DNA的复制和修复课件

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1、 第第3 34 4章章 DNADNA的复制和修复的复制和修复 （DNA Replication and Repair）内内容容 DNA的复制的复制DNA的的损伤和修复和修复DNA的突的突变 第第34章章 DNA的复制和修复内的复制和修复内 容容 DNA是是生生物物遗传的的主主要要物物质基基础，生生物物机机体体的的遗传信信息息以以密密码的的形形式式编码在在DNA分分子子上上，表表现为特特定定的的核核苷苷酸酸排排列列顺序序，并并通通过DNA的的复复制制由由亲代代传递给子子代代。1953年年Watson&Crick提提出出DNA双双螺螺旋旋结构构模模型型后后，1958年年，Crick提提出出了了“中

2、中心心法法则”(Central dogma)揭揭示了示了遗传信息的信息的传递规律。律。蛋白蛋白质逆逆转录翻翻译转录复制复制复制复制DNARNA DNA是生物是生物遗传遗传的主要物的主要物质质基基础础，生物机体的，生物机体的第一第一节 DNA的复制的复制 DNA的复制：是指以原来的复制：是指以原来DNA分子分子为模板合成模板合成出相同分子的出相同分子的过程。程。一、一、DNA的半保留复制的半保留复制DNA在复制在复制时，两条，两条链解开分解开分别作作为模板，在模板，在DNA聚合聚合酶的催化下按碱基互的催化下按碱基互补的原的原则合成两条与模板合成两条与模板链互互补的的新新链，以，以组成新的成新的D

3、NA分子。分子。这样新形成的两个新形成的两个DNA分子与分子与亲代代DNA分子的碱基分子的碱基顺序完全一序完全一样。由于子代。由于子代DNA分子中一分子中一条条链来自来自亲代，另一条代，另一条链是新合成的，是新合成的，这种复制方式称种复制方式称为半保半保留复制留复制(semi conservative replication)。第一第一节节 DNA的复制的复制 DNA的复制：是指以原来的复制：是指以原来DNA分分Parental StrandsStrand duplication1/2 old1/2 newStrand separationParental StrandsStrand 1/2

4、old半保留复制的半保留复制的实验证明明 1958年年Meselson和和Stahl的的实验首次有力地首次有力地支持了半保留复制方式。支持了半保留复制方式。实验步步骤：.大大肠杆菌放在杆菌放在15NH4C1培养基中生培养基中生长12代。代。.再将再将细菌移到只含有菌移到只含有14NH4C1的培养基中的培养基中 培养。培养。.裂解裂解细胞。胞。.将裂解液放在将裂解液放在CsC1溶液中溶液中进行密度梯度离行密度梯度离心。心。.在紫外光下可以看到形成的区在紫外光下可以看到形成的区带。半保留复制的半保留复制的实验证实验证明明 1958年年Meselson和和StDNA的复制和修复的复制和修复课课件件二

5、二、DNA复制的起点和方式复制的起点和方式v复制子复制子:DNA复制从起点开始直到复制从起点开始直到终点点为止，止，每一个每一个这样的的DNA单位称位称为复制子或复制复制子或复制单元元(replicon)。v复制起点复制起点:DNA复制在生物复制在生物细胞中要从胞中要从DNA分分子上特定位置开始。子上特定位置开始。这个特定的位置就称个特定的位置就称为复制复制起点起点(Origin of replication)，用，用ori表示。表示。v复制叉复制叉:DNA复制的生复制的生长点形状如同分叉故称点形状如同分叉故称为复制叉复制叉(replication fork)。二二、DNA复制的起点和方式复制

6、子复制的起点和方式复制子:DNA复制从起点开始直复制从起点开始直原原核核生生物物的的染染色色体体和和质粒粒，真真核核生生物物的的细胞胞器器DNA都都是是环状状双双链分分子子。实验表表明明，它它们都都在在一一个个固固定定的的起起点点开开始始复复制制，复复制制叉叉移移动方方向向大大多多是是双双向向的的，即即形形成成两两个个复复制制叉叉或或生生长点点，分分别向向两两侧进行复制；行复制；也有的是也有的是单向的，只形成一个复制叉或生向的，只形成一个复制叉或生长点点DNA的双向和单向复制的双向和单向复制复制叉复制叉起始点起始点起始点起始点起始点起始点复制叉复制叉复制叉复制叉未复制未复制DNA单向复制单向复

7、制双向复制双向复制环状环状 DNA复制时所复制时所形成的形成的q q结构结构起始点起始点复制叉的推进复制叉的推进原核生物的染色体和原核生物的染色体和质质粒，真核生物的粒，真核生物的细细胞器胞器DNA都是都是环环状双状双链链分分 用用遗传学和学和生物化学的方法生物化学的方法可以确定大可以确定大肠杆杆菌染色体菌染色体DNA的的复制起点在基因复制起点在基因图谱上的位置。上的位置。起点起点oriCoriCilvthr0/180Lacattl l255075malAcysCtryAhistrpTre终点终点大肠杆菌复制起点和终大肠杆菌复制起点和终点在基因图谱上的位置点在基因图谱上的位置83 min33

8、min 用用遗传遗传学和生物化学的方法可以确定大学和生物化学的方法可以确定大肠肠杆菌染色体杆菌染色体DNAEvidence points to bidirectional replicationLabel at both replication forksEvidence points to bidirectionDNA复制的不同方式复制的不同方式 A.A.直线双向直线双向B.B.多起点双向多起点双向C.C.型双向型双向D.D.型单向型单向 E.E.滚动环滚动环F.F.环环A.直线双向直线双向DNA复制的不同方式复制的不同方式 A.直直线线双向双向B.多起点双多起点双三、三、DNA聚合反聚合反

9、应有关的有关的酶酶反应式反应式：n1dATP DNA polE dAMP n2dGTP +DNA dGMP n3dCTP Mg2+dCMP n4dTTP dTMP DNA 1DNA的聚合反的聚合反应和聚合和聚合酶1956年，年，Kornberg在大在大肠杆菌提取液中杆菌提取液中发现DNA聚合聚合酶，以后，以后陆续在不同生物中找到。在不同生物中找到。+(n1+n2+n3+n4)PPi三、三、DNA聚合反聚合反应应有关的有关的酶酶反反应应式：式：DNA 1DNA的聚合反的聚合反DNA聚合聚合酶的反的反应特点：特点：以四种脱氧核苷酸三磷酸以四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)为底物底物;反反应需要模板的

