标记DNA片段。内标片段的电泳相对时间数据，描述了各个已知碱基数的内标DNA片段电泳迁移速度与片段大小的关系。利用已知碱基数的内标DNA片段与电泳获得的相对时间值，可建立一个直线回归方程。已知一个未知片段电泳获得的相对时间值，就可通过方程式得知未知片段大小。注意事项：未知片段不能超出内标长度的范围。DNA片段分子量计

15、算分子量内标：含有一系列已知碱基数的标记D27内标红色峰的片段大小内标红色峰的片段大小28等位基因分型Ladder:包含扩增体系中每个基因座的全部的已知等位基因。Ladder中每个基因座等位基因的荧光标记与未知样本扩增产物的标记种类相同。Ladder经颜色分离和计算分子量大小后，程序对Ladder中的等位基因命名。未知样本数据中的各种颜色及每种颜色各片段与Ladder中的相应的颜色和等位基因范围相比较，通过比较样本中的片段与Ladder中等位基因相同，如相同，就用该等位基因命名，不同，就识别为off-ladder。等位基因分型Ladder:包含扩增体系中每个基因座的全部的已29D3S1358(

16、8alleles)VWA(14alleles)D16S539(9alleles)D2S1338(14alleles)Blue panelGreen panelYellow panelOrange panelD21S11(24alleles)D8S1179(12alleles)D18S51(23alleles)TH01(10alleles)FGA low(19alleles)FGA high(9alleles)250 bp*139bp200 bp160 bp300 bp340 bp350 bp150 bpLIZ-labeledGS500DNAsizingstandard100 bpRed pan

17、elD19S433(15alleles)D5S818(10alleles)TPOX(8alleles)D13S317(8alleles)D7S820(10alleles)CSF1PO(10alleles)AMEL(2alleles)Figure5.6,J.M.Butler(2005)Forensic DNA Typing,2ndEdition2005ElsevierAcademicPressD3S1358VWAD16S539D2S1338Bluep30通过与等位基因标准比对来进行通过与等位基因标准比对来进行STR分型分型 （STR genotyping is performed by comp

18、arison of sample data to allelic ladders）Microvariant allele通过与等位基因标准比对来进行STR分型Microvar31DNA分型图谱DNA分型图谱32分型标准品等位基因命名错误在ladder中，每个基因座的各个等位基因的量不是完全相等，电泳检测时，其相应的信号强度也不同。若某个基因座的某个等位基因片段相对较少，电泳时上样量又偏少，峰的阈值设置过高，ladder中该等位基因未能被正确识别。在对ladder进行等位基因命名时，相应基因座的等位基因全部或部分命名不能被命名或错误命名。分型标准品等位基因命名错误在ladder33D3S1358

19、(8alleles)VWA(14alleles)D16S539(9alleles)D2S1338(14alleles)Blue panelGreen panelYellow panelOrange panelD21S11(24alleles)D8S1179(12alleles)D18S51(23alleles)TH01(10alleles)FGA low(19alleles)FGA high(9alleles)250 bp*139bp200 bp160 bp300 bp340 bp350 bp150 bpLIZ-labeledGS500DNAsizingstandard100 bpRed pa

20、nelD19S433(15alleles)D5S818(10alleles)TPOX(8alleles)D13S317(8alleles)D7S820(10alleles)CSF1PO(10alleles)AMEL(2alleles)Figure5.6,J.M.Butler(2005)Forensic DNA Typing,2ndEdition2005ElsevierAcademicPressD3S1358VWAD16S539D2S1338Bluep34如果这个未识别的等位基因是ladder中某个基因座的第一个等位基因，计算机系统就会把第2个等位基因错误的命名为等位基因1.，该基因座的样本的等

21、位基因也必然减少1个等位基因命名。如果在某一个基因座的第1个等位基因前出现伪峰，这峰是由于PCR扩增滑脱造成的。当上样量过大或峰阈值设置过低的，这伪峰就误认为是该基因座的等位基因1.该基因座的样本的等位基因也必然增加1个等位基因命名。如果这个未识别的等位基因是ladder中某个基因座的第一个等35处理方法为防止这种错误出现，要求STR分析中，每次检测电泳时需要同时分析一个已知对照DNA样本。处理方法为防止这种错误出现，要求STR分析中，每次检测电泳时36内标识别错误现象：内标信号太低，标准品峰信号太低，电泳系统不能有效分辩相邻的两个等位基因的情况下，自动分型系统将不能完成对分型标准品的数字化命

22、名。原因：信号太低，分析范围设置错误和电泳数据不全。内标识别错误现象：内标信号太低，标准品峰信号太低，电泳系统不37处理方法1信号低通过调整阈值可正确识别内标，或重新电泳。2分析范围设置错误通过调整分析范围纠正。3电泳数据不全通过修改分子量内标参数可以正确识别内标。处理方法1信号低通过调整阈值可正确识别内标，或38基线跳跃或摇动现象：基线跳跃或摇动可使基线太高，超过阈值峰，程序将把这些超过阈值的基线识别为无数个峰片段，在图谱上标为off-ladder.原因：分析调用的matrix文件错误或者不适合。尤其是信号过强时。处理方法：避免盲目增加电泳上样量，信号过强，应降少上样量或稀释产物。理想的峰值

