园艺植物组织培养第6章ppt课件

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1、第六章 花药和花粉培养 第六章 花药和花粉培养 1 花药和花粉培养的研究概况花药和花粉培养的研究概况 花药和花粉培养的主要内容花药和花粉培养的主要内容花药培养方法花药培养方法 花粉植株的诱导花粉植株的诱导 单倍体植株的二倍体化单倍体植株的二倍体化 花药和花粉培养的研究概况 花药和花2第一节第一节 花药和花粉培养的研究概况花药和花粉培养的研究概况 花药或花粉培养的目的花药或花粉培养的目的 是为了获得单倍体植株是为了获得单倍体植株所谓单倍体，指的是具有配子体染色体组成的孢子体。所谓单倍体，指的是具有配子体染色体组成的孢子体。植物体内的单倍体细胞：植物体内的单倍体细胞：小孢子小孢子大孢子大孢子其它自

2、然突变产生的单倍体细胞其它自然突变产生的单倍体细胞第一节 花药和花粉培养的研究概况 花药或花粉培养的目的3花药或花粉培养的意义花药或花粉培养的意义一是获得纯系育种材料和进行单倍体育种一是获得纯系育种材料和进行单倍体育种,缩短育缩短育种年限和提高育种效率种年限和提高育种效率;二是用所获得的纯合二倍体材料进行遗传变异规律研二是用所获得的纯合二倍体材料进行遗传变异规律研究究,使园艺植物育种有坚实的遗传理论依据使园艺植物育种有坚实的遗传理论依据,减少育减少育种的盲目性种的盲目性;花药或花粉培养的意义一是获得纯系育种材料和进行单倍体育种,4三是利用在远缘杂交三是利用在远缘杂交F1 F1 代的花药培养中出

3、现的混倍代的花药培养中出现的混倍体和丰富的染色体变异材料进行园艺植物细胞遗传学体和丰富的染色体变异材料进行园艺植物细胞遗传学等基础性研究等基础性研究;四是有利于新抗源的不断发现和野生资源的充分利用。四是有利于新抗源的不断发现和野生资源的充分利用。另外另外,在分子生物技术迅速发展和日趋成熟的今天在分子生物技术迅速发展和日趋成熟的今天,花药培养的应用领域不断扩大花药培养的应用领域不断扩大,其研究意义日益突出。其研究意义日益突出。三是利用在远缘杂交F1 代的花药培养中出现的混倍体和丰富的染5 园艺植物的花药培养始于园艺植物的花药培养始于20 20 世纪世纪70 70 年代年代,随着技术的成熟随着技术

4、的成熟,研究的深入研究的深入,目前在许多园艺目前在许多园艺植物上已获得成功植物上已获得成功,如柑橘、苹果、李、扁桃、荔如柑橘、苹果、李、扁桃、荔枝枝 、枇杷、黄瓜、芦笋、番茄、西瓜、辣椒和花、枇杷、黄瓜、芦笋、番茄、西瓜、辣椒和花椰菜等。椰菜等。园艺植物的花药培养始于20 世纪70 年代,随着技6第二节第二节 花药培养的方法花药培养的方法（1）取材）取材 取花粉发育到一定时期的花药进行培养。取花粉发育到一定时期的花药进行培养。一般而言，单核后期花药对培养反应较好。一般而言，单核后期花药对培养反应较好。因因此此，花花药药在在接接种种以以前前，必必须须确确定定花花粉粉的的发发育时期。育时期。2.1

5、2.1培养方法培养方法第二节 花药培养的方法（1）取材 取花粉发育到一定时7.四分孢子 单核中期，细胞质液泡化，核逐渐移向细胞边缘；单核晚期，中央液泡形成，核移到和萌发孔相对的一边 花粉第一次有丝分裂中期；.单核早期，核居中，细胞质没有液泡化 小孢子发育过程图解小孢子发育过程图解.四分孢子 单核中期，细胞质液泡化，核逐渐移向细胞边缘；单8双核初期，两核等大；三核期，生殖核分裂成2个精子，营养核开始退化；双核晚期，生殖细胞移到花粉中央 双核中期，两核形态上分化为营养核（上）和生殖核（下）三核成熟花粉 双核初期，两核等大；三核期，生殖核分裂成2个精子，营养核开9 一般用一般用醋酸洋红压片法醋酸洋红

6、压片法进行镜检，以确定花粉进行镜检，以确定花粉的发育时期，并找出的发育时期，并找出花粉发育时期与花蕾或幼穗的花粉发育时期与花蕾或幼穗的大小、颜色等外部特征之间的对应关系大小、颜色等外部特征之间的对应关系。根据这些。根据这些体征确定花粉的发育时期。体征确定花粉的发育时期。一般用醋酸洋红压片法进行镜检，以确定花粉的发育时期，10 但但这这种种相相关关性性不不是是一一成成不不变变的的，而而会会因因品品种种和和气气候候的的不不同同而而异异，因因此此，在在实实验验中中还还必必须须由由每每个个花花蕾蕾取取出出一一个个花花药药，通通过过镜镜检检确确定定花花粉粉发发育育的的准确时期准确时期 但这种相关性不是一

7、成不变的，而会因品种和气候的不同11（2）预处理）预处理 目的是提高花粉的诱导率。目的是提高花粉的诱导率。预处理的方式：预处理的方式：低温预处理、低温预处理、离心处理、离心处理、高温预处理、高温预处理、和预培养等和预培养等目的：目的：就是从形态上改变其极性分布就是从形态上改变其极性分布，从生理生化上改从生理生化上改变其细胞生理状态变其细胞生理状态，以改变其分裂方式和发育途径。以改变其分裂方式和发育途径。（2）预处理 目的是提高花粉的诱导率。12 对于不同的种类、品种和生理状态对于不同的种类、品种和生理状态的的花药培养所要求的花药培养所要求的预处理及其作用也不同。预处理及其作用也不同。在甜在甜(

8、辣辣)椒上椒上,低温处理一般采用低温处理一般采用4 47,7,处理处理12 12 h h10 d10 d。李玉花等以高压静电场处理番茄花药后接种于培养基李玉花等以高压静电场处理番茄花药后接种于培养基上上,发现高压静电场处理花药可显著提高愈伤组织诱导率发现高压静电场处理花药可显著提高愈伤组织诱导率,而且静电场处理后可使组培茎丛苗超氧化物歧化酶而且静电场处理后可使组培茎丛苗超氧化物歧化酶(SOD)(SOD)活性升高活性升高,丙二醛丙二醛(MDA)(MDA)含量降低。含量降低。对于不同的种类、品种和生理状态的花药培养所要求的预处理13（3）消毒）消毒 花花药药适适宜宜培培养养时时，花花蕾蕾尚尚未未开