10、指需要模板的指导;反反应需要有引物需要有引物3-OH存在存在;DNA链的生的生长方向是方向是53产物物DNA的性的性质与模板相同与模板相同。DNA聚合聚合酶酶的反的反应应特点：特点：DNA聚合酶催化的链延长反应聚合酶催化的链延长反应35533553DNA聚合聚合酶酶催化的催化的链链延延长长反反应应35533553由由DNA聚合酶催化的聚合酶催化的DNA合成反应合成反应ABCD 模板模板-引物引物 产物产物由由DNA聚合聚合酶酶催化的催化的DNA合成反合成反应应A 模板模板-引物引物 2.大大肠杆菌杆菌DNA聚合聚合酶大大肠杆菌共有杆菌共有5种不同的种不同的DNA聚合聚合酶：DNA聚合聚合酶，I

11、I，III，IV，V。2.大大肠肠杆菌杆菌DNA聚合聚合酶酶大大肠肠杆菌共有杆菌共有5种不同的种不同的DNA聚合聚合酶酶：DNADNA聚合酶聚合酶(DNA polymerase,DNA pol)(DNA polymerase,DNA pol)理化性质：理化性质：纯化的化的DNA pol由一条多由一条多肽链组成，多成，多肽链中中含有一个含有一个锌原子。原子。酶分子空分子空间结构近似球体。构近似球体。DNA pol约含含1000个氨基酸残基，个氨基酸残基，MW为103 kD。经蛋白蛋白酶处理后，理后，酶分子分裂成两个片段：大片分子分裂成两个片段：大片段（段（Klenow片段）有聚合片段）有聚合酶和

12、和35外切外切酶活性，小片段活性，小片段有有53外切外切酶活性。活性。53外切酶活性外切酶活性35外切酶活性外切酶活性聚合酶聚合酶NCKlenow片段片段(MW68 kD)小片段小片段(MW35 kD)蛋白酶蛋白酶DNA聚合聚合酶酶(DNA polymerase,DNA poDNA的复制和修复的复制和修复课课件件功能：功能：聚合功能聚合功能:通通过核苷酸聚合反核苷酸聚合反应使使DNA链沿沿53方向方向延延长。在引物。在引物DNA或或RNA-OH末端，以末端，以dNTP为底物，按模板底物，按模板DNA上的指令由上的指令由DNApol逐个将核苷酸加上去，就是逐个将核苷酸加上去，就是DNA pol的

13、聚合作用。的聚合作用。酶的的专一性主要表一性主要表现为新新进入的脱氧核苷酸必入的脱氧核苷酸必须与模板与模板DNA配配对时才有催化作用。才有催化作用。功能：功能：3535外切酶活性外切酶活性校对作用校对作用:这种酶活性的主要功能是从这种酶活性的主要功能是从3535方向方向识别和切除不配对的识别和切除不配对的DNADNA生长链末端的核生长链末端的核苷酸（对单链作用）。苷酸（对单链作用）。35外切外切酶酶活性活性校校对对作用作用:5353外切酶活性就是从外切酶活性就是从5353方向水解方向水解DNADNA生长链前方的生长链前方的DNADNA链，主要产生链，主要产生5-5-脱氧核苷脱氧核苷酸。酸。这种

14、酶活性只对这种酶活性只对DNADNA上配对部分上配对部分(双链双链)磷酸二磷酸二酯键有切割活力作用，方向是酯键有切割活力作用，方向是53 53。每次。每次能切除能切除1010个核苷酸。个核苷酸。这种酶活性在这种酶活性在DNADNA损伤的修复中可能起着重要损伤的修复中可能起着重要作用（切除由紫外线照射而形成的嘧啶二聚作用（切除由紫外线照射而形成的嘧啶二聚体）。对冈崎片段体）。对冈崎片段55末端末端RNARNA引物的去除依赖引物的去除依赖此种外切酶活性。此种外切酶活性。5353外切酶活性外切酶活性切除修复作用切除修复作用:53外切外切酶酶活性就是从活性就是从53方向水解方向水解DNA生生长链长链前

15、方前方焦磷酸解作用焦磷酸解作用:DNApol:DNApol的这种活性可的这种活性可以催化以催化33末端焦磷酸解末端焦磷酸解DNADNA分子。分子。焦磷酸交换作用焦磷酸交换作用:催化催化dNTPdNTP末端的末端的PPiPPi同无机焦磷酸的交换反应。同无机焦磷酸的交换反应。这两种作用，都要求有较高浓度的这两种作用，都要求有较高浓度的PPiPPi，因此，在体内由于没有足够高的因此，在体内由于没有足够高的PPiPPi而无而无重要意义。重要意义。焦磷酸解作用焦磷酸解作用:DNApol的的这这种活性可以催化种活性可以催化3末端焦磷末端焦磷 DNADNA聚合酶聚合酶 （DNA polII)DNA polI

16、I)DNADNA聚合酶聚合酶缺陷的突变株仍能生存，这缺陷的突变株仍能生存，这表明表明DNA polDNA pol不是不是DNADNA复制的主要聚合酶。复制的主要聚合酶。19701970年发现了年发现了DNApolDNApol。此酶为多亚基，。此酶为多亚基，MW 88KDMW 88KD，每个细胞内约有，每个细胞内约有100100个酶分子。个酶分子。DNA聚合聚合酶酶（DNA polII)DNA聚合聚合酶酶缺陷缺陷催化特性催化特性：5 533聚合酶活力聚合酶活力:该酶催化该酶催化DNADNA的的聚合，但是对模板有特殊的要求。该酶的最聚合，但是对模板有特殊的要求。该酶的最适模板是双链适模板是双链DN