23、在1000-3000之间。基线跳跃或摇动现象：基线跳跃或摇动可使基线太高，超过阈值峰，39Stutter带概念：在STR分型图谱中，常常在一个目标STR等位基因峰前少一个重复单位的位置出现一个信号较弱的峰，这种额外的峰就是由于PCR过程中的复制滑脱形成的扩增片段，称为阴影峰。Stutter带形成原因是PCR扩增时有时Taq酶滑脱，导致某些PCR产物比正常PCR产物少一个重复序列。Stutter带峰高一般是正常PCR峰高的15%以下，对于非混合样品，Stutter带很易区分，Stutter带总是位于阴极侧，量少(峰低）且少于主峰一个重复单位。在同一位点，Stutter带的出现机率随着等位基因片段

24、的增大或者扩增体系中DNA量的增加而增加。对于混台样品，尤其是随机混合的现场检材，则判断混合等位基因时应慎重。Stutter带概念：在STR分型图谱中，常常在一个目标ST40第五章-STR自动分型解析ppt课件41处理方法：减少样本DNA模板，或者减少电泳的上样量以降低峰信号强度。提高峰阈值或采取锋信号过滤，就可以消除Stutter带。处理方法：减少样本DNA模板，或者减少电泳的上样量以降低峰信42非模板依赖加A现象：在DNA聚合酶能够在扩增产物的3末端非特异性地连接一个腺苷酸。ProfilerPlus及Cofiler试剂盒28个循环后需延长6045min，其目的是使3末端未加APCR产物加A

25、，如果省略6045min，则在扩增时同一等位基因部分会未加A，表现为双峰。双尖峰：同一个等位基因形成加APCR产物片段与未加APCR产物片段，在电泳分析时被识别为2个峰，2个峰基部融合为一个峰，这种尖部分分叉形成两个峰尖，称为双尖峰。非模板依赖加A现象：在DNA聚合酶能够在扩增产物的3末端非43形成原因：模板过多、含有PCR抑制剂、酶过少或酶活性减低。一般小片段的等位基因内多见。如果大片段出现双尖峰，可能是该基因座出现等位基因变异。比较同一样品是否省略6045min的检验结果，分型无差异(见图1)，但FGA23.2、23.3、24及D21S1130.2、30.3、31及TH019.3、10等位

26、基因分型时应慎重。模板DNA太多时也会使PCR扩增产物部分等位基因未加A，电泳结果也可表现为双峰44用ProfilerPlus试剂盒PCR扩增是否省略6045min对检验结果的影响用ProfilerPlus试剂盒PCR扩增是否省略6045其他伪峰现象：当设备电流输出出现短暂跳动时。在数据峰图上会出现信号基线的突然跳动。表现为图峰突然抬高的断层式图峰，可能识别为片段峰。特点：左侧近似直线抬高，达到峰尖后稍慢回落。呈现楔形。每种颜色在相同的位置都会类似的峰。其他伪峰现象：当设备电流输出出现短暂跳动时。在数据峰图上会出46第五章-STR自动分型解析ppt课件47当电极缓冲液中有带负电固体颗粒，信号峰

27、上出现棒状图形。（直线上升，直线下降）处理方法：过滤电极缓冲液。当电极缓冲液中有带负电固体颗粒，信号峰上出现棒状图形。（直线48性别识别图谱异常Amelogenin基因座常用于鉴定样本性别。偶尔会存在Amelogenin基因座区域的基因变异或缺失。出现错误结果。男性样本只检出X或Y。处理：加做Y-STR.性别识别图谱异常Amelogenin基因座常用于鉴定样本性别49峰的均衡性一般情况下,纯合子的峰高和面积比杂合子的高，但相差不会超过30。两个杂合子的峰高和面积相当。实际上，在两个杂合子等位基因中，小片段的峰高大于大片段的。原因是扩增不平衡。有些检材9个STR位点等位基因均与对照样品一致，但检

28、材中每个位点内等位基因之间峰高相差远远大于30。这主要是因为DNA模板量太少，等位基因不平衡扩增所致，这时应重新或加大模板量后再进行PCR扩增，或者用有机法重新提取DNA后再扩增，一般可以解决上述问题。若出现两等位基因的峰高相差超过70%，就要考虑混合样本。峰的均衡性一般情况下,纯合子的峰高和面积比杂合子的高，但相50第五章-STR自动分型解析ppt课件51杂合性丢失或3等位基因杂合性丢失杂合性丢失：在杂合子中，只出现了一个等位基因，但它的峰高和面积与其他的杂合子的等位基因相似。判断杂合性丢失：同一基因座重新设计引物，或与亲缘鉴定出现矛盾。3等位基因等位基因：一个基因座出现3个等位基因。分析：