9、开放放，花花药药在在花花被被或或颖颖片片的的严严密密包包被被之之中中，本本身身处处于于无无菌菌状状态态，因因此此，通通常常只只要要以以70酒酒精精喷喷洒洒或或擦擦拭拭花花器器或或包包被被着着麦麦穗穗的叶鞘表面，即可达到灭菌要求。的叶鞘表面，即可达到灭菌要求。（3）消毒 花药适宜培养时，花蕾尚未开放，14（4）接种）接种 由于花药对离体培养的反应存在由于花药对离体培养的反应存在“密度效应密度效应”，因此，因此每个容器中接种的花药数量不宜太少，以形成一个合理的每个容器中接种的花药数量不宜太少，以形成一个合理的群体密度。群体密度。在在无无菌菌条条件件下下把把雄雄蕊蕊上上的的花花药药轻轻轻轻地地从从花

10、花丝丝上上摘摘下下，水水平平地地放放在在培培养养基基上上进进行行培培养养，在在整整个个操操作作过过程程中中不不应应使使花花药药受受到到损损伤伤，若若受受损损伤伤，则则应应淘淘汰汰，因因为为损损伤伤常常常常会会刺刺激激花花药药壁形成二倍体愈伤组织。壁形成二倍体愈伤组织。（4）接种 由于花药对离体培养的反应存在“密度15 如如果果所所碰碰到到的的是是花花器器很很小小的的植植物物，可可借借助助解解剖剖镜镜夹夹取取花花药药，或或是是只只把把花花被被去去掉掉，把把花花蕾蕾的的其其余余部部分连同其中原封未动的雄蕊一起接种在培养基上。分连同其中原封未动的雄蕊一起接种在培养基上。如果所碰到的是花器很小的植物，

11、可借助解剖镜夹16 在有些情况下，甚至是接种整个花序以得到花粉单倍体。在有些情况下，甚至是接种整个花序以得到花粉单倍体。然而这种简单化的方法只适用于这样一些基因型，即其中然而这种简单化的方法只适用于这样一些基因型，即其中雄雄核发育在只含无机盐、维生素和糖的简单培养基上即可进行核发育在只含无机盐、维生素和糖的简单培养基上即可进行，而在这种培养基上而在这种培养基上孢子体组织增殖的机会很少孢子体组织增殖的机会很少。不过，当必。不过，当必须使用生长素才能诱导花粉粒雄核发育的时候，应当尽可能须使用生长素才能诱导花粉粒雄核发育的时候，应当尽可能把孢子体组织去掉。把孢子体组织去掉。在有些情况下，甚至是接种整

12、个花序以得到花粉单17（5）培养方式）培养方式花药的培养方式主要有花药的培养方式主要有3种：种：一是在琼脂固化培养基表面培养，一是在琼脂固化培养基表面培养，二是在加人二是在加人3030FicollFicoll的液体培养基表面飘浮培养，的液体培养基表面飘浮培养，三是利用固体三是利用固体液体双层培养基培养，以便既能保液体双层培养基培养，以便既能保持较高的接种密度，培养基又不易失水干涸。持较高的接种密度，培养基又不易失水干涸。（5）培养方式花药的培养方式主要有3种：一是在琼脂固化培养基18（6）培养条件）培养条件 温度温度 花花药药对对培培养养温温度度的的要要求求因因物物种种而而不不同同，对对于于大

13、大多多数数小小麦麦品品种种来来说说，在在培培养养的的最最初初6 d以以30-32 的的较较高高温温度度，然然后后再再转转入入28-30 下下培培养养，花花药药出出愈愈率率会会有有明明显显提提高高。水水稻稻花花药药培培养养的的适适宜宜温温度度从从一一开开始始就就是是27。（6）培养条件 温度 花药对培19光照光照 对光照的要求在物种间差异更为明显例如连对光照的要求在物种间差异更为明显例如连续光照可显著增加烟草花粉胚的产量，却强烈抑制续光照可显著增加烟草花粉胚的产量，却强烈抑制曼陀罗的花粉胚胎发生。禾谷类植物在花粉愈伤组曼陀罗的花粉胚胎发生。禾谷类植物在花粉愈伤组织诱导期间则以暗培养或散射光培养效

14、果好，强光织诱导期间则以暗培养或散射光培养效果好，强光会抑制小麦花粉愈伤组织的形成。会抑制小麦花粉愈伤组织的形成。光照 对光照的要求在物种间差异更为明显例如连20 愈伤组织的分化原则上都应在光照下进行，但对愈伤组织的分化原则上都应在光照下进行，但对光照强度和照光时间的要求则因物种而异。例如水稻光照强度和照光时间的要求则因物种而异。例如水稻花粉愈伤组织在转人分化培养基之初仍不宜照光培养，花粉愈伤组织在转人分化培养基之初仍不宜照光培养，须待须待35 d后再给以每天后再给以每天14 h 1 0002 000 lx的光照，的光照，以免引起愈伤组织的老化坏死。对小麦花粉植株则不以免引起愈伤组织的老化坏死

15、。对小麦花粉植株则不宜给以长日照。宜给以长日照。愈伤组织的分化原则上都应在光照下进行，但对光照强度和21（7）花粉植株的诱导）花粉植株的诱导 烟烟草草花花药药接接种种在在无无激激素素培培养养基基上上1周周以以后后，即即有有部部分分花花粉粉粒粒开开始始膨膨大大，2周周以以后后细细胞胞开开始始不不断断分分裂裂，相相继继形形成成球球形形胚胚、心心形形胚胚和和鱼鱼雷雷形形胚胚等等，3周周后后在在花花药药开开裂裂处处即即可可见见到到许许多多淡淡黄黄色色的的胚胚状状体体，见见光光后后变变绿绿，并并逐逐渐渐长长成成小小苗苗。每每个个花花药药中中长长出出的的小小苗苗数数可可从从1株株到几十株不等，最多者可达到

16、几十株不等，最多者可达180株以上。株以上。（7）花粉植株的诱导 烟草花药接种22 禾禾本本科科植植物物的的花花药药在在培培养养中中通通常常不不能能形形成成胚胚状状体体，在在这这类类植物中，花粉植株的诱导往往要分两步进行。植物中，花粉植株的诱导往往要分两步进行。第第一一步步，将将花花药药接接种种在在含含有有2,4-D(12 mg/L)的的诱诱导导培培养养基上，诱导花粉粒形成单倍体愈伤组织。基上，诱导花粉粒形成单倍体愈伤组织。第第二二步步，当当花花粉粉愈愈伤伤组组织织形形成成后后1015 d，其其直直径径已已长长到到1.52.0 mm时时，及及时时把把它它们们转转到到分分化化培培养养基基上上诱诱

17、导导植植株株分分化化。分分化化培培养养基基中中不不含含2,4-D，含含有有NAA和和KT各各0.5 mg/L。在分化培养基上，愈伤组织表面陆续分化出芽和根。在分化培养基上，愈伤组织表面陆续分化出芽和根。禾本科植物的花药在培养中通常不能形成胚状体，在这类23注意：注意：在烟草中，花粉植株是经由胚状体产生的，因此在烟草中，花粉植株是经由胚状体产生的，因此几乎都是单倍体。几乎都是单倍体。在稻麦等植物中，由于花粉植株是经由愈伤组织在稻麦等植物中，由于花粉植株是经由愈伤组织产生的，染色体数常有变化，其中既有单倍体，也有二产生的，染色体数常有变化，其中既有单倍体，也有二倍体、三倍体以及各种非整倍体等。倍体