17、ADNA而中间有缺口而中间有缺口(gap)(gap)的单链的单链DNADNA部份，而且该单链空隙部份部份，而且该单链空隙部份不长于不长于100100个个核苷酸核苷酸。3535外切酶活性，但无外切酶活性，但无5353外切酶活外切酶活性。性。该酶不是复制的主要聚合酶，因为此酶该酶不是复制的主要聚合酶，因为此酶缺陷的大肠杆菌突变株的缺陷的大肠杆菌突变株的DNADNA复制都正常。复制都正常。催化特性：催化特性：DNADNA聚合酶聚合酶组成组成 ：DNA pol DNA pol 全酶是由多种亚基组成全酶是由多种亚基组成的蛋白质，而且容易分解。现在认为它是的蛋白质，而且容易分解。现在认为它是大肠杆菌细胞内

18、真正负责重新合成大肠杆菌细胞内真正负责重新合成DNADNA的复的复制酶。制酶。DNA聚合聚合酶酶组建作用组建作用DNA-dependent ATPaseDNA-dependent ATPase组组建作用建作用DNA-dependent ATPaseDNADNA聚合酶聚合酶 两个两个 亚基夹住亚基夹住DNADNADNADNA聚合酶聚合酶异二聚体异二聚体DNA聚合聚合酶酶 两个两个亚亚基基夹夹住住DNADNA聚合聚合酶酶异二聚体异二聚体DNA Polymerase III holoenzyme CoreCore clampst t2 2t t subunits hold2 cores in a d

19、imer complex(clamp loader)ReplicationForkLeading Strand synthesisLagging Strand synthesisDNA Polymerase III holoenzyme 功能功能A A聚合聚合:以模板作指导，以四种脱氧核糖核苷酸作为以模板作指导，以四种脱氧核糖核苷酸作为底物，并且需要有底物，并且需要有33 的引物链存在，的引物链存在，通过核苷酸聚合反应使通过核苷酸聚合反应使DNADNA链沿链沿5 533方向方向延长。延长。催化脱氧核苷酸掺入催化脱氧核苷酸掺入DNADNA链的速率分别是链的速率分别是DNADNA聚合酶聚合酶和和I

20、 I的的1515倍和倍和3030倍。倍。B B 3535外切酶活性外切酶活性功能功能大肠杆菌三种大肠杆菌三种DNADNA聚合酶比较聚合酶比较DNA聚合酶聚合酶分子量分子量每个细胞的分子统计数每个细胞的分子统计数5-3 聚合酶作用聚合酶作用3-5 核酸外切酶作用核酸外切酶作用5-3 核酸外切酶作用核酸外切酶作用合成速度（核苷酸合成速度（核苷酸/分）分）持续合成能力持续合成能力DNA聚合酶聚合酶103,000400+1,000-1,2003-20088,000100+-2,4001,500830,00010-20+-15,000-60,000500,000比较项目比较项目DNA聚合酶聚合酶III切

21、除引物切除引物修复修复修复修复复制复制功能功能大大肠肠杆菌三种杆菌三种DNA聚合聚合酶酶比比较较DNA分子量分子量DNA103,000聚合酶聚合酶IV IV 和和V:V:20192019年发现年发现,它们涉及它们涉及DNADNA的错误倾向修复的错误倾向修复(error prone repair(error prone repair）聚合聚合酶酶IV 和和V:2019年年发现发现,它它们们涉及涉及DNA的的错误倾错误倾向向DNADNA连接酶是连接酶是19671967年在三个实验室同时发现的。年在三个实验室同时发现的。它是一种封闭它是一种封闭DNADNA链上切口酶，借助链上切口酶，借助ATPATP

22、或或NADNAD水解水解提供的能量催化提供的能量催化DNADNA链的链的5 5-PO-PO4 4与另一与另一DNADNA链的链的3-3-OHOH生成磷酸二酯键。生成磷酸二酯键。这两条链必须是与同一条互补链配对结合的这两条链必须是与同一条互补链配对结合的(T4(T4 DNADNA连接酶除外连接酶除外)，而且必须是两条紧邻，而且必须是两条紧邻DNADNA链才能链才能被被DNADNA连接酶催化成磷酸二酯键。连接酶催化成磷酸二酯键。DNADNA连接酶的主要功能就是在连接酶的主要功能就是在DNADNA聚合酶聚合酶催化催化聚合，填满双链聚合，填满双链DNADNA上的单链间隙后封闭上的单链间隙后封闭DNAD

23、NA双链上双链上的切口。这在的切口。这在DNADNA复制、修复和重组中起着重要的复制、修复和重组中起着重要的作用。作用。3.DNA3.DNA连接酶连接酶(DNA ligase)(DNA ligase)DNA连连接接酶酶是是1967年在三个年在三个实验实验室同室同时发现时发现的。它是一种封的。它是一种封闭闭连连接接酶酶连连接接切切口口Mg2+连接酶连接酶ATP或或NADAMP+PPi或或NMN+AMPATCGPTTPPPA A CCTGAPACPPPPOHTGGATCGPTTPPPA A CCTGAPACPPPTGGP切口33555533模板链模板链模板链模板链连连接接酶酶连连接切口接切口Mg2

24、+连连接接酶酶ATP或或NADAMP+PPi或或DNADNA的一条链的复制是半不连续的的一条链的复制是半不连续的四、四、DNADNA的半不连续复制的半不连续复制冈崎片段：冈崎片段：19681968年，冈崎等用年，冈崎等用3 3H H脱氧胸苷标记脱氧胸苷标记T4T4噬菌体感染的大肠杆菌，然后通过碱性密度梯噬菌体感染的大肠杆菌，然后通过碱性密度梯度离心法分离标记的度离心法分离标记的DNADNA产物，发现短时间内首产物，发现短时间内首先合成的是较短的先合成的是较短的DNADNA片段，接着出现较大的分片段，接着出现较大的分子。最初出现的子。最初出现的DNADNA片段长度约为片段长度约为10001000

25、个核苷酸个核苷酸左右，称为冈崎片段（左右，称为冈崎片段（Okzaki fragmentOkzaki fragment）。）。DNA的一条的一条链链的复制是半不的复制是半不连续连续的四、的四、DNA的半不的半不连续连续复制复制复制叉的复制叉的移动方向移动方向解旋酶解旋酶DNA聚聚合酶合酶III解链酶解链酶RNA引物引物引物体引物体DNA聚聚合酶合酶ISSB335前导链前导链滞后链滞后链35复制的复制的起始起始DNADNA链的链的延长延长DNADNA链链终止终止5RNA引物引物33复制叉的移复制叉的移动动方向解旋方向解旋酶酶DNA聚合聚合酶酶III解解链链酶酶RNA引物引物引物引物 RNA引物的合