29、如果有多个基因座出现3个或4个等位基因，说明样本污染。如果一个基因座出现3等位基因。说明基因突变。杂合性丢失或3等位基因杂合性丢失：在杂合子中，只出现了一个等52某三甲医院委托鉴定是否存在交叉污染现象，采用16个基因座系统检测。结果显示：该细胞在结果显示：该细胞在4个基因座出现三等位基因现象，说明有其他个基因座出现三等位基因现象，说明有其他人类细胞交叉污染。人类细胞交叉污染。某三甲医院委托鉴定是否存在交叉污染现象，采用16个基因座系统533等位基因（二）分析3l0电泳结果，有时一个样品ProfilerPlus系统的78个STR位点均为单纯检材，仅12个STR位点表现为混合检材，即一个位点出现3

30、个等位基因。遇到这种情况，可将可将该检材该检材4色荧光图谱置于一个窗口内，使色荧光图谱置于一个窗口内，使4色荧光图谱纵轴色荧光图谱纵轴线同一位置上均含有一吸收峰。线同一位置上均含有一吸收峰。非特异性杂峰(spike)形成的原因一般认为是，排掉毛细管电泳后的废胶时，前次前次电泳样品荧光标记物未从毛细管上剥离电泳样品荧光标记物未从毛细管上剥离 发现非特异性杂峰发现非特异性杂峰，样品必须重新电泳，以达到消除杂峰的目的。一个位点出现3个等位基因的另一个常见原因为基因突变3等位基因（二）分析3l0电泳结果，有时一个样品Profi54部分或全部STR位点扩增失败在吸收值较高时，小片段STR位点等位基因结果

31、明确，而大片段STR位点比如D18S51、D7S820则未检见PCR产物。显然主要原因不是因为模板量太少模板量太少，如果排除了DNA降解因素，则可能为模板内存在模板内存在PCR抑制剂，抑制剂，此时在扩增体系中调整模板DNA用量或者用有机法重新抽提DNA，减少或者去除PCR抑制剂，以使9个STR位点均能检出。有条件的实验室最好在PCR扩增前进行DNA纯化。由于Chelexl00法在提取DNA时不容易把杂质去除干净，所以如果未检见谱带或者谱带不全，应用有机法重新提取。部分或全部STR位点扩增失败在吸收值较高时，小片段STR位点55抑制剂的作用浓度SDS离子去污剂，蛋白变性，0.01%即可完全抑制P

32、CR反应，0.005%可显著降低产量苯酚苯酚蛋白变性，0.5%即可完全抑制PCR反应，0.2%可显著降低产量乙醇乙醇大于1%的浓度可抑制PCR反应，但在某些系统中可增加产量。异丙醇异丙醇抑制作用比乙醇稍强乙酸钠乙酸钠大于5mM时抑制PCR反应氯化钠氯化钠大于25mM时抑制PCR反应EDTA0.5mM可使PCR产物减少，1mM完全没有PCR产物。血色素血色素 1mg/ml肝素肝素0.15I.U./ml尿素尿素20mM（相当于10lPCR体系中含0.6l尿液）氯高铁血红素氯高铁血红素0.1ng/l丹宁酸丹宁酸0.1ng/l抑制剂的作用浓度SDS离子去污剂，蛋白变性，0.01%即可56PCR 增强剂

33、增强剂PCR增强剂可以增加所需PCR产物的产量或减少非特异性产物。有许多的PCR增强剂，原理各不相同，这些试剂不可能对所有的PCR反应都起作用。根据其作用和原理，可以大致分为三类：1.用于扩增高GC含量或形成复杂二级结构的模板（共溶剂）（甜菜碱（betaine），二甲基亚枫（DMSO）和甲酰胺甲酰胺（formamide），甘油）2.用于保护DNA聚合酶的活性和稳定性（0.1mg/ml的BSA、0.1-10的明胶明胶）3.用于优化引物和模板的结合（10-20mM的硫酸铵硫酸铵、氯化四甲胺）4.其它增强剂（PEG、亚精胺、单链DNA结合蛋白）PCR增强剂PCR增强剂可以增加所需PCR产物的产量或减

34、57off-ladder峰在STR分型图谱中，常会遇到部分样本的少量片段峰未被程序化数字命名，在分型图谱中被识别为off-ladder峰。产生原因：大多数由于扩增产物在电泳过程中发生漂移，远离了原来的位置，系统无法识别。处理方法：通过分析已判定的等位基因分别于各自等位基因漂移的情况，对off-ladder峰漂移进行校正。人工命名该等位基因。off-ladder峰在STR分型图谱中，常会遇到部分样本的58室温不同，电泳的速度不同。在一定范围内温度越低，电泳结果越好。电泳缓冲液和毛细管使用的次数越多，毛细管质量问题，将使电泳分辩率下降。电泳缓冲液和毛细管质量问题及两者超期使用，是形成分辩率下降和严