18、、三倍体以及各种非整倍体等。注意：24（8）壮苗和移栽）壮苗和移栽 以以小小麦麦为为例例，王王培培等等采采用用的的方方法法是是：将将已已长长出出23片片叶叶的的花花粉粉植植株株转转人人含含有有多多效效唑唑3 mg/L，NAA和和KT各各0.5 mg/L，LH 500 mg/L和和蔗蔗糖糖8的的MS养养基基上上，于于2225下下进进行行壮壮苗苗培养然后在培养然后在38低温弱光条件下越夏，深秋时炼苗移栽。低温弱光条件下越夏，深秋时炼苗移栽。（8）壮苗和移栽 以小麦为例，王培等25园艺植物组织培养第6章ppt课件262.2 影响雄核发育的因子影响雄核发育的因子 所谓雄核发育（所谓雄核发育（所谓雄核发

19、育（所谓雄核发育（androgenesisandrogenesis），指的是小孢子沿孢子），指的是小孢子沿孢子），指的是小孢子沿孢子），指的是小孢子沿孢子体途径发育成花粉植株的过程。体途径发育成花粉植株的过程。体途径发育成花粉植株的过程。体途径发育成花粉植株的过程。影响雄核发育的因子很多，除上节提到的以外，还包影响雄核发育的因子很多，除上节提到的以外，还包影响雄核发育的因子很多，除上节提到的以外，还包影响雄核发育的因子很多，除上节提到的以外，还包括以下括以下括以下括以下5 5 5 5个方面个方面个方面个方面 ：2.2 影响雄核发育的因子 所谓雄核发育（andro27孢子体：孢子体：孢子体：孢子

20、体：在世代交替的生活史中，产生孢子和具二倍在世代交替的生活史中，产生孢子和具二倍在世代交替的生活史中，产生孢子和具二倍在世代交替的生活史中，产生孢子和具二倍体染色体的植物体。体染色体的植物体。体染色体的植物体。体染色体的植物体。配子体：配子体：配子体：配子体：在世代交替的生活史中，产生配子和具单倍在世代交替的生活史中，产生配子和具单倍在世代交替的生活史中，产生配子和具单倍在世代交替的生活史中，产生配子和具单倍体染色体的植物体。体染色体的植物体。体染色体的植物体。体染色体的植物体。世代交替：世代交替：世代交替：世代交替：指的是在生物的指的是在生物的指的是在生物的指的是在生物的生活史生活史生活史生

21、活史中，产生中，产生中，产生中，产生孢子孢子孢子孢子的孢的孢的孢的孢子体世代（无性世代）与产生子体世代（无性世代）与产生子体世代（无性世代）与产生子体世代（无性世代）与产生配子配子配子配子的配子体世代（有的配子体世代（有的配子体世代（有的配子体世代（有性世代）有规律地交替出现的现象。性世代）有规律地交替出现的现象。性世代）有规律地交替出现的现象。性世代）有规律地交替出现的现象。孢子体：在世代交替的生活史中，产生孢子和具二倍体染色体的植物281.基因型基因型 基因型是影响花药离体培养反应的关键因子之一。基因型是影响花药离体培养反应的关键因子之一。不不同同基基因因型型植植株株的的花花药药对对培培养

22、养的的反反应应不不同同,表表现现在在花花药药培培养养力力如如愈愈伤伤组组织织诱诱导导率率、分分化化率率、胚胚状状体体诱诱导导率率及及植植株株诱诱导导率不同等率不同等,有些材料对某些培养基没有反应。有些材料对某些培养基没有反应。1.基因型 基因型是影响花药离体培养反应的关键因子29 陈陈肖肖师师对对1717个个甜甜椒椒品品种种进进行行花花药药培培养养,胚胚状状体体诱诱导导率率为为0.3%0.3%6.8%6.8%不等。不等。Dumas Dumas 等等发发现现较较大大果果型型的的灯灯笼笼椒椒花花药药培培养养效效果果较较好好,产生胚状体花药所占比率为产生胚状体花药所占比率为5%5%40%40%。张张

23、恩恩让让等等对对花花溪溪辣辣椒椒和和青青岩岩辣辣椒椒进进行行花花药药培培养养,出出胚胚率分别为率分别为1.83%1.83%和和1.29%1.29%。陈肖师对17个甜椒品种进行花药培养,胚状体诱导率为30 侯喜林在对草莓花药进行离体培养时观察到侯喜林在对草莓花药进行离体培养时观察到，女峰的愈女峰的愈伤组织多为绿色或黄绿色伤组织多为绿色或黄绿色，宝交早生的愈伤组织则多呈黄白宝交早生的愈伤组织则多呈黄白色或红色色或红色(少量为黄绿色少量为黄绿色)，而丰香的大部分愈伤组织是褐色而丰香的大部分愈伤组织是褐色的。的。在不同品种的百合中在不同品种的百合中,诱导率从诱导率从0 019.26%19.26%不等。

24、不等。研究表明研究表明,花药培养力的大小花药培养力的大小,是受多基因控制的数量是受多基因控制的数量性状性状,因而随着基因型的差异而有很大变化。因而随着基因型的差异而有很大变化。侯喜林在对草莓花药进行离体培养时观察到，女峰的愈伤组312.生理状态生理状态 在在开开花花末末季季采采集集的的花花药药不不但但形形成成孢孢子子体体的的频频率率很很低低，而而且发生反应的时间也较迟。且发生反应的时间也较迟。供供体体植植株株的的年年龄龄及及其其所所处处的的生生长长条条件件也也能能影影响响花花药药对对离离体培养的反应，一般来说，幼年植株的花药反应能力较好。体培养的反应，一般来说，幼年植株的花药反应能力较好。2.