26、成：引物的合成：以以DNA为模板，为模板，NTP为原料，在引物合成酶催化下，合成为原料，在引物合成酶催化下，合成10-几十个核苷酸。几十个核苷酸。为什么？为什么？这是保证这是保证DNADNA聚合过程高度精确的又一措施。已知聚合过程高度精确的又一措施。已知DNA DNA 聚合聚合酶具有酶具有3 35 5 外切酶功能校对复制过程中的核苷酸外切酶功能校对复制过程中的核苷酸，也就，也就是说聚合酶在开始形成一个新的磷酸二酯键前，总是检查前是说聚合酶在开始形成一个新的磷酸二酯键前，总是检查前一个碱基是否正确，它不能从头开始合成。因此先合成一条一个碱基是否正确，它不能从头开始合成。因此先合成一条低忠实性的多

27、核苷酸来开始低忠实性的多核苷酸来开始DNADNA的合成，并以核糖核苷酸来表的合成，并以核糖核苷酸来表示是示是“暂时暂时”的，当的，当DNADNA聚合以后再将其切除，以高忠实性的聚合以后再将其切除，以高忠实性的脱氧核苷酸取而代之，确保复制的忠实性。脱氧核苷酸取而代之，确保复制的忠实性。RNA引物的合成：引物的合成：以以DNA为为模板，模板，NTP为为原料，在引原料，在引 核酸的拓扑结构是指核酸分子的空间结构。核酸的拓扑结构是指核酸分子的空间结构。两条互相缠绕的双螺旋核酸分子表现出许多拓扑两条互相缠绕的双螺旋核酸分子表现出许多拓扑学的关系。在学的关系。在DNADNA的复制、重组、转录和组装等的复制

28、、重组、转录和组装等过程中无不牵涉到其拓扑结构的转变。过程中无不牵涉到其拓扑结构的转变。拓扑异构酶（拓扑异构酶（topoisomerase)topoisomerase)：DNADNA在复制过程在复制过程中双链需要解开。能引起中双链需要解开。能引起DNADNA拓扑异构反应的酶拓扑异构反应的酶为拓扑异构酶。为拓扑异构酶。DNADNA拓扑酶催化同一拓扑酶催化同一DNADNA分子不同分子不同超螺旋状态之间的转变。超螺旋状态之间的转变。五、复制中的拓扑学问题五、复制中的拓扑学问题 核酸的拓扑核酸的拓扑结结构是指核酸分子的空构是指核酸分子的空间结间结构。两条互相构。两条互相缠绕缠绕的的DNADNA拓扑异构

29、酶有两类：拓扑异构酶有两类：类型类型的酶的酶拓扑异构酶拓扑异构酶，能使，能使DNADNA的一的一条链发生断裂和再连接，反应无需供给能量，条链发生断裂和再连接，反应无需供给能量，可减少负超螺旋。可减少负超螺旋。类型类型的酶的酶拓扑异构酶拓扑异构酶（旋转酶），能（旋转酶），能使使DNADNA的两条链同时发生断裂和再连接，当它的两条链同时发生断裂和再连接，当它引入超螺旋时需要由引入超螺旋时需要由ATPATP供给能量，可引入负供给能量，可引入负超螺旋，超螺旋，它们协同作用控制着它们协同作用控制着DNADNA的负超螺旋水平。的负超螺旋水平。DNA拓扑异构拓扑异构酶酶有两有两类类：原核细胞拓扑构酶原核细胞

30、拓扑构酶的作用机制：的作用机制：酶与酶与DNADNA结合使双链解旋结合使双链解旋;使一条链切开，但酶与切口的两端结合阻止了螺旋的使一条链切开，但酶与切口的两端结合阻止了螺旋的旋转旋转;酶使另一条链经过切口，然后再将两断端连接起来酶使另一条链经过切口，然后再将两断端连接起来;酶从酶从DNADNA上脱落，两条链复原，得到的上脱落，两条链复原，得到的DNADNA比原来少一比原来少一个负性超螺旋。个负性超螺旋。拓扑构酶拓扑构酶II的作用机制：的作用机制：该酶能暂时性地切断和重新连接双链该酶能暂时性地切断和重新连接双链DNADNA，引入负超，引入负超螺旋，可以消除复制叉前进时带来的扭曲张力，从而螺旋，可

31、以消除复制叉前进时带来的扭曲张力，从而促进双链的解开。促进双链的解开。原核原核细细胞拓扑构胞拓扑构酶酶的作用机制：的作用机制：真核生物拓扑构酶真核生物拓扑构酶 拓扑构酶拓扑构酶I：消除正、负超螺旋：消除正、负超螺旋类型类型I 拓扑构酶拓扑构酶III：消除负超螺旋：消除负超螺旋 拓扑构酶拓扑构酶II：消除正、负超螺旋，不能引：消除正、负超螺旋，不能引类型类型II 拓扑构酶拓扑构酶II：消除正、负超螺旋：消除正、负超螺旋入负超螺旋入负超螺旋不能引入负超螺旋不能引入负超螺旋真核生物拓扑构真核生物拓扑构酶酶 拓扑构拓扑构酶酶IIa：消除：消除大肠杆菌旋转酶（大肠杆菌旋转酶（gyrase)又称为拓扑构酶

32、又称为拓扑构酶II，反应需，反应需ATP提供能量，提供能量，可连续引入负超螺旋，可消除复制叉前进时可连续引入负超螺旋，可消除复制叉前进时产生的扭曲张力。产生的扭曲张力。大大肠肠杆菌旋杆菌旋转转酶酶（gyrase)将将DNADNA两条链解开，有赖于两条链解开，有赖于DNADNA解螺旋酶，这类酶通过解螺旋酶，这类酶通过水解水解ATPATP获得能量来解开双链，分解获得能量来解开双链，分解ATPATP的活力要有单的活力要有单链链DNADNA的存在。的存在。如双链如双链DNADNA中有单链末端或缺口，解螺旋酶即可结合中有单链末端或缺口，解螺旋酶即可结合于单链部分，然后向双链方向移动。于单链部分，然后向双