35、重飘移的重要原因。室温不同，电泳的速度不同。在一定范围内温度越低，电泳59第五章-STR自动分型解析ppt课件60产生原因2:少数是由于出现稀有等位基因（标准物未包含的等位基因）。两种情况：稀有等位基因出现在一个基因座的大小等位基因范围中，多由于在基因突变中数个碱基插入或缺失引起。稀有等位基因出现在一个基因座的大小等位基因范围外，多由于基因座滑脱引起。产生原因2:少数是由于出现稀有等位基因（标准物未包含的等位基61第五章-STR自动分型解析ppt课件62第五节影响因素分为三个因素1降解检材2PCR抑制物3样本污染4微量检材第五节影响因素分为三个因素63模板对于大多数PCR反应，确定样本中DNA

36、的量是必要的，因为PCR反应的最佳模板浓度范围是较窄的。ABI公司的试剂盒要求最佳的模板量是1-2.5ng，会得到最优的结果。采用5ul反应体系的理由是，其一ABI公司推荐的9600型PCR扩增仪最低扩增量为5ul；其二310每次上样量为1ulPCR产物，每次实验均必须保证重复一次，故总扩增体积量至少应为2ul，将粘壁、扩增时挥发等消耗因素考虑进去，5ul体系为最小体系，这样便极大节约了成本。模板对于大多数PCR反应，确定样本中DNA的量是必要的，因64生物检材可提取DNA的量样本类型DNA含量血液20000-40000ng/ml血痕250-500ng/cm2性交后的阴道擦拭物10-3000n

37、g/拔出的毛发（带毛根）1-750ng/毛根脱落的毛发（带毛根）1-10ng/毛根唾液1000-10000ng/ml口腔拭子100-1500ng/棉签尿液1-20ng/ml精液150000-300000ng/ml骨3-10ng/mg组织50-500ng/mg生物检材可提取DNA的量样本类型DNA含量血液20000-465DNA模板量影响DNA模板量太少可表现为：等位基因的丢失，因PCR反应没能扩增到DNA片段。模板量太多则表现为：分析中分裂峰行或者峰超出分析范围。要想得到满意DNA检验图谱，加人模板DNA应严格定量。DNA模板量影响DNA模板量太少可表现为：等位基因的丢失，因66DNA的定量方

38、法：早期实用紫外分光光度法、溴乙锭荧光检测方法，无种属特异性，不灵敏，淘汰。现在常用斑点杂交定量法、PicoGreen微量滴定板定量、AluQuant人类DNA定量系统、实时定量PCR。斑点杂交定量法：基因组DNA点在尼龙膜上，加入人类特异性探针，比较和一系列标准品的强度比较。微量滴定板定量：在195ul的含有染料的溶液中加入5ul的样品，每份样品放在96孔的单独的一个孔中，用用荧光检测。AluQuant人类DNA定量系统：目的基因和探针杂交引发酶反应，最终导致荧光素氧化发光。光强度由照度片读取，读数与样本中DNA含量成比例关系。DNA的定量方法：67试剂盒或方法原理检测限度DNA用量人类特异

39、性PCR抑制物检测Quantiblotkit 杂交150pg5ul是无PicoGreenAssay插人荧光染料250pg10ul无无BodeQuantkit末端PCR100pg1-10ul是是AluQuant实时PCR1pg1-10ul是是AluAssaykit高温和荧光素发光产物100pg1-10ul是无Quantfilerkit实时PCR20pg2ul是是各种定量方法的总结试剂盒或方法原理检测限度DNA用量人类特异性PCR抑制物检测68第五章-STR自动分型解析ppt课件69降解检材降解检材为法医DNA分型提取生物检材时，防止DNA模板的降解和去除PCR反应的抑制物都重要。抑制物或降解DN

40、A的存在会导致PCR反应的彻底失败或对大片段PCR产物检材的灵敏度减低。STR分型成功需要样本DNA分子中包括引物结合区和其下游的完整DNA分子。对于降解样本，STR基因座等位基因片段越短越容易分型。在复合扩增体系中，随着等位基因片段由小到大复合扩增产物在电泳峰图上的信号逐渐衰弱，当降解严重时部分小片段基因座检出，甚至全部基因座分型失败。降解检材为法医DNA分型提取生物检材时，防70降解检材的机制DNA通过很多机制降解，包括酶解和化学反应，在细胞死后，其中的DNA分子面临细胞核酸酶，以及周围环境中的细菌、真菌和昆虫的猛烈攻击。水解作用和氧自由基的破坏作用可限制DNA的成功修复和扩增。水解作用的

41、主要目的是糖骨架的寡糖基。这里的裂解会导致核酸的丢失，然后单链终止。，如果有一条足够长的DNA链在引物退火时或者在正反引物之间断裂，PCR扩增的效率就会下降或目的片段扩增失败。所以高温和潮湿这些能加速水解的因素。是破坏DNA分子完整的最大的因素。紫外线照射可使DNA分子发生胸腺嘧啶交联，抑制PCR反应中酶的活性。降解检材的机制DNA通过很多机制降解，包括酶解和化学71解决方法解决方法基因座重新设计引物，减少扩增产物的片段长度。基因座选用与数据库兼容的基因座（选用试剂盒涉及的STR）。解决方法基因座重新设计引物，减少扩增产物72PCR抑制物在扩增现场提取的DNA时面临的一个难题是样本中含有抑制剂