25、生理状态 在开花末季采集的花32 在在水水稻稻和和小小麦麦等等禾禾谷谷类类植植物物中中，大大田田植植株株比比温温室室植株、主茎穗比分孽穗花粉愈伤组织的诱导率高。植株、主茎穗比分孽穗花粉愈伤组织的诱导率高。在在烟烟草草中中，当当光光照照强强度度相相同同时时，由由生生长长在在短短日日照照(8 h)条条件件下下的的植植株株上上采采集集的的花花药药，要要比比在在长长日日照照（16 h）条条件下采集的对培养的反应高出件下采集的对培养的反应高出60。在水稻和小麦等禾谷类植物中，大田植株比温室33 由由供供体体植植株株生生长长条条件件的的差差异异造造成成的的花花药药对对培培养养反反应应的的不不同同，可可能能

26、是是内内生生激激素素水水平平变变动动的的结结果果。王王敬敬驹驹等等（1974）看看到到，在在水水稻稻中中若若在在10下下用用乙乙烯烯利利预预处处理理植植株株84 h，可增加花药对培养的反应能力。，可增加花药对培养的反应能力。由供体植株生长条件的差异造成的花药对培养反343.花粉发育时期花粉发育时期 在在诱诱导导花花粉粉进进行行雄雄核核发发育育的的过过程程中中，花花粉粉在在接接种种时时所所处处的的发育时期可能比培养基成分更为重要。发育时期可能比培养基成分更为重要。虽虽然然说说，一一般般情情况况下下单单核核后后期期花花药药对对培培养养反反应应较较好好，但但不同物种最适的发育时期不同。不同物种最适的

27、发育时期不同。3.花粉发育时期 在诱导花粉进行雄核35如如在在杂杂配配芍芍药药（Paeonia hybrida)中中，最最适适时时期期是是在在花花粉粉第第一一次次有有丝丝分分裂裂的的当当时时或或稍稍前前稍稍后后。而而在在颠颠茄茄和和林林生生烟烟草草中中以以双双细细胞胞早早期期最最好好，很很多多禾禾本本科科植植物物的的花花药药是是在在单单核核早早期期（大大麦）或单核中、晚期（玉米、小麦）反应最好。麦）或单核中、晚期（玉米、小麦）反应最好。如在杂配芍药（Paeonia hybrida)中，最适时期36 检检查查花花粉粉发发育育时时期期常常用用的的方方法法是是醋醋酸酸洋洋红红染染色色，但但对对于于D

28、NA含含量量较较低低的的材材料料，最最好好用用孚孚尔尔根根试试剂剂染染色色。此此外外，对对水水稻稻和和玉玉米米等等植植物物而而言言，I-KI染染色色效效果果比比醋醋酸酸洋洋红更好。红更好。检查花粉发育时期常用的方法是醋酸洋红染色，但对于DN374.药壁因子药壁因子 在花粉胚发育过程中花药壁起着重要的作用。在花粉胚发育过程中花药壁起着重要的作用。如如把把一一个个品品种种烟烟草草的的花花粉粉移移植植到到另另一一个个品品种种的的花花药药中中，前前者者也也能够顺利地发育成胚。能够顺利地发育成胚。花药对同一物种及不同物种离体花粉雄核发育有看护作用。花药对同一物种及不同物种离体花粉雄核发育有看护作用。花药

29、浸提液也能刺激花粉胚的形成。花药浸提液也能刺激花粉胚的形成。4.药壁因子 在花粉胚发育过程中花药壁起着重要的作用。38 组织学研究也证实药壁在花粉胚发育中的作用。组织学研究也证实药壁在花粉胚发育中的作用。在在烟烟草草中中，只只有有原原来来贴贴靠靠着着花花药药壁壁的的花花粉粉粒粒，才才能顺利发育成花粉胚。能顺利发育成花粉胚。在在天天仙仙子子中中，也也只只有有处处在在药药室室外外围围紧紧靠靠绒绒毡毡层层的的花花粉能够成胚。粉能够成胚。这这些些事事实实表表明明，由由绒绒毡毡层层起起源源的的某某些些重重要要物物质质的的梯梯度度变变化化，对于诱导花粉粒发育成胚起着关键的作用。对于诱导花粉粒发育成胚起着关

30、键的作用。组织学研究也证实药壁在花粉胚发育中的作395.培养基培养基（1）基本培养基）基本培养基 基基本本培培养养基基对对花花药药培培养养的的成成败败影影响响很很大大。花花药药培培养养研研究究证证实实MS，Miller和和Nitsch培培养养基基等等对对花花药药培培养养的的普普遍遍适适用用性性。另另外外，又又设设计计了了几几种种新新的的配配方方，如如适适用用于于稻稻、麦麦和和玉玉米米的的N6培培养养基基，适适用用于于小小麦麦的的C17培培养养基基，W14培培养养基基和和马马铃铃薯薯-2培培养养基基，从从而而提提高高了了这这些些禾禾谷谷类类植植物物花花粉粉形形成成愈愈伤伤组组织织的的频频率率和愈

31、伤组织分化绿苗的频率。和愈伤组织分化绿苗的频率。5.培养基（1）基本培养基 基本培养40 和和MS培培养养基基相相比比，N6，C17和和W14的的一一个个共共同同特特点点是是，大大幅幅度度降降低低了了其其中中氨氨离离子子浓浓度度，并并调调整整了了其其中中氨氨态态氮氮和和硝硝态态氮氮的的比比率率：在在N6培培养养基基中中，NH4离离子子浓浓度度由由MS中中的的20.62 mmol/L降降至至7.01 mmol/L，氨氨态态氮氮与与硝硝态态氮的比值由氮的比值由MS中的中的0.52降为降为0.25。和MS培养基相比，N6，C17和W14的一个共同特点41（2）碳源）碳源 在花药培养中，蔗糖一直是最常

32、用的碳源。在花药培养中，蔗糖一直是最常用的碳源。其其他他糖糖类类，如如麦麦芽芽糖糖、果果糖糖和和葡葡萄萄糖糖等等做做碳碳源源，也也可可取取得了良好的培养效果。得了良好的培养效果。例例如如，据据朱朱至至清清等等在在过过滤滤灭灭菌菌的的条条件件下下，以以0.21 mol/L葡葡萄萄糖糖取取代代液液体体培培养养基基中中等等摩摩尔尔浓浓度度蔗蔗糖糖，小小麦麦花花粉粉胚胚的的诱诱导导频频率率可可增增加加210倍倍。当当把把这这些些花花粉粉胚胚转转到到含含有有0.21 mol/L葡葡萄萄糖糖但但无无2,4-D的的双双层层分分化化培培养养基基（过过滤滤灭灭菌菌）上上以以后后，其其中中40%90长长成成了了试

33、试管管苗苗；而而在在含含有有蔗蔗糖糖的的培培养养基基中中，只只有有0一一30能能够成苗。够成苗。（2）碳源 在花药培养中，蔗糖一直是42 另外，蔗糖在培养基中还起着调节渗透压的重要作用。另外，蔗糖在培养基中还起着调节渗透压的重要作用。所所用用的的蔗蔗糖糖浓浓度度最最好好能能在在不不妨妨碍碍花花粉粉细细胞胞增增殖殖的的同同时时，又能抑制体细胞的增殖。又能抑制体细胞的增殖。花花药药培培养养中中采采用用的的蔗蔗糖糖浓浓度度通通常常是是：甜甜椒椒和和柑柑橘橘等等3%，水水稻稻36，小小麦麦610，大大麦麦和和黑黑麦麦草草12，玉玉米米1215。另外，蔗糖在培养基中还起着调节渗透压的重要43（3）植物激