33、链方向移动。大肠杆菌解螺旋酶大肠杆菌解螺旋酶、和和可以沿模板链的可以沿模板链的5 533方向随着复制叉的前进而移动，而方向随着复制叉的前进而移动，而reprep蛋白则蛋白则在另一条模板链上沿在另一条模板链上沿3 355方向移动。这两种解螺方向移动。这两种解螺旋酶的配合作用推动着旋酶的配合作用推动着DNADNA双链的解开。双链的解开。单链结合蛋白单链结合蛋白(SSB)(SSB)：可阻止复性和保护解开的单链。：可阻止复性和保护解开的单链。DNADNA解螺旋酶解螺旋酶(DnaB)(DnaB)将将DNA两条两条链链解开，有解开，有赖赖于于DNA解螺旋解螺旋酶酶，这类这类酶酶通通过过水解水解AT六、六、

34、DNADNA复制的过程复制的过程分三个阶段：分三个阶段：起始起始延伸延伸终止终止大肠杆菌大肠杆菌复制起点成串排列的重复序列复制起点成串排列的重复序列GATCTNTTNTTT成串排列的成串排列的三个三个13bp序列序列共有序列共有序列共有序列共有序列TTATCCACA DnaA蛋白结合位点蛋白结合位点四个四个9bp序列序列1.1.复制的起始复制的起始六、六、DNA复制的复制的过过程分三个程分三个阶阶段：大段：大肠肠杆菌复制起点成串排列的重杆菌复制起点成串排列的重DnaB(解螺旋酶解螺旋酶)SSBDnaA大肠杆菌大肠杆菌DNA复制起点在起始阶段的结构模型复制起点在起始阶段的结构模型（20-40）起

35、始复合物起始复合物DnaBSSBDnaA大大肠肠杆菌杆菌DNA复制起点在起始复制起点在起始阶阶段的段的结结构构大肠杆菌结合在复制起点的蛋白质大肠杆菌结合在复制起点的蛋白质大大肠肠杆菌杆菌结结合在复制起点的蛋白合在复制起点的蛋白质质DNA复制的复制的调节lDNA复制的复制的调节的的调节在起始在起始阶段，一旦段，一旦开始就一直到完开始就一直到完lDNA复制的起始与复制的起始与DNA的甲基化和的甲基化和细菌脂菌脂膜的相互作用有关膜的相互作用有关loriC 位点的回文序列位点的回文序列GATC（11个）的甲个）的甲基化基化l新合成新合成链的甲基化滞后的甲基化滞后13 minDNA复制的复制的调节调节D

36、NA复制的复制的调节调节的的调节调节在起始在起始阶阶段，一旦开始就段，一旦开始就A replisome consists of:DNA gyrase,the priming complex(primosome,helicase,primase,primer),SSB,and DNA polymerase III holoenzyme 2.复制的延伸复制的延伸A replisome consists of:DNA g聚合酶聚合酶III核心酶核心酶聚合酶聚合酶I聚合酶聚合酶III核心酶核心酶滞后链滞后链前导链前导链解螺旋酶解螺旋酶引物合成酶引物合成酶(DnaG)RNA引物引物引发体引发体拓扑异构酶

37、拓扑异构酶II-夹子夹子-聚体聚体-夹子夹子 -复合物复合物RNA引物引物单链结合蛋白单链结合蛋白（SSB）聚合聚合酶酶III核心核心酶酶聚合聚合酶酶I聚合聚合酶酶III核心核心酶酶滞后滞后链链前前导链导链解螺解螺3.复制的复制的终止终止oriC复制叉复制叉2复制叉复制叉1终止复制叉终止复制叉2终止复制叉终止复制叉1复制叉复制叉1复制叉复制叉2完成复制完成复制DNA拓扑异构酶拓扑异构酶IV连锁染色体连锁染色体修复复制修复复制22 bpTusTusterminus utilization substance3.复制的复制的终终止止oriC复制叉复制叉2复制叉复制叉1终终止复制叉止复制叉2终终止复

38、制叉止复制叉七、真核生物七、真核生物DNA的复制的复制复制起点：称作自体复制复制起点：称作自体复制顺序序（autonomously replicating sequence,ARS）或复制基因（）或复制基因（replicator）。）。酵母酵母ARS约有有150个个bp，含有几个保守序列，含有几个保守序列，这表明在真核生物表明在真核生物DNA中有多个复制的起点。中有多个复制的起点。真核生物真核生物DNA的复制的起始的复制的起始还需要一个原点需要一个原点识别复合物（复合物（ORC），受控制真核生物），受控制真核生物细胞胞周期的蛋白周期的蛋白质的的调控。控。1.多个起点复制多个起点复制七、真核生物

39、七、真核生物DNA的复制复制起点：称作自体复制的复制复制起点：称作自体复制顺顺序（序（auto起起点点起起点点起起点点起起点点起起点点起起点点 冈崎片段冈崎片段：100-200个核甘酸个核甘酸起点起点起点起点起点起点起点起点起点起点起点起点 冈冈崎片段崎片段：100-2002.存在复制叉存在复制叉真核生物真核生物DNA复制复制过程中也出程中也出现复制叉，复制叉，而复制叉的移而复制叉的移动速度速度较原核生物慢，原核生物慢，仅为原原核生物的核生物的1/20，（，（约50nt/秒）。秒）。3.DNA聚合聚合酶 真核生物真核生物DNA聚合聚合酶有：有：、e e DNA聚合聚合酶：负责染色体染色体DNA

40、的复制。的复制。该酶大大亚基基负责聚合，小聚合，小亚基基负责引物的合成，引物的合成，由于缺乏由于缺乏3 5的外切活性，可能参与滞后的外切活性，可能参与滞后链RNA引物的合成。引物的合成。DNA聚合聚合酶：负责DNA链的延伸，完成复的延伸，完成复制。制。该酶需要增殖需要增殖细胞核抗原（胞核抗原（PCNA）来）来协助，助，2.存在复制叉存在复制叉 其主要功能其主要功能类似于原核生物似于原核生物DNA聚合聚合酶的的亚基，形成一个基，形成一个环形的形的夹子，增加子，增加DNA聚聚合合酶复制的复制的连续性。性。DNA聚合聚合酶：主要：主要负责核核DNA的修复。的修复。DNA聚合聚合酶：参与：参与冈崎片段