42、干扰PCR扩增过程。抑制剂抑制扩增的方式：1干扰DNA提取中的细胞溶解过程。2通过降解和结合核酸发挥抑制作用。3抑制聚合酶活性。在法医检案中，通常有两种PCR抑制物：血色素和棉布的靛青染料。在进行线粒体DNA扩增时毛发的黑色素也是PCR的抑制剂。这些抑制剂在PCR扩增时可结合于Taq酶的活性位点上，抑制酶的扩增功能。PCR抑制物在扩增现场提取的DNA时面临的一个难题是样本中含73抑制剂来源抑制剂来源抑制剂抑制剂来源来源胆酸盐粪便复杂多糖粪便，植物材料胶原质组织血红素（heme）血液腐植酸土壤，植物材料，自然界水黑色素头发，皮肤尿素尿血色素hemoglobin血液靛青染料粗斜纹棉布聚苯乙烯，聚丙

43、烯紫外线照射塑料管蛋白酶牛奶钙离子牛奶，骨头抑制剂来源抑制剂来源胆酸盐粪便复杂多糖粪便，植物材料胶原质组74解决方法1稀释基因组DNA模板，同时PCR抑制也会被稀释。2在PCR反应体系中增加Taq酶的量，部分Taq酶中和抑制物，避免抑制剂参加反应。3更换聚合酶。在PCR反应体系中添加牛血清白蛋白或甜菜碱等物质可以防止或减少抑制物的作用。用氢氧化钠处理模板，可以消除抑制物的作用。在扩增前进行纯化，提取出的DNA从抑制剂中分离开。解决方法1稀释基因组DNA模板，同时PCR抑制也会被稀释。75样本污染PCR具有高灵敏性，可扩增小量，但是如果不采取正确的防护措施，它的灵敏性同时就会带来麻烦，尤其是微量

44、检材。我们一定要严格遵守实验认可的操作程序，才能避免高浓度的污染。例如来自实验室人员的的污染。一旦发生污染，可能导致“排除”或“不确定”的结论。样本污染PCR具有高灵敏性，可扩增小量，但是如果不采取76污染的来源剂处理方法污染是在试验的过程中偶尔发生的转移。过程存在三个可能的污染源：环境中基因组DNA造成的样本污染；提取时造成的污染；前一次扩增产物的污染。第一种污染来源取决于现场样本的采集和证据采集人员的防护措施，只能在一定程度应载体对照的方法进行监控。后两者可以通过遵守规范的实验操作程序和划分工作区域来控制。污染的来源剂处理方法污染是在试验的过程中偶尔发生的转移77设置阴性对照，检测反应试剂

45、和试管是否污染，就可检测是否存在实验室的污染。阴性对照是指整个法医案件样本检测过程中同时检测一个空白样本。如阴性对照中有产物，找出污染源。实验研究证明：实验研究证明：遵守规范的实验操作程序，不会出现在实验室样本污染。只有严重违反规范的实验操作程序，才可能检测到污染。简单的操作不慎不会引起污染的发生。防止在实验室污染，在正规的实验室都存有工作人员的基因型。设置阴性对照，检测反应试剂和试管是否污染，就可检测是否78样本污染影响污染最可能导致得出错误的排除结论出错误的排除结论。因为污染的量会抑制案件中微量的检材（出现随机效应），或者掩盖所形成的混合斑中罪犯的基因型。它可能在重新检测旧案时有一定意义。

46、因以前无规范的实验操作程序，且分型模板需要的量多。样本污染影响污染最可能导致得出错误的排除结论。因为污染79第五章-STR自动分型解析ppt课件80根据生产厂家的推荐,标准STR分型方法使用最低的模板DNA量应在250pg左右,通常获得最佳效果的DNA量应为1ng,PCR循环数应在2830以下。当模板DNA的量极少时,PCR扩增就会发生随机效应随机效应，即当DNA模板量低于100pg时,在PCR中的前几个循环会对姊妹染色体上DNA分子的一个等位基因随机选择进行扩增,随机扩增的分子在以后会被优先扩增,对杂合子样品的检验结果会造成明显不对称扩增,甚至造成等位基因丢失。所以,在PCR中要规定使用最小

47、的DNA模板量,以避免随机扩增的发生。微量检材微量检材根据生产厂家的推荐,标准STR分型方法使用最低的81但在实际案件中有许多微量、超微量生物学检材进行DNA分析。实际检案中微量生物检材很多，如骨骼、牙齿、汗液以及耳机、牙刷、眼镜鼻架等载体上提取的DNA等。多年来,法医DNA分析工作者一直努力探索对微量DNA进行分析的方法。微量生物检测的能力使可利用的检测增加，如在犯罪现场的昆虫就可以帮助寻找嫌疑人。但在实际案件中有许多微量、超微量生物学检材进行DNA分82最早定义LCN为DNA模板量少于100pg,但由于DNA定量方法之间存在的差异造成DNA模板量的不同。但必须建立一种有效、准确的对LCN的