34、素）植物激素 雄雄核核发发育育的的途途径径是是直直接接形形成成花花粉粉胚胚。在在这这些些植植物物中中，一一般般不不需需要要激激素素，在在基基本本培培养养基基上上就就可可以以产产生生完完整整的的单单倍倍体体植植株株，在在有有些些情情况况下下，甚甚至至连连维维生生素素也也无无必必要要。例例如如烟烟草草、曼陀罗等。曼陀罗等。培培养养基基中中的的激激素素成成分分对对于于诱诱导导花花粉粉细细胞胞的的增增殖殖和和发发育育起起着重要作用。着重要作用。由由于于植植物物种种类类不不同同，花花药药在在离离体体培培养养中中对对激激素素的的要要求有求有2种不同的情况：种不同的情况：（3）植物激素 雄核发育的途径是直接

35、形成花粉胚。在这44花花粉粉粒粒首首先先形形成成愈愈伤伤组组织织，然然后后，或或是是在在同同一一培培养养基基中中，或或是是在在略略加加改改变变的的培培养养基基中中，由由愈愈伤伤组组织织分分化化出出孢孢子子体体。在在这这些些植植物物中中，如如非非茄茄科科物物种种中中，为为了了诱诱导导花花药药进进行行雄雄核核发发育育，必必须须单单独独地地或或以以不不同同配配比比在在培培养养基基中中加加入入生生长长调调节节物物质质、复复杂杂的的营营养养混混合合物物（如如酵酵母母浸浸出出液液，水水解解酪酪蛋蛋白白）和椰子汁等。和椰子汁等。花粉粒首先形成愈伤组织，然后，或是在同一培养基中，或是在略45 如如在在大大多多

36、数数禾禾本本科科植植物物如如水水稻稻、小小麦麦、大大麦麦和和黑黑麦麦的的花花药药培培养养中中，外外源源生生长长素素，特特别别是是2,4-D(13 mg/L)，是是启启动动小小孢孢子子细细胞胞分分裂裂形形成成愈愈伤伤组组织织的的必必要要条条件件。但但燕燕麦麦和和玉玉米米例例外外，它它们们的的花花药药在在没没有有外外源源激激素素刺刺激激的的情情况况下下，即即能能启启动动细细胞胞分分裂裂。在在水水稻稻和和小小麦麦花花药药培培养养基基中中除除2,4-D之之外外还还常常常常添添加加KT 0.5 mg/L，其其作作用用或或在在于于增增强强愈愈伤伤组组织织的的胚胚胎胎发发生生能力，或在于抑制花丝愈伤组织的形

37、成。能力，或在于抑制花丝愈伤组织的形成。如在大多数禾本科植物如水稻、小麦、大麦和黑46 有有时时，通通过过审审慎慎地地改改变变培培养养基基中中的的生生长长调调节节物物质质，有有可可能能改改变变雄雄核核发发育育的的方方式式。例例如如在在小小麦麦中中，如如果果培培养养基基里里含含有有2,4-D和和水水解解乳乳蛋蛋白白，花花粉粉就就形形成成愈愈伤伤组组织织；如如果在基本培养基中补加椰子汁，花粉粒就直接发育成胚。果在基本培养基中补加椰子汁，花粉粒就直接发育成胚。有时，通过审慎地改变培养基中的生长调节物质47（4）活性炭）活性炭 在在花花药药培培养养中中，有有些些报报告告表表明明活活性性炭炭对对雄雄核核

38、发发育育具具有有促促进进作作用用。例例如如在在马马铃铃薯薯花花药药培培养养基基中中添添加加0.5活活性性炭炭，能能大大幅幅度度提提高高花花粉粉植植株株的的形形成成频频率率。但但是是有有些些作作者者却却指指出出，这这种种效效应应可可能能与与这这类类茄茄科科植植物物的的雄雄核核发发育育不不依依赖赖于于外外源源激激素素有有关关，对对于于必必须须依依赖赖外外源源激激素素才才能能进进行行雄雄核核发发育育的的植植物物来来说说，在在花花粉愈伤组织诱导培养基中添加活性炭可能是有害而无益的。粉愈伤组织诱导培养基中添加活性炭可能是有害而无益的。（4）活性炭 在花药培养中，有些报告表明活性炭482.3 雄核发育单倍

39、体的个体发生过程雄核发育单倍体的个体发生过程 1.花粉单倍体的诱导花粉单倍体的诱导 对对于于大大多多数数物物种种来来说说，适适于于诱诱导导雄雄核核发发育育的的花花粉粉发发育育时时期期，是是在在单单核核小小孢孢子子第第1次次有有丝丝分分裂裂即即将将开开始始、正正在在进进行行、或或刚刚刚刚结束的时候。结束的时候。2.3 雄核发育单倍体的个体发生过程 1.花粉单492.雄核发育早期过程的雄核发育早期过程的4种途径种途径第第1种种途途径径：单单核核小小孢孢子子进进行行一一次次均均等等分分裂裂，形形成成两两个个等等同同的的子子细细胞胞，而而不不是是形形成成相相互互有有别别的的营营养养细细胞胞和和生生殖殖

40、细细胞胞。两两个个等等同同的的子子细细胞胞都都参参与与孢孢子子体体的的发发育育。这这种种途途径径在在毛毛曼曼陀罗中相当普遍。陀罗中相当普遍。根根据据小小孢孢子子最最初初几几次次分分裂裂的的方方式式，可可将将离离体体条条件件下下雄雄核发育的途径分为以下核发育的途径分为以下4种：种：2.雄核发育早期过程的4种途径第1种途径：单核小孢子进行一次50 第第2种种途途径径：单单核核小小孢孢子子先先进进行行一一次次正正常常的的非非均均等等分分裂裂，然然后后通通过过营营养养细细胞胞的的进进一一步步分分裂裂形形成成孢孢子子体体。生生殖殖细细胞胞或或者者完完全全不不再再分分裂裂，或或者者分分裂裂1一一2次次后后

41、即即行行退退化化。这种发育途径在辣椒中都普遍存在。这种发育途径在辣椒中都普遍存在。第2种途径：单核小孢子先进行一次正常的非均等分裂，51 第第3种种途途径径：在在天天仙仙子子中中，花花粉粉胚胚主主要要是是由由生生殖殖细细胞胞单单独独形形成成的的，营营养养细细胞胞或或是是完完全全不不再再分分裂裂，或或只只分分裂裂有有限限几几次次即即停停止止。无无论论在在哪哪种种情情况况下下，营营养养细细胞胞最最终终都都变变成成一一个个类类似似胚柄的结构，附着在由生殖细胞起源的胚的胚根一端。胚柄的结构，附着在由生殖细胞起源的胚的胚根一端。第3种途径：在天仙子中，花粉胚主要是由生殖细52 第第4种种途途径径：如如在