41、的修崎片段的修补。DNA聚合聚合酶：负责线粒体粒体DNA的复制。的复制。其主要功能其主要功能类类似于原核生物似于原核生物DNA聚合聚合酶酶的的亚亚基，形成一个基，形成一个环环哺乳动物的哺乳动物的DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶 (M)亚基数亚基数细胞内分布细胞内分布外切酶活性外切酶活性引物合成酶活性引物合成酶活性持续合成能力持续合成能力抑制剂抑制剂功能功能DNA聚合酶聚合酶 (I)4个个细胞核细胞核无无有有中等中等蚜肠霉素蚜肠霉素引物合成引物合成2个个线粒体线粒体3 -5 外切酶外切酶无无高高双脱氧双脱氧TTP线粒体线粒体DNA合成合成2个个细胞核细胞核3 -5 外切酶外切酶无无有有PCN

42、A时高时高蚜肠霉素蚜肠霉素核核DNA合成合成DNA聚合酶聚合酶 (III)DNA聚合酶聚合酶 (IV)1个个细胞核细胞核无无无无低低双脱氧双脱氧TTP修复修复DNA聚合酶聚合酶 e e(II)1个个细胞核细胞核3 -5 外切酶外切酶无无高高蚜肠霉素蚜肠霉素修复修复哺乳哺乳动动物的物的DNA聚合聚合酶酶DNA亚亚基数基数DNA4个个2个个2个个DNAD细菌和真核生物复制体的组成细菌和真核生物复制体的组成 组成组成 细菌细菌 真核生物真核生物 复制酶复制酶 DNA聚合酶聚合酶III 全酶全酶 DNA聚合酶聚合酶/进行性因子进行性因子 夹子夹子 PCNA 定位因子定位因子 复合物复合物 RFC 引物

43、合成酶引物合成酶 DnaG DNA聚合酶聚合酶 去除引物去除引物 DNA聚合酶聚合酶I和和RNase H RNase H1 和和MF（5 3 外切酶）外切酶）滞后链修复滞后链修复 DNA聚合酶聚合酶I和和 DNA连接酶连接酶 DNA聚合酶聚合酶e e和和 DNA连接酶连接酶I解螺旋酶解螺旋酶 DnaB T抗原抗原消除拓扑张力消除拓扑张力 旋转酶旋转酶 拓扑异构酶拓扑异构酶II抗原抗原单链结合单链结合 SSB RPA细细菌和真核生物复制体的菌和真核生物复制体的组组成成 组组成成 八、端粒酶（八、端粒酶（telomerase）DNA复制复制时，由于受，由于受DNA聚合聚合酶特性限制，特性限制，子代

44、子代DNA链的最后一个引物去除引物后，的最后一个引物去除引物后，无法填无法填补空隙，易造成子代空隙，易造成子代DNA链的的缩短。短。八、端粒八、端粒酶酶（telomerase）DNA复制复制时时，由于受，由于受DNA这一一难题是通是通过端粒端粒（telomere)和和端粒端粒酶(telomerase)的的发现才得到了澄清。才得到了澄清。真核真核线性性DNA的末端形成一种特殊的的末端形成一种特殊的结构并与蛋白构并与蛋白质结合成端粒合成端粒,有有许多成串的重多成串的重复序列，一条复序列，一条链富含富含G，另一条，另一条链富含富含C，如人的端粒如人的端粒为：TTAGGG。端粒端粒酶是一种含是一种含R

45、NA的蛋白复合物，的蛋白复合物，实质上是一种逆上是一种逆转录酶，它能催化互，它能催化互补于于RNA模板的模板的DNA片段的合成，使复制以后的片段的合成，使复制以后的线形形DNA分子的末端保持不分子的末端保持不变。这这一一难题难题是通是通过过端粒（端粒（telomere)和端粒和端粒酶酶(telome53AAAACCCCAAAACCCCCCA端粒酶端粒酶 初步研究表明，人初步研究表明，人体中生殖体中生殖细胞的端粒胞的端粒长度保持不度保持不变，而体，而体细胞的端粒胞的端粒长度度则随随个体的老化而逐步个体的老化而逐步缩短。短。对此的一个推此的一个推论是：人的生殖是：人的生殖细胞具胞具端粒端粒酶的活力

46、，体的活力，体细胞胞则否。否。这一一问题的的解决无疑会有助于解决无疑会有助于对生命衰老的生命衰老的认识。53AAAACCCCAAAACCCCCCA端粒端粒酶酶 端粒合成的一种模型端粒合成的一种模型TTGGGTGGGT35AATTTTG53AAAACCCCAAAACCCCCCAGTTTTG 35TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTG53AAAACCCCAAAACCCCCCAAA移位和移位和再杂交再杂交继续继续延伸延伸35TTTTGGGGTTTTG53AAAACCCCAAAACCCCCCAAA整合和整合和杂交杂交端粒合成的一种模型端粒合成的一种模型TTGGGTGGGT35AA53A第二节第二节

47、 DNADNA的损伤与修复的损伤与修复 DNADNA复制过程中可能发生错配，复制过程中可能发生错配，DNADNA的重组，病毒基的重组，病毒基因的整合，常常会破坏局部因的整合，常常会破坏局部DNADNA的双螺旋结构。某些物理的双螺旋结构。某些物理化学因子，如紫外线、电离辐射和化学诱变剂等，都能化学因子，如紫外线、电离辐射和化学诱变剂等，都能作用于作用于DNA,DNA,造成结构的破坏，引起生物突变，甚至致死造成结构的破坏，引起生物突变，甚至致死的作用，称为的作用，称为DNADNA的损伤。的损伤。细胞对细胞对DNADNA损伤的修复主要有损伤的修复主要有以下以下5 5种类型种类型:错配修复错配修复(m

48、ismatch repair)(mismatch repair)直接修复直接修复(direct repair)(direct repair)切除修复切除修复(excision repair)(excision repair)重组修复重组修复(recombination repair)(recombination repair)易错修复易错修复(error-prone repair)(error-prone repair)第二第二节节 DNA的的损伤损伤与修复与修复 DNA复制复制过过程中可程中可 一错配修复一错配修复错配修复依配修复依赖模板模板链提供的信息。提供的信息。因此，生物体必因此，生物