48、DNA定量检测的方法，以精确地了解模板DNA量，更有效地利用增加PCR扩增循环数，提高检测灵敏度。低拷贝模板(lowcopynumber,LCN)：一般指基因组含量小于100pg的样本。低拷贝模板STR分型:应用少于试剂盒规定的最小DNA模板量进行STR扩增检验,并对结果加以分析解释。第五章-STR自动分型解析ppt课件83LCN-STR分型的方法主要是通过小体积扩增和增加PCR的循环数来提高检验的灵敏度。主要是把PCR循环数从28提高到34,获得了较满意的结果,解决了多起陈年旧案。增加循环数已被用于各种不同类型检材的DNA分析。比如用2840个循环分析现场遗留指纹DNA，用3543个循环分析

49、毛干DNA。用3843个循环对埋葬70年的沙皇骨头进行Romanov家庭成员的身源鉴定,用60和50个循环分析古代骨骼DNA等。模板量仅为2550pg(相当于410个细胞核DNA),也能得到完全的DNA图谱;低于该模板量水平就会产生等位基因丢失,再增加循环数也不会显著增加灵敏度。这主要是Taq酶的活性随着循环数的增加将明显下降造成。LCN-STR分型的方法主要是通过小体积扩增和增加PCR84第五章-STR自动分型解析ppt课件85第五章-STR自动分型解析ppt课件86除不增加循环，提高扩增灵敏度的方法：收集样本时要严格的防止污染；采用产量高的提取方法，提取DNA面积减少，DNA进行纯化，提高

50、模板DNA浓度；缩小扩增PCR体系，得到更加浓缩的PCR产物；过滤PCR产物，去除注入毛细管时与STR产物竞争的离子；电泳时上样量增加，选用纯度高的甲酰胺，进样时间增加，目的是提高扩增片段的信号峰；数据处理时提高峰阈值。除不增加循环，提高扩增灵敏度的方法：87LCN-STR分型的成功率较低,有时获得的检验结果可能与案件无关,在实际检验中利用LCN-STR分型必须十分的谨慎,充分注意以下一些方面:(1)一般不作出排除的结论;(2)要进行重复性检验,比较结果;(3)必须设置相应的空白对照;(4)分析结果时没有最小的阈值,必须注意随机效应的存在;(5)等位基因的增多是LCN-STR中不可避免的问题;

51、(6)必须充分考虑到DNA一级转移及二级转移的情况;(7)杂合子峰的不对称增加（30%）;(8)影子带的强度相对增强（15%）;(9)无法对混合样品进行分析;(10)在LCN分型条件下,试剂的质量控制难于进行;(11)必须建立相关的统计学方法对结果进行解释;(12)检验结果的数据不能录入数据库。LCN-STR分型的成功率较低,有时获得的检验88LCN报告遵循原则在出报告结果前，进行多次PCR扩增，证实每个等位基因都能扩增；如阴性对照与同一批次的样本结果一样，不能上报结果；如有一个等位基因与嫌疑人分型不符，应进一步检测。LCN报告遵循原则在出报告结果前，进行多次PCR扩增，证实89检材的载体对L

52、CN-STR分型的影响各种不同载体基质上微量血痕的STR检验成功率有很大的不同。表面光滑的载体基质，如玻璃、石块载体上的微量血痕，STR检验成功率较高；相反，表面粗糙的载体基质，如砖块，木块等，STR检验成功率则较低。其主要原因是此类载体上血痕用湿棉线往往不能全部擦拭下来，从而大大减少能提取到的DNA的模板量，尤其是对微量血痕DNA的提取。检材的载体对LCN-STR分型的影响各种90“证据链证据链”重要性举例重要性举例 经典案例回顾 “世纪审判”“证据链”重要性举例9119941994年年6 6月月1212日深夜日深夜1111点点5050分，在洛杉矶市西区，一条日分，在洛杉矶市西区，一条日本狼

53、狗狂吠不已，爪子上沾满血迹，使一对散步的美国夫本狼狗狂吠不已，爪子上沾满血迹，使一对散步的美国夫妇心生疑惑，尾随这条狼狗。妇心生疑惑，尾随这条狼狗。来到一座公寓楼前，结果发现了两具鲜血淋漓的尸体。他来到一座公寓楼前，结果发现了两具鲜血淋漓的尸体。他们立刻狂敲隔壁住家大门，想借电话报警。但是，却把宅们立刻狂敲隔壁住家大门，想借电话报警。但是，却把宅主吓得半死，以为来了劫匪，便立刻打主吓得半死，以为来了劫匪，便立刻打911911电话报警。电话报警。洛杉矶市警署两位警官接警后，火速赶到现场，发现是一洛杉矶市警署两位警官接警后，火速赶到现场，发现是一宗恶性人命案后，他们便呼叫重案处的刑警前来增援。宗恶