42、在第第2种种途途径径中中一一样样，形形成成一一个个营营养养细细胞胞和和一一个个生生殖殖细细胞胞。但但在在这这种种情情况况下下，2个个细细胞胞都都进进一一步步分分裂裂并并参参与与孢孢子子体体的的形形成成。这这种种雄雄核核发发育育途途径径迄迄今今还还只见于毛曼陀罗中。只见于毛曼陀罗中。第4种途径：如在第2种途径中一样，形成一个营53园艺植物组织培养第6章ppt课件543.雄核发育晚期过程的差异雄核发育晚期过程的差异 雄雄核核分分裂裂变变成成了了一一个个多多细细胞胞的的花花粉粉粒粒。当当把把花花粉粉壁壁撑撑破破以以后后，释释放放出出来来的的是是一一团团轮轮廓廓不不规规则则的的组组织织。这这团团组组织

43、织有有两两个发育方向：个发育方向：方方向向一一 逐逐渐渐变变成成了了一一个个球球形形胚胚，球球形形期期进进一一步步发发育育到到心心形形、鱼鱼雷雷形形、直直到到子子叶叶期期，如如颠颠茄茄、曼曼陀陀罗罗、天天仙仙子子和和烟烟草草等等植植物物。通通过这个途径，一个花粉粒只形成一个植株。过这个途径，一个花粉粒只形成一个植株。3.雄核发育晚期过程的差异 雄核分55方方向向二二 形形成成愈愈伤伤组组织织，以以后后在在同同一一种种或或另另一一种种培培养养基上，由愈伤组织分化产生植株。基上，由愈伤组织分化产生植株。在在有有些些植植物物如如水水稻稻、天天仙仙子子中中，通通过过改改变变培培养养基基的的成成分分可可

44、以以控控制制花花粉粉植植株株的的产产生生方方式式经经由由胚胚状状体体或或经经由由愈愈伤组织。伤组织。方向二 形成愈伤组织，以后在同一种或另一种培养基上，由56禾谷类植物花药培养中白化苗的形成禾谷类植物花药培养中白化苗的形成在禾谷类植物花粉单倍体生产中存在一个严重问题是在禾谷类植物花粉单倍体生产中存在一个严重问题是在禾谷类植物花粉单倍体生产中存在一个严重问题是在禾谷类植物花粉单倍体生产中存在一个严重问题是出现大量的白化苗。在大麦、小麦和水稻的花粉植株出现大量的白化苗。在大麦、小麦和水稻的花粉植株出现大量的白化苗。在大麦、小麦和水稻的花粉植株出现大量的白化苗。在大麦、小麦和水稻的花粉植株中，白化苗

45、通常占总苗数的中，白化苗通常占总苗数的中，白化苗通常占总苗数的中，白化苗通常占总苗数的1/31/3以上，严重的情况下，以上，严重的情况下，以上，严重的情况下，以上，严重的情况下，例如在大麦品种例如在大麦品种例如在大麦品种例如在大麦品种SabarlisSabarlis的花粉植株中白化苗频率高达的花粉植株中白化苗频率高达的花粉植株中白化苗频率高达的花粉植株中白化苗频率高达60-90%60-90%，这大大限制了花药培养技术在育种实践中的，这大大限制了花药培养技术在育种实践中的，这大大限制了花药培养技术在育种实践中的，这大大限制了花药培养技术在育种实践中的应用。应用。应用。应用。禾谷类植物花药培养中白

46、化苗的形成在禾谷类植物花粉单倍体生产中57在水稻中造成白化的原因是由于前质体不能正常发育在水稻中造成白化的原因是由于前质体不能正常发育在水稻中造成白化的原因是由于前质体不能正常发育在水稻中造成白化的原因是由于前质体不能正常发育成叶绿体，既不能形成基粒又完全缺乏核糖体，改变成叶绿体，既不能形成基粒又完全缺乏核糖体，改变成叶绿体，既不能形成基粒又完全缺乏核糖体，改变成叶绿体，既不能形成基粒又完全缺乏核糖体，改变培养基成分也无助于这个问题的解决。培养基成分也无助于这个问题的解决。培养基成分也无助于这个问题的解决。培养基成分也无助于这个问题的解决。现在只知道白化苗的形成受温度的影响。当温度有现在只知道

47、白化苗的形成受温度的影响。当温度有现在只知道白化苗的形成受温度的影响。当温度有现在只知道白化苗的形成受温度的影响。当温度有26 26 增加到增加到增加到增加到35 35 时，白化苗的数目也随之增加。时，白化苗的数目也随之增加。时，白化苗的数目也随之增加。时，白化苗的数目也随之增加。在水稻中造成白化的原因是由于前质体不能正常发育成叶绿体，既不58在水稻上还观察到：花粉处于单核期的花药若在在水稻上还观察到：花粉处于单核期的花药若在在水稻上还观察到：花粉处于单核期的花药若在在水稻上还观察到：花粉处于单核期的花药若在10 10 和和和和13 13 下冷处理下冷处理下冷处理下冷处理3-14 d3-14

48、d，所产生的植株中有，所产生的植株中有，所产生的植株中有，所产生的植株中有90%90%是绿是绿是绿是绿苗，苗，苗，苗，10%10%是白化苗。然而，无论在上述那种温度下，是白化苗。然而，无论在上述那种温度下，是白化苗。然而，无论在上述那种温度下，是白化苗。然而，无论在上述那种温度下，若把冷处理的时间延长到若把冷处理的时间延长到若把冷处理的时间延长到若把冷处理的时间延长到21d21d，所产生的植株几乎全是，所产生的植株几乎全是，所产生的植株几乎全是，所产生的植株几乎全是白化苗。白化苗。白化苗。白化苗。同时还注意到，花粉处在双核期的花药比处在单核期同时还注意到，花粉处在双核期的花药比处在单核期同时还

49、注意到，花粉处在双核期的花药比处在单核期同时还注意到，花粉处在双核期的花药比处在单核期的花药产生的白化苗较多。的花药产生的白化苗较多。的花药产生的白化苗较多。的花药产生的白化苗较多。除葡萄外，在禾本科以外植物的花药培养中未曾发现除葡萄外，在禾本科以外植物的花药培养中未曾发现除葡萄外，在禾本科以外植物的花药培养中未曾发现除葡萄外，在禾本科以外植物的花药培养中未曾发现过白化苗。过白化苗。过白化苗。过白化苗。在水稻上还观察到：花粉处于单核期的花药若在10 和13 593.1 3.1 3.1 3.1 花粉培养与花药培养的比较花粉培养与花药培养的比较花粉培养与花药培养的比较花粉培养与花药培养的比较 花粉

50、培养是指把花粉从花药中分离出来，以单个花粉花粉培养是指把花粉从花药中分离出来，以单个花粉花粉培养是指把花粉从花药中分离出来，以单个花粉花粉培养是指把花粉从花药中分离出来，以单个花粉粒作为外植体进行离体培养的技术。小孢子培养与花药培粒作为外植体进行离体培养的技术。小孢子培养与花药培粒作为外植体进行离体培养的技术。小孢子培养与花药培粒作为外植体进行离体培养的技术。小孢子培养与花药培养的区别见图养的区别见图养的区别见图养的区别见图6-76-7。第三节第三节 花粉培养花粉培养3.1 花粉培养与花药培养的比较 花粉培养是指把花60图图6-7花药培养与花粉培养的比较花药培养与花粉培养的比较Ld-lg为器官