49、体必须有一个区分模板有一个区分模板链和新和新合成合成链的机制，的机制，细胞往往采用甲基化的方胞往往采用甲基化的方式来式来为模板模板链加上加上标签。甲基化位置在。甲基化位置在GATC序列的序列的A上。上。一一错错配修复配修复Mut基因产物参与错配修复基因产物参与错配修复53ExoVII or RecJExoVII or RecJMut基因基因产产物参与物参与错错配修复配修复53ExoVII or Re1、形成嘧啶二聚体、形成嘧啶二聚体2、光复活酶结合于、光复活酶结合于损伤部位损伤部位3、酶被可见光激活、酶被可见光激活4、修复后酶被释放、修复后酶被释放二、直接修复二、直接修复1、形成、形成嘧啶嘧啶

50、二聚体二聚体2、光复活、光复活酶酶结结合于合于3、酶酶被可被可见见光激活光激活4、修、修三、切除修复三、切除修复碱基缺陷或错配碱基缺陷或错配结构缺陷结构缺陷切开切开 核酸内切酶核酸内切酶核酸外切酶核酸外切酶切除切除DNA聚合酶聚合酶DNA连接连接酶酶AP核酸内切酶核酸内切酶切开切开切除切除修复修复连接连接N-糖苷酶糖苷酶(UvrABC)三、切除修复碱基缺陷或三、切除修复碱基缺陷或错错配配结结构缺陷切开核酸内切构缺陷切开核酸内切酶酶核酸外切核酸外切酶酶切切四、重组修复四、重组修复重组重组复制复制修复修复四、重四、重组组修复重修复重组组复制修复复制修复五、应急反应（五、应急反应（SOS）和易错修复

51、）和易错修复许多造成多造成DNA损伤或抑制修复的或抑制修复的处理均能理均能引起一系列复引起一系列复杂的的诱导反反应，称，称为应急反急反应（SOS response)。SOS反反应包括：包括：DNA损伤或抑制修复或抑制修复 诱变效用效用 细胞分裂抑制等胞分裂抑制等五、五、应应急反急反应应（SOS）和易）和易错错修复修复许许多造成多造成DNA损伤损伤或抑制修或抑制修SOS诱导的修复反的修复反应包括：包括：避免避免错误的修复（的修复（error free repair)易易错修复修复(error-prone repair)SOS诱导诱导的修复反的修复反应应包括：包括：未诱导的细胞未诱导的细胞靶基因靶

52、基因lexA基因被基因被LexA 蛋白质部分阻遏蛋白质部分阻遏recA基因被基因被LexA 蛋白质部分阻遏蛋白质部分阻遏（40个不同的位点被阻遏）个不同的位点被阻遏）LexA(阻遏物阻遏物)RecA(辅蛋白酶辅蛋白酶)靶基因表达靶基因表达uvrABC 等）等）lexA靶基因表达靶基因表达 但产物被分解但产物被分解recA大量表达大量表达RecA促使促使分解分解LexA诱导的细胞诱导的细胞单链单链DNAATP未未诱导诱导的的细细胞靶基因胞靶基因lexA基因被基因被LexArecA基因被基因被Lex六、与六、与DNA修复修复有有关关的人的人类遗传类遗传疾病疾病1.1.着着色性色性干干皮病皮病是一种

53、是一种隐性性遗传性疾病，有些呈性性疾病，有些呈性联遗传。因核酸内切。因核酸内切酶（与切除修复有关的（与切除修复有关的酶）异常造成异常造成DNA修复障碍所致。修复障碍所致。临床以光暴床以光暴露部位色素增加和角化及癌露部位色素增加和角化及癌变为特征。特征。幼年幼年发病，常有家族病，常有家族发病史。病史。多数患者于多数患者于20岁前因前因恶性性肿瘤而死亡。瘤而死亡。六、与六、与DNA修复有关的人修复有关的人类遗传类遗传疾病着色性干皮病疾病着色性干皮病 是一种是一种DNA的复制和修复的复制和修复课课件件2.2.遗传遗传性大性大肠肠癌癌、结肠癌的临床特征、结肠癌的临床特征错配修复相关基因的错配修复相关基

54、因的改变改变 :MSH2,MSH6,PMS1 MSH2,MSH6,PMS1，MLH1,MSH3,PMS2.MLH1,MSH3,PMS2.2.遗传遗传性大性大肠肠癌、癌、结肠结肠癌的癌的临临床特征床特征错错配修复相关基因的改配修复相关基因的改变变 3.3.与重组修复相关基因的改变与重组修复相关基因的改变 Brca 1Brca 1、Brca Brca 2 80%80%几率患乳腺癌几率患乳腺癌3.与重与重组组修复相关基因的改修复相关基因的改变变 Brca 1、第三节第三节 DNADNA的突变的突变 DNADNA分子中的核苷酸序列发生突然而稳定的改变，从而导致分子中的核苷酸序列发生突然而稳定的改变，从

55、而导致DNADNA的复制以及后来的转录和翻译产物随之发生变化，表现出的复制以及后来的转录和翻译产物随之发生变化，表现出异常的遗传特性，称为异常的遗传特性，称为DNADNA的突变。它包括由于的突变。它包括由于DNADNA损伤和错配损伤和错配得不到修复而引起的突变，以及由于不同得不到修复而引起的突变，以及由于不同DNADNA分子之间的交换分子之间的交换而引起的遗传重组。而引起的遗传重组。一、突变的类型一、突变的类型碱基对的置换碱基对的置换(substitution)(substitution)移码突变移码突变(frameshift mutation)(frameshift mutation)第三第

56、三节节 DNA的突的突变变 DNA分子中的核苷酸序分子中的核苷酸序碱基替碱基替换：一个碱基一个碱基对被另一碱基被另一碱基对替替换。包括包括:转换(transtion)颠换(transversion)。移移码突突变：增加或减少一个或几个碱基增加或减少一个或几个碱基对。碱基替碱基替换换：一个碱基：一个碱基对对被另一碱基被另一碱基对对替替换换。移。移码码突突变变：增加或减少一：增加或减少一 DNADNA突变突变的类型的类型-T-C-G-C-C-T-G-T-A-C-G-A-G-C-G-G-A-C-A-T-G-C-转换转换野生型基因野生型基因-T-C-G-A-C-T-G-T-A-C-G-A-G-C-T-