54、性人命案后，他们便呼叫重案处的刑警前来增援。1994年6月12日深夜11点50分，在洛杉矶市西区，一条日92被害白人女性，被害白人女性，3535岁，名叫妮可，是黑人岁，名叫妮可，是黑人橄榄球明星辛普森的前妻；被害的白人男橄榄球明星辛普森的前妻；被害的白人男子子2525岁，名叫戈德曼（岁，名叫戈德曼（Ronald GoldmanRonald Goldman），），是附近一家意大利餐馆的侍者。两人皆因是附近一家意大利餐馆的侍者。两人皆因利刃割喉大出血致死。利刃割喉大出血致死。辛普森与妮可的两个孩子尚在二楼熟睡，辛普森与妮可的两个孩子尚在二楼熟睡，没有目睹这可怕的场面。没有目睹这可怕的场面。被害白人

55、女性，35岁，名叫妮可，是黑人橄榄球明星辛普森的前妻93辛普森涉嫌杀人案辛普森涉嫌杀人案1.1.嫌疑人辛普森嫌疑人辛普森 全名为欧全名为欧 杰杰 辛普森辛普森(O.(O.J.J.Sympson)Sympson)，出身黑人，出身黑人贫困家庭，获全美大学橄贫困家庭，获全美大学橄榄球联赛榄球联赛最高荣誉奖最高荣誉奖海斯海斯曼奖，进入国家橄榄球联曼奖，进入国家橄榄球联盟，成为职业橄榄球的优盟，成为职业橄榄球的优秀选手。退役后，成为美秀选手。退役后，成为美国广播公司（国广播公司（ABCABC）和国家）和国家广播公司（广播公司（NBCNBC）聘为）聘为体育体育节目主持人节目主持人。令爱好体育。令爱好体育的

56、美国人倾倒，更成为家的美国人倾倒，更成为家喻户晓的人物。喻户晓的人物。辛普森涉嫌杀人案1.嫌疑人辛普森94美国辛普森涉嫌杀人案死者死者妮可妮可布朗（布朗（Nicole Nicole BrownBrown）是辛普森的第二任妻子是辛普森的第二任妻子 ，在同居在同居8 8年之后，辛普森与年之后，辛普森与妮可结婚，婚后育有妮可结婚，婚后育有 一子一子一女。但是，从一女。但是，从19891989年开年开始，妮可多次打报警电话始，妮可多次打报警电话称辛普森对她殴打。称辛普森对她殴打。戈德曼戈德曼 是妮可现任男朋友是妮可现任男朋友 ，白，白人，在附近一家意大利餐人，在附近一家意大利餐馆的当侍者。馆的当侍者。

57、美国辛普森涉嫌杀人案死者95妮可妮可布朗倒在门前的阶梯下布朗倒在门前的阶梯下妮可家大门半敞开妮可家大门半敞开门前走廊可见多量门前走廊可见多量血迹和血鞋印血迹和血鞋印妮可布朗倒在门前的阶梯下妮可家大门半敞开门前走廊可见多量96在辛普森住宅围墙后门的路上停着在辛普森住宅围墙后门的路上停着一辆白色福特野马型越野车。在驾驶一辆白色福特野马型越野车。在驾驶员位置的车门把手上发现了微小血员位置的车门把手上发现了微小血迹迹 。工作人员正用棉签提取驾驶工作人员正用棉签提取驾驶员车门把手上的微量血迹员车门把手上的微量血迹在辛普森住宅围墙后门的路上停着工作人员正用棉签提取驾驶员车门97现场发现的一只占有现场发现的

58、一只占有血迹的黑色皮手套血迹的黑色皮手套可是辛普森在法庭上称现场的那只手套比可是辛普森在法庭上称现场的那只手套比他的尺寸小，不能作为他作案的工具他的尺寸小，不能作为他作案的工具现场发现的一只占有可是辛普森在法庭上称现场的那只手套比他的尺98另一只沾有血迹的右手黑色皮手另一只沾有血迹的右手黑色皮手套（地点？）。这只手套与在凶套（地点？）。这只手套与在凶杀案现场发现的另一只手套看似杀案现场发现的另一只手套看似很相配。很相配。在辛普森住所发现一双在辛普森住所发现一双沾有血迹的袜子沾有血迹的袜子 另一只沾有血迹的右手黑色皮手套（地点？）。这只手套与在凶杀案99“辛普森杀妻案辛普森杀妻案”中的重要物证：