51、发生途径产生单倍体；为器官发生途径产生单倍体；2d-2e2d-2e为胚胎发生产生单倍体；为胚胎发生产生单倍体；3b-3f3b-3f为花粉培养产生单倍体过程为花粉培养产生单倍体过程图6-7花药培养与花粉培养的比较Ld-lg为器官发生途径产生61小孢子培养的优越性：小孢子培养的优越性：花药培养有时会由于花药中的有害物质而不能诱导小孢花药培养有时会由于花药中的有害物质而不能诱导小孢子启动第一次分裂，小孢子培养则不存在这一问题；子启动第一次分裂，小孢子培养则不存在这一问题；花粉已是单倍体细胞，诱发后经愈伤组织或胚状体发育成花粉已是单倍体细胞，诱发后经愈伤组织或胚状体发育成的小植株都是单倍体植株或双单倍

52、体，不含有因药壁、花丝、的小植株都是单倍体植株或双单倍体，不含有因药壁、花丝、药隔等体细胞组织的干扰而形成的体细胞植株；药隔等体细胞组织的干扰而形成的体细胞植株；小孢子培养的优越性：花药培养有时会由于花药中的有害物62 由于起始材料是小孢子获得的材料总是纯合的，不管它由于起始材料是小孢子获得的材料总是纯合的，不管它由于起始材料是小孢子获得的材料总是纯合的，不管它由于起始材料是小孢子获得的材料总是纯合的，不管它是二倍体还是三倍体；是二倍体还是三倍体；是二倍体还是三倍体；是二倍体还是三倍体；小孢子培养可观察到由单个细胞开始雄核发育的全过程，小孢子培养可观察到由单个细胞开始雄核发育的全过程，是一个很

53、好的遗传与发育研究的材料体系；是一个很好的遗传与发育研究的材料体系；由于花粉能均匀地接触化学的和物理的诱变因素，花粉由于花粉能均匀地接触化学的和物理的诱变因素，花粉是研究吸收、转化和诱变的理想材料。是研究吸收、转化和诱变的理想材料。由于起始材料是小孢子获得的材料总是纯合的，不管它是二633.2 3.2 分离花粉的方法分离花粉的方法 1.1.自然释放法自然释放法 有些物种的花蕾消毒后，无菌条件下取出花药，放在有些物种的花蕾消毒后，无菌条件下取出花药，放在液体或固体培养基上培养，花药会自然开裂，将花粉散落液体或固体培养基上培养，花药会自然开裂，将花粉散落在培养基里（上），然后将花药壁去除，进行花粉

54、培养。在培养基里（上），然后将花药壁去除，进行花粉培养。但这种方法由于效率低，一般不采用。但这种方法由于效率低，一般不采用。3.2 分离花粉的方法 1.自然释放法 有些物642.研磨过滤收集法研磨过滤收集法 这种方法只在茄科植物和油菜上成功地应用。将花蕾消这种方法只在茄科植物和油菜上成功地应用。将花蕾消毒后，放人含培养基或分离液的无菌研磨器中研磨，使花粉毒后，放人含培养基或分离液的无菌研磨器中研磨，使花粉（小孢子）释放出来，然后通过一定孔径的网筛过滤，离心（小孢子）释放出来，然后通过一定孔径的网筛过滤，离心收集花粉并用培养基或分离液洗涤，然后用培养基将花粉调收集花粉并用培养基或分离液洗涤，然后

55、用培养基将花粉调整到理想的培养密度，移人培养皿培养。油菜小孢子分离技整到理想的培养密度，移人培养皿培养。油菜小孢子分离技术程序如下：术程序如下：2.研磨过滤收集法 这种方法只在茄科植物和油菜上成65 首先根据花蕾大小判断小孢子的发育时期首先根据花蕾大小判断小孢子的发育时期;取合适的花蕾于取合适的花蕾于6的次氯酸钠中，在摇床上摇动，表的次氯酸钠中，在摇床上摇动，表面消毒面消毒15min，然后用无菌水冲洗，然后用无菌水冲洗3次，每次次，每次5 min。取取5075个花蕾在个花蕾在5 mL培养基（含培养基（含13蔗糖）里研磨成蔗糖）里研磨成匀浆，匀浆，首先根据花蕾大小判断小孢子的发育时期;取合适66

56、 然后通过然后通过44 pm44 pm尼龙网过滤到尼龙网过滤到1 1个个50 mL50 mL离心管中，研磨烧离心管中，研磨烧杯和网上匀浆用培养基冲洗杯和网上匀浆用培养基冲洗3 3次，每次用培养基次，每次用培养基5 mL5 mL。收集的小孢子悬浮液于收集的小孢子悬浮液于19001900一一1950 r/min1950 r/min离心离心3 min3 min，去，去掉上清液，用掉上清液，用5mL5mL新鲜培养基悬起沉淀物，重复新鲜培养基悬起沉淀物，重复2 2次，用培养基次，用培养基调整到理想密度进行培养。调整到理想密度进行培养。然后通过44 pm尼龙网过滤到1个50 mL离心管中，673.剖裂释放

57、法剖裂释放法 这一技术需要借助一定工具剖裂药壁，使花粉或愈这一技术需要借助一定工具剖裂药壁，使花粉或愈伤组织，或胚释放出来，这种方法最早在烟草里尝试，伤组织，或胚释放出来，这种方法最早在烟草里尝试，后来在后来在Pennisetum typhoides上成功应用。显然，这种方上成功应用。显然，这种方法比自然释放法费时。法比自然释放法费时。3.剖裂释放法 这一技术需要借助一定工具剖裂药壁683.2 3.2 花粉（小孢子）培养方法花粉（小孢子）培养方法 这一方法类似于原生质体培养，分离的小孢子经洗涤这一方法类似于原生质体培养，分离的小孢子经洗涤纯化后，调整到需要的浓度，根据培养皿的大小，适量加纯化后

58、，调整到需要的浓度，根据培养皿的大小，适量加入培养液培养（培养液厚入培养液培养（培养液厚1mm1mm左右）。待愈伤组织或胚状体左右）。待愈伤组织或胚状体形成后转移到分化或胚发育的培养基上生长。形成后转移到分化或胚发育的培养基上生长。1.液体浅层培养液体浅层培养 3.2 花粉（小孢子）培养方法 这一方法类似于原生质692.平板培养法平板培养法 分离的花粉在平板培养基上培养，也可诱导产生胚状分离的花粉在平板培养基上培养，也可诱导产生胚状体，并进而分化成小植株。体，并进而分化成小植株。2.平板培养法 分离的花粉在平板培养基上培养，也可703.看护培养法看护培养法 将滤纸片放置在完整花药的上面，将花粉