57、G-A-C-A-T-G-C-T-C-G-G-C-T-G-T-A-C-G-A-G-C-C-G-A-C-A-T-G-C-颠换颠换碱基对的置换碱基对的置换(substitution)移码突变移码突变(frameshift mutation)-T-C-G-C-A-C-T-G-T-A-C-G-A-G-C-G-T-G-A-C-A-T-G-C-插入插入-T-C-G-C-T-G-T-A-C-G-A-G-C-G-A-C-A-T-G-C-缺失缺失TA DNA突突变变的的类类型型-T-C-G-C-C-T-G-T-A-二、诱变剂的作用二、诱变剂的作用 碱基类似物碱基类似物(base analog)base analo

58、g)碱基修饰剂碱基修饰剂(base modifier)base modifier)嵌入染料嵌入染料(intercalation dye)intercalation dye)紫外线紫外线(ultraviolet)ultraviolet)和电离辐射和电离辐射 (ionizing radiation)ionizing radiation)DNA的复制和修复的复制和修复课课件件酮式酮式BU-ABU-A烯醇式烯醇式BU-GBU-G5-5-溴尿嘧啶溴尿嘧啶(5-bromouracil,BU):(5-bromouracil,BU):是胸腺嘧啶的结构类似物。是胸腺嘧啶的结构类似物。1.1.碱基类似物碱基类似物

59、酮酮式式BU-A5-溴尿溴尿嘧啶嘧啶(5-bromouracil,BU)ATATABUGBUATABUGCGCGBUABUABUGCGCAT酮式酮式 烯醇式烯醇式烯醇式烯醇式 酮式酮式ATATABUGBUATABUGCGCGBU2-2-氨基嘌呤氨基嘌呤(2-aminopurine):(2-aminopurine):可取代腺嘌呤与可取代腺嘌呤与T T配对配对亚氨状态时可与胞嘧啶配对亚氨状态时可与胞嘧啶配对ATAPTATATAPCGCAPT2-氨基氨基嘌嘌呤呤(2-aminopurine):ATAPTA2.2.碱基的修饰剂碱基的修饰剂v 亚硝酸亚硝酸(nitrous acid,HNO(nitrou

60、s acid,HNO2 2)：具有氧化脱氨作用。具有氧化脱氨作用。AIHNO2CUHNO2GHNO2X(ok)CGNAUAATATNAICCG发生碱基转换2.碱基的修碱基的修饰剂饰剂 亚亚硝酸硝酸(nitrous acid,HNOv 烷化剂烷化剂 烷化剂是目前应用最广泛而有效的烷化剂是目前应用最广泛而有效的诱变剂。最常用的有甲基磺酸乙酯诱变剂。最常用的有甲基磺酸乙酯(EMS)(EMS)、甲基磺酸甲酯、甲基磺酸甲酯(MMS)(MMS)、亚硝酸胍、亚硝酸胍等。它们都带有一个或多个活泼的烷基，等。它们都带有一个或多个活泼的烷基，这些烷基能够移到其他电子密度较高的这些烷基能够移到其他电子密度较高的分子

61、中去，使碱基许多位置上增加了烷分子中去，使碱基许多位置上增加了烷基，从而多方面改变氢键的结合能力。基，从而多方面改变氢键的结合能力。烷烷化化剂剂 烷烷化化剂剂是目前是目前应应用最广泛而有效的用最广泛而有效的诱变剂诱变剂。最常用的。最常用的 烷化作用主要发生在碱基的烷化作用主要发生在碱基的N N1 1、N N3 3、N N7 7位置上。最容易发生在位置上。最容易发生在G G的的N N7 7位置上，位置上，形成形成7-7-烷基鸟嘌呤。烷基鸟嘌呤。7-7-烷基鸟嘌呤可烷基鸟嘌呤可与胸腺嘧啶配对，从而产生与胸腺嘧啶配对，从而产生GCATGCAT的的转换。转换。烷化作用可使烷化作用可使DNADNA的碱基

62、容易受到的碱基容易受到水解而从水解而从DNADNA上裂解下来，造成碱基上裂解下来，造成碱基的缺失。从而引起碱基的转换与颠换的缺失。从而引起碱基的转换与颠换及移码突变。及移码突变。烷烷化作用主要化作用主要发发生在碱基的生在碱基的N1、N3、N7位置上。最容易位置上。最容易发发3.3.嵌入染料嵌入染料 包括原黄素包括原黄素(proflavin)(proflavin)、吖啶橙、吖啶橙（acridine orangeacridine orange）、溴乙啶）、溴乙啶（EtBrEtBr）等。它们通过插入到）等。它们通过插入到DNADNA双螺双螺旋双链或单链的两个相邻的碱基之间，旋双链或单链的两个相邻的碱

63、基之间，起到插入诱变的作用，这种突变往往是起到插入诱变的作用，这种突变往往是移码突变。移码突变。3.嵌入染料嵌入染料 包括原黄素包括原黄素(proflavin)、吖啶吖啶橙（橙（aTACGA ATCGGGTATTATGCT TAGCCCATAATACGA ATCGGGTATTATGCT TAGCCCATAACG染料分子嵌入复制插入一个碱基对移码突变TACGA ATCGGGTATTATGCT TAGC4.4.紫外线紫外线(ultraviolet)ultraviolet)和电离辐射和电离辐射 紫外线（紫外线（ultraviolet lightultraviolet light，UVUV）：能使）：能使DNADNA产生两种光生成物产生两种光生成物环丁烷嘧啶光二聚体和环丁烷嘧啶光二聚体和6-46-4光生成物光生成物（嘧啶（嘧啶6 6位碳与相邻嘧啶位碳与相邻嘧啶4 4位碳原子间位碳原子间结合）。结合）。电离辐射作用复杂，可产生电离辐射作用复杂，可产生DNADNA单单双链断裂、碱基迫坏等。双链断裂、碱基迫坏等。4.紫外紫外线线(ultraviolet)和和电电离离辐辐射射 紫外紫外线线（