59、中的重要物证：全球仅有全球仅有299299双的布诺马利鞋双的布诺马利鞋现场的血鞋印“辛普森杀妻案”中的重要物证：全球仅有299双的布诺马利鞋100案件中的法医物证检验案件中的法医物证检验 在妮可住宅外发现的一只左手血手套和在辛普森住宅在妮可住宅外发现的一只左手血手套和在辛普森住宅内发现的另一只右手内发现的另一只右手血手套为一副血手套为一副。根据。根据 DNA DNA检验，检验，上面有两位受害人的血、毛发和衣物纤维以及辛普森上面有两位受害人的血、毛发和衣物纤维以及辛普森的福特车内毯子的纤维；的福特车内毯子的纤维；现场发现一处不清晰的现场发现一处不清晰的带血鞋底印带血鞋底印。经调查，鞋底印。经调查

60、，鞋底印是由一双是由一双1212号的意大利产布鲁诺号的意大利产布鲁诺 马格利牌男鞋所留。马格利牌男鞋所留。与辛普森使用的鞋吻合；与辛普森使用的鞋吻合；在在妮可住宅后门发现的血迹妮可住宅后门发现的血迹经检验为辛普森的血。经检验为辛普森的血。在辛普森的汽车车门和方向盘上发现的血迹经检验为在辛普森的汽车车门和方向盘上发现的血迹经检验为混合血，同时有辛普森和妮可的血，还有第三个人的混合血，同时有辛普森和妮可的血，还有第三个人的血；血；在辛普森卧室的床下找到在辛普森卧室的床下找到带血袜子带血袜子，检测认为袜子上，检测认为袜子上的血有被害人的血；的血有被害人的血；案件中的法医物证检验在妮可住宅外发现的一只

61、左手血手套和101检方呈庭的重要证据之一是血迹化验和DNA检验结果。刑事专家一致同意，血迹化验和DNA检验的结果不会撒谎，但是，如果血迹受到污染、不当处理、草率采集或有人故意栽赃，那么它的可信度则大打折扣。在辛普森案中，这些毛病全都存在。检方呈庭的重要证据之一是血迹化验和DNA检验结果。刑事专家一102辛普森的辩方证词警方涉嫌非法搜查 1.1.警察在搜查辛普森家时没有持警察在搜查辛普森家时没有持搜查证搜查证，并且没有其他警，并且没有其他警察在场，这不仅说明他的搜查是非法的，所提取的物证不察在场，这不仅说明他的搜查是非法的，所提取的物证不可信，而且不能排除借机栽赃陷害的可能。可信，而且不能排除借

62、机栽赃陷害的可能。2.2.据调查，有些警员甚至还将据调查，有些警员甚至还将证据放在自己的车上带回家证据放在自己的车上带回家，忘了送到化验室去。忘了送到化验室去。3.3.警方在辛普森家中找到的袜子，在警方在辛普森家中找到的袜子，在现场勘查笔录现场勘查笔录中没有中没有提到在袜子上发现血迹，现场勘查录像上也未有血袜。警提到在袜子上发现血迹，现场勘查录像上也未有血袜。警方有多张辛普森卧室的照片，部分照片并没有拍到地毯上方有多张辛普森卧室的照片，部分照片并没有拍到地毯上的带血的袜子，有的照片上却有。这些的带血的袜子，有的照片上却有。这些照片的顺序也有出照片的顺序也有出入入，血袜是后来放上去的还是原来就有

63、，一直都没有合理，血袜是后来放上去的还是原来就有，一直都没有合理的解释。的解释。辛普森的辩方证词警方涉嫌非法搜查103检验结果表明，所有疑点都聚集在辛普森一人身上。检验结果表明，所有疑点都聚集在辛普森一人身上。辛普森涉嫌杀人似乎已是无法低赖的事实。辛普森涉嫌杀人似乎已是无法低赖的事实。但是，辩方阵营认为这些但是，辩方阵营认为这些“血证血证”疑点极多，破绽百疑点极多，破绽百出。出。最终最终,最后在证据最后在证据“充分充分”的情况下辛普森逃脱法律的情况下辛普森逃脱法律制裁，在用刀杀前妻及其男友两项一级谋杀罪的指控制裁，在用刀杀前妻及其男友两项一级谋杀罪的指控中以无罪获释，仅被民事判定为对两人的死亡

64、负有责中以无罪获释，仅被民事判定为对两人的死亡负有责任。本案也成为美国历史上任。本案也成为美国历史上无罪推定无罪推定的最大漏洞案件。的最大漏洞案件。法医DNA实验室在进行DNA证据收集和检测时提高了警惕，以便再被怀疑。检验结果表明，所有疑点都聚集在辛普森一人身上。辛普森涉嫌杀人104总总 结结法医法医DNA分型可以应用于各种情况的鉴定。分型可以应用于各种情况的鉴定。DNA分型技术已经成为越来越多的法医实分型技术已经成为越来越多的法医实验室日常采用的支柱技术。验室日常采用的支柱技术。DNA检测技术已发展成为一项灵敏而有效检测技术已发展成为一项灵敏而有效的协助工具，给罪犯以严惩，还无辜者以的协助工具，给罪犯以严惩，还无辜者以清白。清白。总结法医DNA分型可以应用于各种情况的鉴定。105