59、放置在滤纸将滤纸片放置在完整花药的上面，将花粉放置在滤纸片上。花粉在看护培养基上植板率可达到片上。花粉在看护培养基上植板率可达到6060。3.看护培养法 将滤纸片放置在完整花药的上面，将71园艺植物组织培养第6章ppt课件724.微室悬滴培养法微室悬滴培养法 其方法是把其方法是把花药花药取下，表面消毒后用塑料薄膜包好，取下，表面消毒后用塑料薄膜包好，静置一夜，待花药裂开、花粉散出，制成每滴含有静置一夜，待花药裂开、花粉散出，制成每滴含有5080粒的花粉悬浮培养基，然后进行悬滴培养，培养方法粒的花粉悬浮培养基，然后进行悬滴培养，培养方法类似于原生质体培养。类似于原生质体培养。4.微室悬滴培养法

60、其方法是把花药取下，表面消毒后用735.条件培养法条件培养法 在合成培养基中加入失活的花药提取物，然后接入花在合成培养基中加入失活的花药提取物，然后接入花粉进行培养。粉进行培养。首先将花药接种在合适的培养基上培养一定时间（如首先将花药接种在合适的培养基上培养一定时间（如1 1周）周），然后将这些花药取出浸泡在沸水中杀死细胞，用研钵研碎，然后将这些花药取出浸泡在沸水中杀死细胞，用研钵研碎，倒入离心管离心，上清液即为花药提取物。倒入离心管离心，上清液即为花药提取物。提取液过滤灭菌后，加入培养基中，再接种花粉进行培提取液过滤灭菌后，加入培养基中，再接种花粉进行培养。由于失活花药的提取物中含有促进花粉

61、发育的物质，有养。由于失活花药的提取物中含有促进花粉发育的物质，有利于花粉培养成功。利于花粉培养成功。5.条件培养法 在合成培养基中加入失活的花药提取物，74第四节第四节 单倍体植株的二倍化单倍体植株的二倍化 单倍体植株能正常地生长到开花期，但不能形成有活单倍体植株能正常地生长到开花期，但不能形成有活力的配子。为了得到有活力的配子，必须把单体植株的染色力的配子。为了得到有活力的配子，必须把单体植株的染色体组加倍。体组加倍。在花粉植株中染色体可自发加倍，但其频率太低。在花粉植株中染色体可自发加倍，但其频率太低。通过人工措施则可显著提高加倍频率。通过人工措施则可显著提高加倍频率。第四节 单倍体植株

62、的二倍化 单倍体植株75 诱导染色体加倍的传统方法是用秋水仙素处理。诱导染色体加倍的传统方法是用秋水仙素处理。方法可用秋水仙素溶液浸泡，用含有秋水仙素的羊方法可用秋水仙素溶液浸泡，用含有秋水仙素的羊毛脂涂芽，在悬浮培养基中加入毛脂涂芽，在悬浮培养基中加入1 g/L1 g/L秋水仙素秋水仙素 等。等。处理浓度和时间因物种不同而不同。处理浓度和时间因物种不同而不同。诱导染色体加倍的传统方法是用秋水仙素处理。76 马铃薯花药培养影响因素的研究马铃薯花药培养影响因素的研究 越恋，越恋，何凤发何凤发1 1材料和方法材料和方法材料和方法材料和方法 1 11 1试验材料试验材料试验材料试验材料 选用凉薯选用

63、凉薯选用凉薯选用凉薯9797、鄂马铃薯、鄂马铃薯、鄂马铃薯、鄂马铃薯5 5号、康号、康号、康号、康932-2932-2、$21$21、7692-7692-7676等马铃薯普通栽培品种等马铃薯普通栽培品种等马铃薯普通栽培品种等马铃薯普通栽培品种(系系系系)，由西南大学薯类作，由西南大学薯类作，由西南大学薯类作，由西南大学薯类作物研究所提供，分春插和秋插两季田间种植物研究所提供，分春插和秋插两季田间种植物研究所提供，分春插和秋插两季田间种植物研究所提供，分春插和秋插两季田间种植 马铃薯花药培养影响因素的研究771 12 2试验方法试验方法试验方法试验方法 1 12 21 1花药采集和接种花药采集和

64、接种花药采集和接种花药采集和接种 在马铃薯正常现蕾开花季节采摘花蕾光学显微在马铃薯正常现蕾开花季节采摘花蕾光学显微在马铃薯正常现蕾开花季节采摘花蕾光学显微在马铃薯正常现蕾开花季节采摘花蕾光学显微镜下观察花粉发育时期，选取单核靠边期花药作为外镜下观察花粉发育时期，选取单核靠边期花药作为外镜下观察花粉发育时期，选取单核靠边期花药作为外镜下观察花粉发育时期，选取单核靠边期花药作为外植体将花蕾流水冲洗植体将花蕾流水冲洗植体将花蕾流水冲洗植体将花蕾流水冲洗15 min15 min，7070酒精表面消毒酒精表面消毒酒精表面消毒酒精表面消毒30S30S，再用，再用，再用，再用0 01 1HgCl2HgCl2

65、滴加滴加滴加滴加1 12 2滴吐温消毒滴吐温消毒滴吐温消毒滴吐温消毒8min8min后后后后接种在培养基上接种在培养基上接种在培养基上接种在培养基上 培养基培养基培养基培养基:MS+2mg/L NAA+1 mg/L 2:MS+2mg/L NAA+1 mg/L 2，4-D+0.5mg/L 4-D+0.5mg/L KT+30g/LKT+30g/L蔗糖蔗糖蔗糖蔗糖+4.6g/L+4.6g/L卡拉胶卡拉胶卡拉胶卡拉胶12试验方法781 12 22 2接种不同基因型花药接种不同基因型花药接种不同基因型花药接种不同基因型花药 将供试的凉薯将供试的凉薯将供试的凉薯将供试的凉薯9797、鄂马铃薯、鄂马铃薯、鄂

66、马铃薯、鄂马铃薯5 5号、康号、康号、康号、康93229322、$21$21、769276769276等等等等2020种不同基因型材料的花药接种在培种不同基因型材料的花药接种在培种不同基因型材料的花药接种在培种不同基因型材料的花药接种在培养基上，每个三角瓶接种养基上，每个三角瓶接种养基上，每个三角瓶接种养基上，每个三角瓶接种20203030个花药接种后个花药接种后个花药接种后个花药接种后的材料在温度的材料在温度的材料在温度的材料在温度22222424，白天用日光灯补充光照，白天用日光灯补充光照，白天用日光灯补充光照，白天用日光灯补充光照10h10h的条件下培养，的条件下培养，的条件下培养，的条件下培养，30d30d后统计诱导率后统计诱导率后统计诱导率后统计诱导率花药诱导率花药诱导率花药诱导率花药诱导率=(=(愈伤组织数愈伤组织数愈伤组织数愈伤组织数+胚状体数胚状体数胚状体数胚状体数)接种花药接种花药接种花药接种花药数数数数100100122接种不同基因型花药791 12 23 3花药不同预处理花药不同预处理花药不同预处理花药不同预处理 (1)(1)花药低温预处理花药低温预处理花药低温预